Name: zebrafish in situ spinal cord preparation for electrophysiological recordings from spinal sensory and motor neurons
Uploaded: 2017-04-18T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Zebrafish In Situ Spinal Cord Preparation for Electrophysiological Recordings from Spinal Sensory and Motor Neurons at JoVE.com

עבודה זו נתמכה על ידי תרומות של NIH (F32 NS059120 כדי RLM ו- R01NS25217 ו P30NS048154 כדי ABR).

הנהלים כל חיה אושרו על ידי ועדת טיפול בבעלי חיים מוסדיים השתמש (IACUC; משרד משאבי בחיות מעבדה, אוניברסיטת קולורדו אנשוץ קמפוס רפואי). 1. בעלי הזברה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להעלות ולשמור דג הזברה מבוגר (Danio re...

השיטות שתוארו כאן לאפשר אפיון חשמל מורפולוגי של נוירונים החושי והמוטורי של עוברי דג הזברה לאחר דיסקציה מינימלי של חוט השדרה. נוירונים להישאר בריאים במשך לפחות 1 h, מגבלת הזמן שהוטלה על ההקלטות הללו. נוירונים תועדו באמצעות התצורה כל התא הסטנדרטי, כמו גם מן הטלאים גרעינ...

<html> ג&#39;ורג Streisinger חלוץ בשימוש Danio rerio, הידוע בכינויו דג הזברה, כמערכת מודל לניתוח גנטי של התפתחות החולייתנים 10. המודל מציע מספר יתרונות ובהם: (1) יחסית גידול בעלי חיים פשוט וזול; (2) הפריה חוץ, המאפשר גישה קלה עוברים מן שלבי ההתפתחות המוקדמים; ו (3) העובר שקוף, המאפשר תצפיות ישירות חוזרות ונשנות של תאים, רקמות, ואיברים כפי שהם יוצרים. במשך העשורים שלאחר מכן, מספר התקדמויות נוספות הגדילו את כוחו של המודל דג הזברה. בפרט, מסכי גנטי קדימה מאמצים רצף שלם-בגנום מילאו תפקידי מפתח לזיהוי מוטציות בגנים קריטי לתהליכים התפתחותיים רבים 11, 12, 13, 14,&quot;&gt; 15, 16. שיטות שיבוט Gateway אפשרו היישום השיגרתי של מהונדס מתקרב 17, 18. התקדמות העריכה בגנום, שהודגמה על ידי מפעיל דמוי שעתוק (TALENs) ומתקבצות בקביעות interspaced חזרות palindromic קצרות (קריספר) -Cas9 nucleases, לאפשר את כניסתה של מוטציות הממוקדות, וכן נוק-אאוט ולהפיל-בגישות 19, 20, 21, 22. משולבים, שיטות אלה להפוך דג זברה כמודל עצמה לחקר המנגנונים הגנטיים הבסיסיים התנהגויות מסוימות ומחלות אנושיות מספר 23, 24, 25, 26, 27. עבודה זו מתמקדת בפיתוחתקנה נפשית ואת התפקיד של פעילות חשמלית התפתחות עצבית. הדגש הוא על חוט השדרה, עבורו מודל דג הזברה מספק מספר יתרונות. ראשית, קל יחסית לגשת דג זברה בשלבים עובריים זחל; לפיכך, אפשר ללמוד לתפקד חוט שדרה במהלך שלבי התפתחות שיש פחות תאי עצב ומעגלים פשוטים 28, 29. יתר על כן, בחוט שדרת דג הזברה יש קבוצה מגוונת של נוירונים, בדומה חוליות אחרות, כפי שהוכח על ידי תבניות אופייניות ו היכר של שעתוק גורמי 30, 31, 32, 33, 34, 35. רוב המחקרים דג הזברה שמטרתם לחשוף את המנגנונים העומדים בבסיס פונקציה של מעגלים בחוט השדרה, במיוחדאלה שתומכים תנועה, ממוקדים באופן מובן על שלבי הזחל 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43. עם זאת, רבים של נוירונים היוצרים את רשתות קטר השדרה ליזום בידול שלהם בשלבים עובריים מוקדמים, ~ 9-10 שעות לאחר ההפריה (hpf) 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51. לאור זאת, ההבנה כיצד המאפיינים המורפולוגיים וחשמליים של נוירונים שדרה להתעורר ולהשתנות בין השלבים העובריים זחל חשוב עבור overaהבנת ll של היווצרות מעגל תנועה ותפקוד. שיטות לנתיחה המתוארת כאן לאפשר הצמד תיקון הקלטות מתא עצב השדרה יושמו בהצלחה בשלבים עובריים (~ 17-48 hpf) ואת שלבי הזחל (~ הפריה 3-7 ימים שלאחר [DPF]). גישה זו מגבילה את כמות דיסקציה נדרש לספק גישה נוירונים של עניין. הפרוטוקול שונה ממרבית השיטות שפורסמו אחרים להקלטה מתא עצב שדרת דג זברה כי דבק תפר הווטרינר משמש, ולא סיכת טונגסטן בסדר, לצרף את העובר או זחל לתא ההקלטה. הזמינות של שתי גישות שונות (כלומר, דבק תפר מול סיכת טונגסטן) להרכבת עוברי דג הזברה או זחלים לניתוח אלקטרו מספקת לחוקרים עם אפשרויות חלופיות כדי להשיג מטרות הניסוי הספציפיות שלהם. ראשית, נהלים לגישה והקלטה של ​​פופ<html> ulation של עצב סנסורי עיקרי, תאי Rohon-בירד, מתוארים. גופי התא של הנוירונים האלה נמצאים בתוך חוט השדרה הגבי. תאי Rohon-בירד קיימים מינים בעלי חוליות רבים, להבדיל מוקדם בהתפתחות, והם עומדים ביסוד בתגובה למגע העוברי 6, 44, 47, 48. שנית, נהלים לגישה והקלטה מן הנוירונים המוטוריים השדרה מפורטים. הנוירונים מוטורי שדרת זברה להתעורר במהלך שני גלים של נוירוגנסיס. הנוירונים המוטוריים העיקריים מוקדם היליד להתעורר בסוף gastrulation (~ 9-16 hpf), עם רק 3-4 הנוירונים מוטוריים העיקרי כיום לכל hemisegment 45, 46, 49. לעומת זאת, האוכלוסייה מאוחר היליד של הנוירונים מוטוריים משניים היא יותר רבה מתעוררת במהלך תקופה ממושכת, החל מהשעה ~ 14 hpfEF &quot;&gt; 45, 50. בראשית משניים הנוירון המוטורי בפלחי-הגזע באמצע תושלם ברובה על ידי 51 hpf 50. הנוירונים המוטוריים משניים נחשבים המקבילה של הנוירונים המוטוריים ב אמניוטים 46. מעניין, נוירונים supraspinal, באמצעות דופמין, לווסת תנועה הזחל וג&#39;נסיס הנוירון המוטורי משנית בעובר ו זחל צעיר 50, 51. הנוירונים המוטוריים יסודי ותיכון אחד המרכיבים תת שונים. כל הפרויקטים תת הנוירון המוטורי העיקרי האקסון היקפי כי innervates קבוצת שרירים אופיינית, וכתוצאה מכך סטריאוטיפי, זיהוי מסלול אקסונלית. באופן כללי, הנוירונים מוטוריים משני לעקוב אחר מסלולי אקסונלית הוקמו בעבר על ידי נוירונים מנוע עיקריים. לפיכך, בהתייחס מסלולי אקסונלית, הנוירונים מוטוריים יסודיים ותיכון דומים, למעט כי עובי אקסונים ו somata בגודלמחדש יותר עבור הנוירונים מוטוריים עיקריים 45. שלישית, שיטות הקלטה מכמה סוגים של interneurons נדונות. עם זאת, במקרים אלה, כמות מוגבלת של הסרת תאים בחוט השדרה אחרים נדרשת, ובכך חוט השדרה הוא פחות שלם יותר להקלטות מתאי Rohon-בירד או הנוירונים המוטוריים.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Vacuum filter/Storage bottle, 0.22 mm pore</td>
			<td>Corning</td>
			<td>431096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe filter 0.2 mm</td>
			<td>Whatman</td>
			<td>6780-2502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tricaine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A-5040</td>
			<td>Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>a-bugarotoxin</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>11032-79-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetrodotoxin</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>4368-28-9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa-549 hydrazine salt</td>
			<td>Molecular Probes</td>
			<td>A-10438</td>
			<td>fluorescent dye</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spin-X centrifuge tube filter</td>
			<td>Corning</td>
			<td>8161</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass microscope slide</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>12-550C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sylgard silicone elastomer kit</td>
			<td>Dow Corning</td>
			<td>184</td>
			<td>silicone elastomer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>351029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borosilicate glass capillaries</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>30-0038</td>
			<td>inner and outer diameters of 0.78 and 1.0 mm (thin walled glass capillaries)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borosilicate glass capillaries</td>
			<td>Drummond Scientific</td>
			<td>1-000-1000-100</td>
			<td>inner and outer diameters of 1.13 and 1.55 mm (thick walled glass capillaries)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Miniature barbed polypropylene fitting&#160;</td>
			<td>Cole-Palmer</td>
			<td>6365-90</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vetbond tissue adhesive&#160;</td>
			<td>3M</td>
			<td>1469SB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase XI</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C7657</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microelectrode puller</td>
			<td>Sutter Instruments</td>
			<td>&#160;Model P-97&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amplifier</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>Axopatch 200B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Head stage</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>CV203BU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Motorized micromanipulator&#160;&#160;</td>
			<td>Sutter Instruments</td>
			<td>MP-285</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tygon tubing</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>14-169-1B</td>
			<td>ID 1/16 IN, OD 1/8 IN and WALL 1/32 IN (flexible laboratory tubing)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrode holder</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>1-HC-U</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pharmaseal Three-Way Stopcocks&#160;</td>
			<td>Baxter</td>
			<td>K75</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digitizer</td>
			<td>Axon Instruments</td>
			<td>Digidata 1440A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted microscope&#160;</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>Axioskop2 FS plus</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40x/0.80w Achroplan objective</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Data acquisition and analysis software&#160;</td>
			<td>Axon Instruments</td>
			<td colspan="2">PClamp 10 - Clampex and Clampfit&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette puller</td>
			<td>Sutter Instruments</td>
			<td>Model P-97</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">Dissection and Recording Solutions(in mM)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">All solutions, except the intracellular, are stable for ~ 2 - 3 months when filtered (0.22 mm filter cups) and stored at room temperature (RT).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">The intracellular solution is filtered (0.2 mm syringe filters) and stored frozen (-20&#176;C) in small aliquots that are individually thawed on the day of use.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2" rowspan="1">Dissection/Ringer&#8217;s solution</td>
			<td></td>
			<td colspan="2">145 NaCl, 3 KCl, 1.8 CaCl2.2H2O, 10 HEPES; pH 7.4 (with NaOH)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">Pipette (intracellular) recording solution</td>
			<td></td>
			<td colspan="2">135 KCl, 10 EGTA-acid, 10 HEPES; pH 7.4 (with KOH).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">Bath (extracellular) recording solution/voltage and current-clamp</td>
			<td></td>
			<td colspan="2">125 NaCl, 2 KCl, 10 CaCl2.2H2O, 5 HEPES; pH 7.4 (with NaOH).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">Alexa-594 hydrazine salt stock solution.&#160;</td>
			<td></td>
			<td colspan="2">Prepare a 13.2 mM stock in ddH2O, aliquot (~ 100 &#181;l) and store at -20&#176;C. For use, dilute the stock solutiond 132 fold with pipette solution to a final concentration of 100 mM. After dilution, filter the Alexa-594 containing pipette solution&#160; with a centrifuge tube filter.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immobilizing agents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">0.4 % ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt (Tricaine)</td>
			<td></td>
			<td colspan="2">Prepare a 0.4% stock solution in 0.2M Tris, pH9 (0.4 g Tricaine/100 ml 0.2 M Tris</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td colspan="2">Adjust pH to 7 with NaOH and store at -20&#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td colspan="2">For use, dilute the stock solution ~ 25 fold in embryo media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>250 &#956;M &#945;-bungarotoxin</td>
			<td></td>
			<td colspan="2">Prepare a 250 &#956;M stock in ddH2O (1 mg/500 &#956;l), prepare 100 &#181;l aliquots, and sotre at -20&#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td colspan="2">For use, dilute 2,500-fold with extracellular solution to a final concentration of 100 nM.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 mM Tetrodotoxin</td>
			<td></td>
			<td colspan="2">Prepare a 1 mM stock in ddH2O (1 mg/3 ml), prepare 100 &#181;l aliquots, and sotre at -20&#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td colspan="2">For use, dilute 2,000-fold with extracellular solution to a final concentration of 500 nM.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

zebrafish in situ spinal cord preparation for electrophysiological recordings from spinal sensory and motor neurons

הזברה, הוצג לראשונה כדגם התפתחותית, זכו לפופולריות בתחומים רבים אחרים. ההקלות של גידול במספר גדול של אורגניזמים המתפתח במהירות, בשילוב עם הבהירות האופטית העוברית, שמשו תכונות משכנעות ראשוניות של הדגם הזה. במהלך שני העשורים האחרונים, את ההצלחה של המודל הזה כבר מונע יותר על ידי המוכנות שלה למסכי mutagenesis בקנה מידה גדולה ועל ידי הקלות של transgenesis. לאחרונה, גישות לעריכת הגן הרחיבו את כוחו של המודל. עבור מחקרים נוירו-התפתחותיות, עובר זחל דג הזברה לספק מודל שאליו מספר שיטות ניתן ליישם. כאן, אנו מתמקדים שיטות המאפשרות חקר נכס מהותי של נוירונים, רגישות חשמלית. ההכנה שלנו לחקר אלקטרו של נוירונים שדרת דג זברה כרוכה בשימוש דבק תפר וטרינר כדי לאבטח את ההכנה כדי בתא הקלטה. שיטות חלופיות עבור הקלטהמעובר ואת זחלי דג זברה לערב את הקובץ המצורף של ההכנה לתא באמצעות סיכת טונגסטן בסדר 1, 2, 3, 4, 5. סיכת טונגסטן משמשת לרוב כדי להרכיב את ההכנה בכיוון לרוחב, אם כי זה כבר נעשה שימוש כדי לעלות בצד הגבי זחלים עד 4. דבק התפר שמש הר עובר וזחלי הנטיות הן. באמצעות דבק, לנתיחה מינימלי יכול להתבצע, מה שמאפשר גישה הנוירונים השדרה ללא שימוש טיפול אנזימטי, ובכך למנוע כל נזק כתוצאה. עם זאת, עבור הזחלים, יש צורך להחיל טיפול אנזים קצר כדי להסיר את רקמת השריר המקיף את חוט השדרה. השיטות שתוארו כאן שימשו ללמוד את התכונות החשמליות הפנימי של הנוירונים המוטוריים, interneurons, ואת עצב סנסורי בכמה developmentÃl טיולי 6, 7, 8, 9.

הקלטנו בהצלחה מתא עצב Rohon-בירד ב 17 hpf עובר דרך 7 DPF זחלים (איור 5 א ו 5 ב). כאשר תאי Rohon-בירד נרשמו, ההכנה הייתה רכובה עד הגבה-לוואי. הרכבה כזו מאפשרת זיהוי חד משמעי של תאים Rohon-בירד מבוסס על עמדות הגב שטחית שלהם וגדלים סומה גדול. זיהוי הוא א...

Watch this Scientific Journal Video about Zebrafish In Situ Spinal Cord Preparation for Electrophysiological Recordings from Spinal Sensory and Motor Neurons at JoVE.com

Zebrafish In Situ Spinal Cord Preparation for Electrophysiological Recordings from Spinal Sensory and Motor Neurons

כתב יד זה מתאר שיטות הקלטות אלקטרו מן הנוירונים השדרה של עוברי דג הזברה הזחלים. הכנת שומרת נוירונים באתרו ולעיתים קרובות כרוך דיסקציה מינימום. שיטות אלה מאפשרות לחקר אלקטרו מגוון של נוירונים שדרה, מרכישת רגישויות חשמל הראשונית דרך שלבי זחל מוקדם.

זברה<em&gt; באתרו</em&gt; הכנת בחוט השדרה עבור הקלטות אלקטרו מתוך השדרה חושית הנוירונים המוטוריים

Zebrafish, first introduced as a developmental model, have gained popularity in many other fields. The ease of rearing large numbers of rapidly developing ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Zebrafish In Situ Spinal Cord Preparation for Electrophysiological Recordings from Spinal Sensory and Motor Neurons

Dissection and Culture of Commissural Neurons from Embryonic Spinal Cord

Dissection והתרבות של נוירונים Commissural מחוט השדרה עובריים

Commissural neurons have been widely used to investigate the mechanisms underlying axon guidance during embryonic spinal cord development. The cell bodies ...

DiI-Labeling of DRG Neurons to Study Axonal Branching in a Whole Mount Preparation of Mouse Embryonic Spinal Cord

DiI-תיוג של נוירונים DRG לחקר axonal מסעף בהכנת הר שלם של חוט השדרה עובריים בעכבר

Here we  present a technique to label the trajectories of small groups of DRG neurons  into the embryonic spinal cord by diffusive staining using the ...

Spinal Cord Transection in the Larval Zebrafish

חיתוך רוחב חוט השדרה בדג הזברה הזחל

Mammals fail in sensory and motor recovery following spinal cord injury due to lack of axonal regrowth below the level of injury as well as an inability ...

The Preparation of Oblique Spinal Cord Slices for Ventral Root Stimulation

הכנת פרוסות קורד אלכסון שדרה עבור גחון רוט גירוי

Electrophysiological recordings from spinal cord slices have proven to be a valuable technique to investigate a wide range of questions, from cellular to ...

Preparation of Primary Mixed Glial Cultures from Adult Mouse Spinal Cord Tissue

הכנת תרבויות גליה מעורבת ראשיים מרקמות קורד למבוגרים עכבר השדרה

It has been well-accepted that spinal cord glial responses contribute significantly to the development of neuropathic pain. Tremendous information ...

Spinal Cord Neurons Isolation and Culture from Neonatal Mice

נוירונים חוט השדרה בידוד ותרבות מ עכברים ניאונטליים

We present a protocol for the isolation and culture of spinal cord neurons. The neurons are obtained from neonatal C57BL/6 mice and are isolated on ...

Preparation of Acute Spinal Cord Slices for Whole-cell Patch-clamp Recording in Substantia Gelatinosa Neurons

הכנה של חוט השדרה חריפה פרוסות תאים כל תיקון-קלאמפ הקלטה בנוירונים הסובסטנציה Gelatinosa

Recent whole-cell patch-clamp studies from substantia gelatinosa (SG) neurons have provided a large body of information about the spinal mechanisms ...

Isolation and Culture of Oculomotor, Trochlear, and Spinal Motor Neurons from Prenatal Islmn:GFP Transgenic Mice

Isolation and Culture of Oculomotor, Trochlear, and Spinal Motor Neurons from Prenatal Islmn:GFP Transgenic Mice

בידוד ותרבות של והעושות, טרוליר, ושדרה מוטוריים נוירונים מ בטרום לידתי : עכברים הטרנסגניים

Oculomotor neurons (CN3s) and trochlear neurons (CN4s) exhibit remarkable resistance to degenerative motor neuron diseases such as amyotrophic lateral ...

Optogenetic Phase Transition of TDP-43 in Spinal Motor Neurons of Zebrafish Larvae

מעבר שלב אופטוגנטי של TDP-43 בתאי עצב מוטוריים בעמוד השדרה של זחלי דגי זברה

Abnormal protein aggregation and selective neuronal vulnerability are two major hallmarks of neurodegenerative diseases. Causal relationships between ...

A Minimally Invasive, Fast Spinal Cord Lateral Hemisection Technique for Modeling Open Spinal Cord Injuries in Rats

Open spinal cord injury techniques modeling laceration-like injuries are time-consuming and invasive because they involve laminectomy. This new technique ...