Name: zebrafish in situ spinal cord preparation for electrophysiological recordings from spinal sensory and motor neurons
Uploaded: 2017-04-18T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Zebrafish In Situ Spinal Cord Preparation for Electrophysiological Recordings from Spinal Sensory and Motor Neurons at JoVE.com

इस काम एनआईएच (F32 NS059120 RLM और R01NS25217 और P30NS048154 को ABR को) से अनुदान द्वारा समर्थित किया गया।

(; प्रयोगशाला पशु संसाधन के कार्यालय, कोलोराडो Anschutz विश्वविद्यालय मेडिकल कैम्पस IACUC) सभी पशु प्रक्रियाओं संस्थागत पशु की देखभाल और उपयोग समिति द्वारा अनुमोदित किया गया। 1. Zebrafish पालन <ol><li> उठाएँ औ?...

तरीकों यहाँ वर्णित रीढ़ की हड्डी के कम से कम विच्छेदन के बाद zebrafish भ्रूण के संवेदी और मोटर न्यूरॉन्स की बिजली और रूपात्मक लक्षण वर्णन के लिए अनुमति देते हैं। न्यूरॉन्स कम से कम 1 घंटे, समय सीमा इन रिकॉर्डि...

<html> जॉर्ज स्ट्रीइसिंजर Danio rerio का उपयोग करते हैं, आमतौर पर zebrafish के रूप में जाना का बीड़ा उठाया है, हड्डीवाला विकास 10 में आनुवांशिक विश्लेषण के लिए एक मॉडल प्रणाली के रूप में। मॉडल सहित कई लाभ प्रदान करता: (1) अपेक्षाकृत सरल और सस्ती पशुपालन; (2) बाह्य निषेचन, जल्द से जल्द विकास के चरणों से भ्रूण के लिए आसान पहुँच की अनुमति देता है; और (3) एक पारदर्शी भ्रूण, की कोशिकाओं, ऊतकों और अंगों प्रत्यक्ष और दोहराया टिप्पणियों की अनुमति के रूप में वे के रूप में। आगामी दशकों में, कई अग्रिम आगे zebrafish मॉडल की शक्ति में वृद्धि हुई। विशेष रूप से, आगे आनुवंशिक स्क्रीन और पूरे जीनोम अनुक्रमण प्रयासों कई विकास प्रक्रियाओं 11, 12, 13, 14 के लिए म्यूटेशन और महत्वपूर्ण जीनों की पहचान करने में महत्वपूर्ण भूमिका निभाई,&quot;&gt; 15, 16। गेटवे क्लोनिंग तरीकों में सहायता दी है ट्रांसजेनिक की दिनचर्या आवेदन दृष्टिकोण 17, 18। जीनोम संपादन में हाल के अग्रिमों प्रतिलेखन उत्प्रेरक की तरह (TALENS) द्वारा उदाहरण और क्लस्टर नियमित रूप से interspaced कम मुरजबंध संबंधी दोहराता (CRISPR) -Cas9 न्युक्लिअसिज़, परिवर्तन के लक्षित परिचय के लिए अनुमति देते हैं, साथ ही साथ नॉक-आउट और दस्तक में 19 दृष्टिकोण, 20, 21, 22। संयुक्त, इन तरीकों zebrafish विशिष्ट व्यवहार और कई मानव रोगों अंतर्निहित आनुवंशिक तंत्र के अध्ययन के लिए एक शक्तिशाली मॉडल बनाने 23, 24, 25, 26, 27। इस काम को विकसित करने पर केंद्रित हैमानसिक विनियमन और neuronal विकास में विद्युत गतिविधि की भूमिका। फोकस रीढ़ की हड्डी है, जिसके लिए zebrafish मॉडल कई लाभ प्रदान करता है पर है। सबसे पहले, यह भ्रूण और लार्वा चरणों में zebrafish तक पहुँचने के लिए अपेक्षाकृत आसान है; इसलिए, एक विकास के चरणों कम न्यूरॉन्स और सरल circuitry 28, 29 है कि के दौरान रीढ़ की हड्डी समारोह अध्ययन कर सकते हैं। इसके अलावा, zebrafish रीढ़ की हड्डी के रूप में प्रतिलेखन की विशेषता और विशिष्ठ पैटर्न द्वारा प्रदर्शन कारकों 30, 31, 32, 33, 34, 35, न्यूरॉन्स, अन्य रीढ़ के समान की एक विविध सेट है। zebrafish में अध्ययन के बहुमत है कि तंत्र है कि रीढ़ की हड्डी सर्किट के समारोह आबाद को उजागर करने के उद्देश्य से, विशेष रूप सेजो कि हरकत का समर्थन है, जाहिर है लार्वा चरणों 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43 पर ध्यान केंद्रित कर रहे हैं। हालांकि, न्यूरॉन्स कि रीढ़ की हड्डी लोकोमोटिव नेटवर्क के रूप में के कई जल्दी भ्रूण चरणों में उनके भेदभाव आरंभ किया है, ~ 9-10 घंटे के बाद निषेचन (HPF) 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51। इसे देखते हुए, कैसे समझ रीढ़ की हड्डी में न्यूरॉन्स की रूपात्मक और बिजली के गुणों पैदा होती है और भ्रूण और लार्वा चरणों के बीच परिवर्तन एक overa के लिए महत्वपूर्ण हैहरकत सर्किट गठन और समारोह के डालूँगा समझ। विच्छेदन यहाँ वर्णित तरीकों रीढ़ की हड्डी में न्यूरॉन्स से पैच क्लैंप रिकॉर्डिंग की अनुमति है और सफलतापूर्वक भ्रूण चरणों (~ 17-48 HPF) और लार्वा चरणों (~ 3-7 दिनों के बाद निषेचन [DPF]) में लागू किया गया है। यह दृष्टिकोण ब्याज की न्यूरॉन्स के लिए पहुँच प्रदान करने के लिए आवश्यक विच्छेदन की मात्रा को सीमित। प्रोटोकॉल है कि पशु चिकित्सक टांका गोंद में zebrafish रीढ़ की हड्डी में न्यूरॉन्स से रिकॉर्डिंग प्रयोग किया जाता है, न कि एक ठीक टंगस्टन पिन से, रिकॉर्डिंग कक्ष के भ्रूण या लार्वा संलग्न करने के लिए अन्य तरीकों प्रकाशित के बहुमत से अलग है। दो अलग-अलग दृष्टिकोण की उपलब्धता (यानी, टांका गोंद बनाम टंगस्टन पिन) electrophysiological विश्लेषण के लिए zebrafish भ्रूण या लार्वा बढ़ते के लिए वैकल्पिक विकल्पों के साथ शोधकर्ताओं ने अपने विशिष्ट प्रयोगात्मक लक्ष्यों को प्राप्त करने देता है। सबसे पहले, तक पहुँचने और एक पॉप से ​​रिकॉर्डिंग के लिए प्रक्रियाओं<html> प्राथमिक संवेदी न्यूरॉन्स की ulation, Rohon-दाढ़ी कोशिकाओं, वर्णित हैं। इन न्यूरॉन्स की सेल शरीर पृष्ठीय रीढ़ की हड्डी के भीतर झूठ बोलते हैं। Rohon-दाढ़ी कोशिकाओं, कई हड्डीवाला प्रजातियों में मौजूद विकास में जल्दी अंतर, और भ्रूण स्पर्श प्रतिक्रिया 6, 44, 47, 48 आबाद। दूसरा, तक पहुँचने और रीढ़ की हड्डी में मोटर न्यूरॉन्स से रिकॉर्डिंग के लिए प्रक्रियाओं विस्तृत कर रहे हैं। Zebrafish रीढ़ की मोटर न्यूरॉन्स न्यूरोजेनेसिस के दो तरंगों के दौरान उत्पन्न होती हैं। पहले जन्मे प्राथमिक मोटर न्यूरॉन्स, gastrulation (~ 9-16 HPF) के अंत में उत्पन्न होती हैं केवल 3-4 प्राथमिक मोटर hemisegment 45, 46, 49 प्रति वर्तमान न्यूरॉन्स के साथ। इसके विपरीत, माध्यमिक मोटर न्यूरॉन्स के बाद में जन्मीं जनसँख्या अधिक संख्या में है और एक लम्बी अवधि के दौरान पैदा होती है, ~ 14 HPF पर शुरू होने वालेएफई &quot;&gt; 45, 50। मध्य ट्रंक क्षेत्रों में माध्यमिक मोटर न्यूरॉन उत्पत्ति ज्यादातर 51 hpf 50 तक पूरा कर लिया गया है। माध्यमिक मोटर न्यूरॉन्स उल्वों में मोटर न्यूरॉन्स के समकक्ष माना जाता है 46। दिलचस्प बात यह है supraspinal न्यूरॉन्स, डोपामाइन के माध्यम से, हरकत को विनियमित प्राथमिक और माध्यमिक मोटर न्यूरॉन्स लार्वा और भ्रूण में माध्यमिक मोटर न्यूरॉन उत्पत्ति और युवा लार्वा 50, 51 में। प्रत्येक कई अलग अलग उपप्रकार प्रत्येक प्राथमिक मोटर न्यूरॉन उप प्रकार परियोजनाओं एक परिधीय अक्षतंतु कि एक विशेषता पेशी समूह innervates, एक टकसाली में जिसके परिणामस्वरूप शामिल।, axonal पथ की पहचान। आम तौर पर, माध्यमिक मोटर न्यूरॉन्स axonal रास्ते पहले से प्राथमिक मोटर न्यूरॉन्स द्वारा स्थापित किया गया, axonal प्रक्षेप पथ के संबंध में पालन करें। इस प्रकार, प्राथमिक और माध्यमिक मोटर न्यूरॉन्स अपवाद के साथ, इसी तरह के हैं कि axonal मोटाई और somata आकार एकप्राथमिक मोटर न्यूरॉन्स 45 के लिए अधिक से अधिक कर रहे हैं। तीसरा, इन्तेर्नयूरोंस के कुछ प्रकार से रिकॉर्डिंग के लिए तरीकों पर चर्चा कर रहे हैं। हालांकि, इन मामलों में, अन्य रीढ़ की हड्डी की कोशिकाओं को हटाने की एक सीमित मात्रा में आवश्यकता होती है, और इस तरह रीढ़ की हड्डी Rohon-दाढ़ी कोशिकाओं या मोटर न्यूरॉन्स से रिकॉर्डिंग के लिए कम से कम बरकरार है।

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Vacuum filter/Storage bottle, 0.22 mm pore</td>
			<td>Corning</td>
			<td>431096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe filter 0.2 mm</td>
			<td>Whatman</td>
			<td>6780-2502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tricaine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A-5040</td>
			<td>Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>a-bugarotoxin</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>11032-79-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetrodotoxin</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>4368-28-9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa-549 hydrazine salt</td>
			<td>Molecular Probes</td>
			<td>A-10438</td>
			<td>fluorescent dye</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spin-X centrifuge tube filter</td>
			<td>Corning</td>
			<td>8161</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass microscope slide</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>12-550C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sylgard silicone elastomer kit</td>
			<td>Dow Corning</td>
			<td>184</td>
			<td>silicone elastomer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>351029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borosilicate glass capillaries</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>30-0038</td>
			<td>inner and outer diameters of 0.78 and 1.0 mm (thin walled glass capillaries)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borosilicate glass capillaries</td>
			<td>Drummond Scientific</td>
			<td>1-000-1000-100</td>
			<td>inner and outer diameters of 1.13 and 1.55 mm (thick walled glass capillaries)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Miniature barbed polypropylene fitting&#160;</td>
			<td>Cole-Palmer</td>
			<td>6365-90</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vetbond tissue adhesive&#160;</td>
			<td>3M</td>
			<td>1469SB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase XI</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C7657</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microelectrode puller</td>
			<td>Sutter Instruments</td>
			<td>&#160;Model P-97&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amplifier</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>Axopatch 200B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Head stage</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>CV203BU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Motorized micromanipulator&#160;&#160;</td>
			<td>Sutter Instruments</td>
			<td>MP-285</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tygon tubing</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>14-169-1B</td>
			<td>ID 1/16 IN, OD 1/8 IN and WALL 1/32 IN (flexible laboratory tubing)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrode holder</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>1-HC-U</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pharmaseal Three-Way Stopcocks&#160;</td>
			<td>Baxter</td>
			<td>K75</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digitizer</td>
			<td>Axon Instruments</td>
			<td>Digidata 1440A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted microscope&#160;</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>Axioskop2 FS plus</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40x/0.80w Achroplan objective</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Data acquisition and analysis software&#160;</td>
			<td>Axon Instruments</td>
			<td colspan="2">PClamp 10 - Clampex and Clampfit&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette puller</td>
			<td>Sutter Instruments</td>
			<td>Model P-97</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">Dissection and Recording Solutions(in mM)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">All solutions, except the intracellular, are stable for ~ 2 - 3 months when filtered (0.22 mm filter cups) and stored at room temperature (RT).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">The intracellular solution is filtered (0.2 mm syringe filters) and stored frozen (-20&#176;C) in small aliquots that are individually thawed on the day of use.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2" rowspan="1">Dissection/Ringer&#8217;s solution</td>
			<td></td>
			<td colspan="2">145 NaCl, 3 KCl, 1.8 CaCl2.2H2O, 10 HEPES; pH 7.4 (with NaOH)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">Pipette (intracellular) recording solution</td>
			<td></td>
			<td colspan="2">135 KCl, 10 EGTA-acid, 10 HEPES; pH 7.4 (with KOH).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">Bath (extracellular) recording solution/voltage and current-clamp</td>
			<td></td>
			<td colspan="2">125 NaCl, 2 KCl, 10 CaCl2.2H2O, 5 HEPES; pH 7.4 (with NaOH).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">Alexa-594 hydrazine salt stock solution.&#160;</td>
			<td></td>
			<td colspan="2">Prepare a 13.2 mM stock in ddH2O, aliquot (~ 100 &#181;l) and store at -20&#176;C. For use, dilute the stock solutiond 132 fold with pipette solution to a final concentration of 100 mM. After dilution, filter the Alexa-594 containing pipette solution&#160; with a centrifuge tube filter.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immobilizing agents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">0.4 % ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt (Tricaine)</td>
			<td></td>
			<td colspan="2">Prepare a 0.4% stock solution in 0.2M Tris, pH9 (0.4 g Tricaine/100 ml 0.2 M Tris</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td colspan="2">Adjust pH to 7 with NaOH and store at -20&#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td colspan="2">For use, dilute the stock solution ~ 25 fold in embryo media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>250 &#956;M &#945;-bungarotoxin</td>
			<td></td>
			<td colspan="2">Prepare a 250 &#956;M stock in ddH2O (1 mg/500 &#956;l), prepare 100 &#181;l aliquots, and sotre at -20&#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td colspan="2">For use, dilute 2,500-fold with extracellular solution to a final concentration of 100 nM.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 mM Tetrodotoxin</td>
			<td></td>
			<td colspan="2">Prepare a 1 mM stock in ddH2O (1 mg/3 ml), prepare 100 &#181;l aliquots, and sotre at -20&#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td colspan="2">For use, dilute 2,000-fold with extracellular solution to a final concentration of 500 nM.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

zebrafish in situ spinal cord preparation for electrophysiological recordings from spinal sensory and motor neurons

Zebrafish, पहले एक विकासात्मक मॉडल के रूप में पेश किया, कई अन्य क्षेत्रों में लोकप्रियता हासिल की है। तेजी से विकसित जीवों की बड़ी मात्रा के पालन में आसानी, भ्रूण ऑप्टिकल स्पष्टता के साथ संयुक्त, इस मॉडल की प्रारंभिक सम्मोहक विशेषताओं के रूप में कार्य किया। पिछले दो दशकों में, इस मॉडल की सफलता आगे बड़े पैमाने पर म्युटाजेनेसिस स्क्रीन करने के लिए अपने ज़िम्मा द्वारा और transgenesis में आसानी द्वारा चालित किया गया है। अभी हाल ही में जीन-संपादन दृष्टिकोण मॉडल की शक्ति विस्तार किया है। neurodevelopmental अध्ययन के लिए, zebrafish भ्रूण और लार्वा एक मॉडल है जो करने के लिए कई तरीकों लागू किया जा सकता हैं। यहाँ, हम तरीकों कि न्यूरॉन्स, विद्युत उत्तेजना का एक अनिवार्य संपत्ति के अध्ययन के लिए अनुमति देने पर ध्यान केंद्रित। zebrafish रीढ़ की हड्डी में न्यूरॉन्स की electrophysiological अध्ययन के लिए हमारी तैयारी पशुचिकित्सा टांका गोंद के उपयोग के एक रिकॉर्डिंग कक्ष के तैयारी सुरक्षित करने के लिए शामिल है। रिकॉर्डिंग के लिए वैकल्पिक तरीकोंzebrafish भ्रूण और लार्वा से एक ठीक टंगस्टन पिन 1, 2, 3, 4, 5 का उपयोग कर सदन के लिए तैयारी की कुर्की शामिल है। एक टंगस्टन पिन सबसे अधिक बार हालांकि यह लार्वा पृष्ठीय साइड 4 माउंट करने के लिए इस्तेमाल किया गया है, एक पार्श्व अभिविन्यास में तैयारी माउंट करने के लिए प्रयोग किया जाता है। टांका गोंद दोनों झुकाव में भ्रूण और लार्वा माउंट करने के लिए इस्तेमाल किया गया है। गोंद का उपयोग करना, एक न्यूनतम विच्छेदन एक एंजाइमी उपचार के उपयोग के बिना रीढ़ की हड्डी में न्यूरॉन्स के लिए पहुंच की अनुमति देते हैं, जिससे किसी भी परिणामी क्षति से बचने के किया जा सकता है,। हालांकि, लार्वा के लिए, यह आवश्यक रीढ़ की हड्डी के आसपास के मांसपेशियों के ऊतकों को हटाने के लिए एक संक्षिप्त एंजाइम उपचार लागू करने के लिए है। तरीकों यहाँ वर्णित कई developmentÃ पर मोटर न्यूरॉन्स, इन्तेर्नयूरोंस, और संवेदी न्यूरॉन्स के आंतरिक बिजली के गुणों का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया गया हैएल चरण 6, 7, 8, 9।

(चित्रा 5 ए और 5 ब) हम सफलतापूर्वक लार्वा DPF 7 के माध्यम से 17 hpf भ्रूण में Rohon-दाढ़ी न्यूरॉन्स से दर्ज की गई है। जब Rohon-दाढ़ी कोशिकाओं दर्ज किया गया, तैयारी पृष्ठीय साइड अप घुड़सवार किया ?...

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Zebrafish In Situ Spinal Cord Preparation for Electrophysiological Recordings from Spinal Sensory and Motor Neurons

यह पांडुलिपि zebrafish भ्रूण और लार्वा के रीढ़ की हड्डी में न्यूरॉन्स से electrophysiological रिकॉर्डिंग के लिए तरीके का वर्णन है। तैयारी सीटू न्यूरॉन्स को बनाए रखता है और अक्सर कम से कम विच्छेदन शामिल है। इन विधियों जल्दी लार्वा चरणों के माध्यम से प्रारंभिक विद्युत उत्तेजना अधिग्रहण से, रीढ़ की हड्डी न्यूरॉन्स की एक किस्म के electrophysiological अध्ययन के लिए अनुमति देते हैं।

zebrafish<em&gt; सीटू</em&gt; रीढ़ की हड्डी रीढ़ की हड्डी में संवेदी और मोटर न्यूरॉन्स से electrophysiological रिकॉर्डिंग के लिए तैयारी

Zebrafish, first introduced as a developmental model, have gained popularity in many other fields. The ease of rearing large numbers of rapidly developing ...

Research

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Here we  present a technique to label the trajectories of small groups of DRG neurons  into the embryonic spinal cord by diffusive staining using the ...

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