Name: zebrafish in situ spinal cord preparation for electrophysiological recordings from spinal sensory and motor neurons
Uploaded: 2017-04-18T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Zebrafish In Situ Spinal Cord Preparation for Electrophysiological Recordings from Spinal Sensory and Motor Neurons at JoVE.com

Ce travail a été soutenu par des subventions du NIH (F32 NS059120 à RLM et R01NS25217 et P30NS048154 à ABR).

Toutes les procédures d&#39;animaux ont été approuvées par le Comité de protection des animaux institutionnel et utilisation (IACUC, Bureau du laboratoire des ressources animales, Université du Colorado Anschutz Medical Campus). 1. Zebrafish parachimie <ol><li> Élever et maintenir le poisson zèbre adulte (Danio rerio) à 28,5 ° C sur un 10 h cycle lumière obscurité / 14 h et avec un traitement approprié de l&#39; eau et de l&#39; échange 52. </...

Les méthodes décrites ici permettent la caractérisation électrique et morphologique des neurones sensoriels et moteurs d&#39;embryons de poisson zèbre après dissection minimale de la moelle épinière. Neurones restent en bonne santé pendant au moins 1 h, la limite de temps imposée à ces enregistrements. Neurones ont été enregistrées en utilisant la configuration standard de cellules entières, ainsi que des patches nucléées; ce dernier procédé minimise les problèmes d&#39;espace-clamp qui peut empêche...

<html> George Streisinger pionnier dans l&#39;utilisation de Danio rerio, communément appelé poisson zèbre, en tant que système modèle pour l&#39;analyse génétique du développement des vertébrés 10. Le modèle offre plusieurs avantages, notamment: (1) l&#39;élevage relativement simple et peu coûteux; (2) la fertilisation externe, ce qui permet un accès facile aux embryons dès les premiers stades de développement; et (3) un embryon transparent, ce qui permet des observations directes et répétées de cellules, de tissus et d&#39;organes tels qu&#39;ils forment. Au cours des décennies qui ont suivi, plusieurs avancées ont augmenté encore la puissance du modèle de poisson zèbre. En particulier, les écrans génétiques avant et les efforts de séquençage du génome entier ont joué un rôle clé dans l&#39;identification des mutations et des gènes essentiels à de nombreux processus de développement 11, 12, 13, 14,« &gt; 15, 16. Les méthodes de clonage de passerelle ont permis à l&#39;application routine de transgénique approches 17, 18. Les progrès récents dans la modification du génome, illustré par activateur de transcription (TALENs) et en grappes courtes répétitions palindromiques régulièrement espacées (CRISPR) -Cas9 des nucleases, permettre l&#39;introduction ciblée de mutations, ainsi que knock-out et knock-in approche 19, 20, 21, 22. Ensemble, ces méthodes font zebrafish un modèle puissant pour l&#39;étude des mécanismes génétiques sous - jacents des comportements spécifiques et plusieurs maladies humaines 23, 24, 25, 26, 27. Ce travail se concentre sur développerla réglementation mentale et le rôle de l&#39;activité électrique dans le développement des neurones. L&#39;accent est mis sur la moelle épinière, pour laquelle le modèle de poisson zèbre offre plusieurs avantages. Tout d&#39;abord, il est relativement facile d&#39;accès à des stades zebrafish embryonnaire et larvaire; Par conséquent, on peut étudier la fonction de la moelle épinière au cours des stades de développement qui ont moins de neurones et les circuits plus simples 28, 29. En outre, la moelle épinière poisson - zèbre comporte un ensemble diversifié de neurones, similaire à d&#39; autres vertébrés, comme démontré par des motifs caractéristiques et distinctifs de facteurs de transcription 30, 31, 32, 33, 34, 35. La majorité des études chez le poisson zèbre qui visent à découvrir les mécanismes qui sous-tendent la fonction des circuits de la moelle épinière, en particulierceux qui prennent en charge la locomotion, sont naturellement porté sur les stades larvaires 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43. Cependant, la plupart des neurones qui forment les réseaux de locomotive de la colonne vertébrale à leur différenciation initier les premiers stades embryonnaires, ~ 9-10 h après la fécondation (HPF) 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51. Compte tenu de cela, la compréhension de la façon dont les propriétés morphologiques et électriques des neurones de la colonne vertébrale se posent et le changement entre les stades embryonnaire et larvaire est important pour un Overacompréhension ll de la formation du circuit locomoteur et la fonction. Les méthodes de dissection décrites ici permettent des enregistrements de patch-clamp de neurones de la colonne vertébrale et ont été appliquées avec succès à des stades embryonnaires (~ 17-48 HPF) et stades larvaires (~ 3-7 jours après fécondation [dpf]). Cette approche limite la quantité de dissection nécessaire pour permettre l&#39;accès aux neurones d&#39;intérêt. Le protocole diffère de la plupart des autres procédés publiés pour l&#39;enregistrement à partir de neurones spinaux zebrafish en ce que la colle de suture vétérinaire est utilisé, au lieu d&#39;une amende broche de tungstène, pour fixer l&#39;embryon ou une larve de la chambre d&#39;enregistrement. La disponibilité de deux approches différentes ( par exemple, la colle de suture par rapport à la broche de tungstène) pour le montage des embryons de poisson zèbre ou larves pour l&#39; analyse électrophysiologique offre aux chercheurs des options alternatives pour atteindre leurs objectifs expérimentaux spécifiques. Tout d&#39;abord, les procédures d&#39;accès et l&#39;enregistrement à partir d&#39;un pop<html> ulation des neurones sensoriels primaires, des cellules Rohon-Barbe, sont décrits. Les corps cellulaires de ces neurones se situent dans la moelle épinière dorsale. Cellules Rohon-Barbe existent dans de nombreuses espèces de vertébrés, se différencient au début du développement, et sous - tendent la réponse tactile embryonnaire 6, 44, 47, 48. En second lieu, les procédures d&#39;accès et d&#39;enregistrement des neurones moteurs spinaux sont détaillés. motoneurones spinaux Zebrafish surviennent pendant deux vagues de la neurogenèse. Les neurones moteurs primaires plus tôt nés surviennent à la fin de la gastrulation (~ 9-16 HPF), avec seulement 3-4 neurones moteurs primaire présents par hemisegment 45, 46, 49. En revanche, la population née plus tard des neurones moteurs secondaires sont plus nombreux et se pose au cours d&#39;une période prolongée, à partir de ~ 14 HPFef &quot;&gt; 45, 50. genèse du neurone moteur secondaire dans des segments à mi-tronc est en grande partie rempli par 51 HPF 50. neurones moteurs secondaires sont considérés comme étant l&#39;équivalent des neurones moteurs dans amniotes 46. Il est intéressant de neurones supraspinales, via la dopamine, régulent la locomotion dans la larve et la genèse du neurone moteur secondaire dans l&#39;embryon et le jeune larve 50, 51. moteur primaire et secondaire neurones comprennent chacun plusieurs sous - types différents. chaque projets de sous - types de neurones moteurs primaires un axone périphérique qui innerve un groupe musculaire caractéristique, résultant en un stéréotype, l&#39;identification trajectoire axonale. en général, les neurones moteurs secondaires suivent les voies axonales précédemment établies par les neurones moteurs primaires. Ainsi, en ce qui concerne les trajectoires des axones, les neurones moteurs primaires et secondaires sont similaires, à l&#39;exception que l&#39;épaisseur et la taille des axones somata unre plus grande pour les neurones moteurs primaires 45. En troisième lieu, les méthodes pour l&#39;enregistrement de quelques types d&#39;interneurones sont discutés. Cependant, dans ces cas, une quantité limitée d&#39;élimination des autres cellules de la moelle épinière est nécessaire, et donc de la moelle épinière est moins intact que pour des enregistrements à partir de cellules Rohon-Barbe ou neurones moteurs.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Vacuum filter/Storage bottle, 0.22 mm pore</td>
			<td>Corning</td>
			<td>431096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe filter 0.2 mm</td>
			<td>Whatman</td>
			<td>6780-2502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tricaine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A-5040</td>
			<td>Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>a-bugarotoxin</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>11032-79-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetrodotoxin</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>4368-28-9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa-549 hydrazine salt</td>
			<td>Molecular Probes</td>
			<td>A-10438</td>
			<td>fluorescent dye</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spin-X centrifuge tube filter</td>
			<td>Corning</td>
			<td>8161</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass microscope slide</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>12-550C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sylgard silicone elastomer kit</td>
			<td>Dow Corning</td>
			<td>184</td>
			<td>silicone elastomer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>351029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borosilicate glass capillaries</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>30-0038</td>
			<td>inner and outer diameters of 0.78 and 1.0 mm (thin walled glass capillaries)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borosilicate glass capillaries</td>
			<td>Drummond Scientific</td>
			<td>1-000-1000-100</td>
			<td>inner and outer diameters of 1.13 and 1.55 mm (thick walled glass capillaries)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Miniature barbed polypropylene fitting&#160;</td>
			<td>Cole-Palmer</td>
			<td>6365-90</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vetbond tissue adhesive&#160;</td>
			<td>3M</td>
			<td>1469SB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase XI</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C7657</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microelectrode puller</td>
			<td>Sutter Instruments</td>
			<td>&#160;Model P-97&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amplifier</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>Axopatch 200B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Head stage</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>CV203BU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Motorized micromanipulator&#160;&#160;</td>
			<td>Sutter Instruments</td>
			<td>MP-285</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tygon tubing</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>14-169-1B</td>
			<td>ID 1/16 IN, OD 1/8 IN and WALL 1/32 IN (flexible laboratory tubing)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrode holder</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>1-HC-U</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pharmaseal Three-Way Stopcocks&#160;</td>
			<td>Baxter</td>
			<td>K75</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digitizer</td>
			<td>Axon Instruments</td>
			<td>Digidata 1440A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted microscope&#160;</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>Axioskop2 FS plus</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40x/0.80w Achroplan objective</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Data acquisition and analysis software&#160;</td>
			<td>Axon Instruments</td>
			<td colspan="2">PClamp 10 - Clampex and Clampfit&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette puller</td>
			<td>Sutter Instruments</td>
			<td>Model P-97</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">Dissection and Recording Solutions(in mM)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">All solutions, except the intracellular, are stable for ~ 2 - 3 months when filtered (0.22 mm filter cups) and stored at room temperature (RT).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">The intracellular solution is filtered (0.2 mm syringe filters) and stored frozen (-20&#176;C) in small aliquots that are individually thawed on the day of use.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2" rowspan="1">Dissection/Ringer&#8217;s solution</td>
			<td></td>
			<td colspan="2">145 NaCl, 3 KCl, 1.8 CaCl2.2H2O, 10 HEPES; pH 7.4 (with NaOH)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">Pipette (intracellular) recording solution</td>
			<td></td>
			<td colspan="2">135 KCl, 10 EGTA-acid, 10 HEPES; pH 7.4 (with KOH).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">Bath (extracellular) recording solution/voltage and current-clamp</td>
			<td></td>
			<td colspan="2">125 NaCl, 2 KCl, 10 CaCl2.2H2O, 5 HEPES; pH 7.4 (with NaOH).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">Alexa-594 hydrazine salt stock solution.&#160;</td>
			<td></td>
			<td colspan="2">Prepare a 13.2 mM stock in ddH2O, aliquot (~ 100 &#181;l) and store at -20&#176;C. For use, dilute the stock solutiond 132 fold with pipette solution to a final concentration of 100 mM. After dilution, filter the Alexa-594 containing pipette solution&#160; with a centrifuge tube filter.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immobilizing agents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">0.4 % ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt (Tricaine)</td>
			<td></td>
			<td colspan="2">Prepare a 0.4% stock solution in 0.2M Tris, pH9 (0.4 g Tricaine/100 ml 0.2 M Tris</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td colspan="2">Adjust pH to 7 with NaOH and store at -20&#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td colspan="2">For use, dilute the stock solution ~ 25 fold in embryo media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>250 &#956;M &#945;-bungarotoxin</td>
			<td></td>
			<td colspan="2">Prepare a 250 &#956;M stock in ddH2O (1 mg/500 &#956;l), prepare 100 &#181;l aliquots, and sotre at -20&#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td colspan="2">For use, dilute 2,500-fold with extracellular solution to a final concentration of 100 nM.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 mM Tetrodotoxin</td>
			<td></td>
			<td colspan="2">Prepare a 1 mM stock in ddH2O (1 mg/3 ml), prepare 100 &#181;l aliquots, and sotre at -20&#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td colspan="2">For use, dilute 2,000-fold with extracellular solution to a final concentration of 500 nM.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

zebrafish in situ spinal cord preparation for electrophysiological recordings from spinal sensory and motor neurons

Le poisson zèbre, d&#39;abord présenté comme un modèle de développement, ont gagné en popularité dans de nombreux autres domaines. La facilité d&#39;élevage un grand nombre d&#39;organismes en développement rapide, combinée à la clarté optique embryonnaire, a servi de premiers attributs convaincants de ce modèle. Au cours des deux dernières décennies, le succès de ce modèle a été propulsé par son plus amenability aux écrans de mutagenèse à grande échelle et par la facilité de transgénèse. Plus récemment, les approches d&#39;édition génétique ont étendu la puissance du modèle. Pour les études neurodéveloppementaux, l&#39;embryon de poisson zèbre et larve fournissent un modèle auquel plusieurs méthodes peuvent être appliquées. Ici, nous nous concentrons sur les méthodes qui permettent l&#39;étude d&#39;une propriété essentielle des neurones, excitabilité électrique. Notre préparation pour l&#39;étude électrophysiologique des neurones spinaux de poisson zèbre implique l&#39;utilisation de colle de suture vétérinaire pour garantir la préparation à une chambre d&#39;enregistrement. Des méthodes alternatives pour l&#39;enregistrementà partir d&#39; embryons de poisson zèbre et les larves impliquent la fixation de la préparation à la chambre à l&#39; aide d&#39; une amende broche de tungstène 1, 2, 3, 4, 5. Une broche de tungstène est le plus souvent utilisé pour monter la préparation dans une orientation latérale, même si elle a été utilisée pour monter des larves face dorsale jusqu&#39;à 4. La colle de suture a été utilisé pour monter des embryons et des larves dans les deux orientations. Utilisation de la colle, une dissection minimale peut être effectuée, ce qui permet l&#39;accès aux neurones spinaux sans l&#39;utilisation d&#39;un traitement enzymatique, ce qui évite tout dommage résultant. Cependant, pour les larves, il est nécessaire d&#39;appliquer un bref traitement enzymatique pour enlever le tissu musculaire entourant la moelle épinière. Les méthodes décrites ici ont été utilisées pour étudier les propriétés électriques intrinsèques des neurones moteurs, interneurones et les neurones sensoriels à plusieurs developmentÃl étapes 6, 7, 8, 9.

Nous avons réussi à enregistrer des neurones Rohon-Barbe dans 17 HPF embryons à 7 dpf larves (figure 5A et 5B). Lorsque les cellules Rohon-Barbe ont été enregistrées, la préparation a été monté en place du côté dorsal. Un tel montage permet d&#39;identifier sans ambiguïté des cellules Rohon-Barbe en fonction de leurs positions dorsales superficielles et grandes tailles soma. L&#39;identification est en outre confirmé par le potentiel membr...

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Zebrafish In Situ Spinal Cord Preparation for Electrophysiological Recordings from Spinal Sensory and Motor Neurons

Ce manuscrit décrit les méthodes pour les enregistrements électrophysiologiques de neurones spinaux des embryons de poisson zèbre et les larves. La préparation maintient les neurones in situ et implique souvent la dissection minimum. Ces méthodes permettent l&#39;étude électrophysiologique d&#39;une variété de neurones de la colonne vertébrale, de l&#39;acquisition de l&#39;excitabilité électrique initiale dans les premiers stades larvaires.

poisson zèbre<em&gt; In Situ</em&gt; Préparation à la moelle épinière électrophysiologiques Les enregistrements de la colonne vertébrale et sensorielle motoneurones

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