Name: zebrafish in situ spinal cord preparation for electrophysiological recordings from spinal sensory and motor neurons
Uploaded: 2017-04-18T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Zebrafish In Situ Spinal Cord Preparation for Electrophysiological Recordings from Spinal Sensory and Motor Neurons at JoVE.com

Questo lavoro è stato sostenuto da finanziamenti del NIH (NS059120 F32 per RLM e R01NS25217 e P30NS048154 a ABR).

Tutte le procedure di animali sono stati approvati dal Comitato Istituzionale cura degli animali ed uso (IACUC; Ufficio di laboratorio Risorse Animali, Università del Colorado Anschutz Medical Campus). 1. Zebrafish Zootecnica <ol><li> Sollevare e mantenere adulto zebrafish (Danio rerio) a 28,5 ° C in un / 14 h ciclo luce 10 h scuro e con apposito trattamento dell&#39;acqua e scambio 52. </li><li> Sollevare zebrafish embrioni / larve a 28,5 ° C in terreno...

I metodi qui descritti consentono la caratterizzazione elettrica e morfologica dei neuroni sensoriali e motori di embrioni zebrafish dopo minima dissezione del midollo spinale. Neuroni restano sani per almeno 1 h, il limite di tempo imposto su queste registrazioni. I neuroni sono stati registrati utilizzando la configurazione a cellula intera serie, così come da patch nucleate; quest&#39;ultimo metodo minimizza problemi di spazio-clamp che può precludere uno studio biofisico dettagliato delle correnti ioniche <sup cla...

<html> George Streisinger aperto la strada all&#39;uso di Danio rerio, comunemente noto come pesce zebra, come sistema modello per l&#39;analisi genetica di sviluppo dei vertebrati 10. Il modello offre diversi vantaggi tra cui: (1) relativamente semplice e poco costoso zootecnia; (2) fecondazione esterna, consente un facile accesso alle embrioni dalle prime fasi di sviluppo; e (3) un embrione trasparente, permettendo osservazioni dirette e ripetute di cellule, tessuti e organi in quanto costituiscono. Nel corso dei decenni successivi, numerosi miglioramenti aumentato ulteriormente la potenza del modello di zebrafish. In particolare, gli schermi genetici avanti e sforzi sequenziamento dell&#39;intero genoma giocato un ruolo chiave nella identificazione di mutazioni e geni critici per molti processi di sviluppo 11, 12, 13, 14,&quot;&gt; 15, 16 metodi di clonazione. Gateway hanno permesso l&#39;applicazione di routine di transgenico si avvicina a 17, 18. I recenti progressi nella modifica del genoma, esemplificato dalla trascrizione attivatore-simile (Talens) e cluster regolarmente intervallati ripetizioni brevi palindromi (CRISPR) -Cas9 nucleasi, consentire l&#39;introduzione mirata di mutazioni, così come knock-out e knock-in si avvicina 19, 20, 21, 22. combinata, questi metodi fanno zebrafish un potente modello per lo studio dei meccanismi genetici sottostanti specifici comportamenti e diverse malattie umane 23, 24, 25, 26, 27. Questo lavoro si concentra su svilupporegolazione mentale e il ruolo dell&#39;attività elettrica nello sviluppo neuronale. L&#39;attenzione è sul midollo spinale, per cui il modello zebrafish fornisce diversi vantaggi. In primo luogo, è relativamente facile accedere zebrafish nelle fasi embrionali e larvali; Pertanto, si può studiare la funzione del midollo spinale durante fasi di sviluppo che hanno meno neuroni e semplice circuiteria 28, 29. Inoltre, il midollo spinale zebrafish ha un diverso insieme di neuroni, simile ad altri vertebrati, come dimostrato dai modelli caratteristici e distintivi di fattori di trascrizione 30, 31, 32, 33, 34, 35. La maggior parte degli studi in zebrafish che mirano a scoprire i meccanismi che stanno alla base del funzionamento dei circuiti del midollo spinale, specialmentequelli che supportano locomozione, sono comprensibilmente focalizzati su stadi larvali 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43. Tuttavia, molti dei neuroni che formano le reti locomotiva spinali iniziato la loro differenziazione nelle fasi embrionali, ~ 9-10 ore dopo la fecondazione (HPF) 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51. In considerazione di ciò, comprendere come le proprietà morfologiche ed elettriche dei neuroni spinali sorgono e cambiamento tra gli stadi embrionali e larvali è importante per un overall comprensione della formazione circuito motorio e funzione. I metodi di dissezione qui descritti permettono registrazioni di patch clamp da neuroni spinali e sono stati applicati con successo nelle fasi embrionali (~ 17-48 HPF) e stadi larvali (~ 3-7 giorni dopo la fecondazione [dpf]). Questo approccio limita la quantità di dissezione necessaria per fornire l&#39;accesso ai neuroni di interesse. Il protocollo differisce dalla maggior parte degli altri metodi pubblicati per la registrazione da neuroni spinali zebrafish a che la colla veterinario sutura viene utilizzata, anziché un perno di tungsteno fine, per fissare l&#39;embrione o larva alla camera di registrazione. La disponibilità di due approcci differenti (cioè, colla sutura rispetto al perno tungsteno) per il montaggio delle zebrafish embrioni o larve per l&#39;analisi elettrofisiologica fornisce ai ricercatori opzioni alternative per raggiungere i loro obiettivi sperimentali specifiche. In primo luogo, le procedure per l&#39;accesso e la registrazione da un pop<html> ulation di neuroni sensoriali primarie, cellule ROHON-barba, sono descritti. I corpi cellulari di questi neuroni si trovano all&#39;interno del midollo spinale dorsale. Cellule ROHON-barba esistono in numerose specie di vertebrati, differenziano prime fasi di sviluppo, e alla base la risposta al tocco embrionale 6, 44, 47, 48. In secondo luogo, le procedure per l&#39;accesso e la registrazione da motoneuroni spinali sono dettagliate. Zebrafish motoneuroni spinali sorgono durante due onde di neurogenesi. Motoneuroni primari precedenza nati sorgono a fine gastrulazione (~ 9-16 HPF), con solo 3-4 motoneuroni primari presenti per hemisegment 45, 46, 49. Al contrario, la popolazione più tardi-nato motoneuroni secondari è più numerose e si verifica durante un periodo prolungato, da ~ 14 HPFef &quot;&gt; 45, 50. secondario motoneurone genesi segmenti metà tronco principalmente è completata da 51 HPF 50. motoneuroni secondari sono considerati la controparte dei motoneuroni del amnioti 46. È interessante notare che i neuroni sovraspinali, tramite dopamina, regolano locomozione la larva e motore secondario neurone genesi nell&#39;embrione e giovane larva 50, 51. motoneuroni primari e secondari comprendono ciascuno diversi sottotipi differenti. ogni motore primario progetti neurone sottotipo un assoni periferici che innerva un gruppo muscolare caratteristico, con un conseguente stereotipo, identificando traiettoria assonale. Generalmente, i motoneuroni secondari seguono percorsi assonale prestabiliti dalla motoneuroni primari. Pertanto, rispetto a traiettorie assoni, motoneuroni primari e secondari sono simili, con l&#39;eccezione che lo spessore assonale e somata dimensione are maggiore per motoneuroni primari 45. In terzo luogo, i metodi per la registrazione da alcuni tipi di interneuroni sono discussi. Tuttavia, in questi casi, è richiesta una quantità limitata di rimozione di altre cellule del midollo spinale, e quindi il midollo spinale è meno intatta che per registrazioni da cellule ROHON-barba o neuroni motori.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Vacuum filter/Storage bottle, 0.22 mm pore</td>
			<td>Corning</td>
			<td>431096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe filter 0.2 mm</td>
			<td>Whatman</td>
			<td>6780-2502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tricaine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A-5040</td>
			<td>Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>a-bugarotoxin</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>11032-79-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetrodotoxin</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>4368-28-9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa-549 hydrazine salt</td>
			<td>Molecular Probes</td>
			<td>A-10438</td>
			<td>fluorescent dye</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spin-X centrifuge tube filter</td>
			<td>Corning</td>
			<td>8161</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass microscope slide</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>12-550C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sylgard silicone elastomer kit</td>
			<td>Dow Corning</td>
			<td>184</td>
			<td>silicone elastomer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>351029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borosilicate glass capillaries</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>30-0038</td>
			<td>inner and outer diameters of 0.78 and 1.0 mm (thin walled glass capillaries)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borosilicate glass capillaries</td>
			<td>Drummond Scientific</td>
			<td>1-000-1000-100</td>
			<td>inner and outer diameters of 1.13 and 1.55 mm (thick walled glass capillaries)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Miniature barbed polypropylene fitting&#160;</td>
			<td>Cole-Palmer</td>
			<td>6365-90</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vetbond tissue adhesive&#160;</td>
			<td>3M</td>
			<td>1469SB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase XI</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C7657</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microelectrode puller</td>
			<td>Sutter Instruments</td>
			<td>&#160;Model P-97&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amplifier</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>Axopatch 200B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Head stage</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>CV203BU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Motorized micromanipulator&#160;&#160;</td>
			<td>Sutter Instruments</td>
			<td>MP-285</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tygon tubing</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>14-169-1B</td>
			<td>ID 1/16 IN, OD 1/8 IN and WALL 1/32 IN (flexible laboratory tubing)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrode holder</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>1-HC-U</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pharmaseal Three-Way Stopcocks&#160;</td>
			<td>Baxter</td>
			<td>K75</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digitizer</td>
			<td>Axon Instruments</td>
			<td>Digidata 1440A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted microscope&#160;</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>Axioskop2 FS plus</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40x/0.80w Achroplan objective</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Data acquisition and analysis software&#160;</td>
			<td>Axon Instruments</td>
			<td colspan="2">PClamp 10 - Clampex and Clampfit&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette puller</td>
			<td>Sutter Instruments</td>
			<td>Model P-97</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">Dissection and Recording Solutions(in mM)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">All solutions, except the intracellular, are stable for ~ 2 - 3 months when filtered (0.22 mm filter cups) and stored at room temperature (RT).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">The intracellular solution is filtered (0.2 mm syringe filters) and stored frozen (-20&#176;C) in small aliquots that are individually thawed on the day of use.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2" rowspan="1">Dissection/Ringer&#8217;s solution</td>
			<td></td>
			<td colspan="2">145 NaCl, 3 KCl, 1.8 CaCl2.2H2O, 10 HEPES; pH 7.4 (with NaOH)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">Pipette (intracellular) recording solution</td>
			<td></td>
			<td colspan="2">135 KCl, 10 EGTA-acid, 10 HEPES; pH 7.4 (with KOH).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">Bath (extracellular) recording solution/voltage and current-clamp</td>
			<td></td>
			<td colspan="2">125 NaCl, 2 KCl, 10 CaCl2.2H2O, 5 HEPES; pH 7.4 (with NaOH).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">Alexa-594 hydrazine salt stock solution.&#160;</td>
			<td></td>
			<td colspan="2">Prepare a 13.2 mM stock in ddH2O, aliquot (~ 100 &#181;l) and store at -20&#176;C. For use, dilute the stock solutiond 132 fold with pipette solution to a final concentration of 100 mM. After dilution, filter the Alexa-594 containing pipette solution&#160; with a centrifuge tube filter.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immobilizing agents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">0.4 % ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt (Tricaine)</td>
			<td></td>
			<td colspan="2">Prepare a 0.4% stock solution in 0.2M Tris, pH9 (0.4 g Tricaine/100 ml 0.2 M Tris</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td colspan="2">Adjust pH to 7 with NaOH and store at -20&#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td colspan="2">For use, dilute the stock solution ~ 25 fold in embryo media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>250 &#956;M &#945;-bungarotoxin</td>
			<td></td>
			<td colspan="2">Prepare a 250 &#956;M stock in ddH2O (1 mg/500 &#956;l), prepare 100 &#181;l aliquots, and sotre at -20&#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td colspan="2">For use, dilute 2,500-fold with extracellular solution to a final concentration of 100 nM.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 mM Tetrodotoxin</td>
			<td></td>
			<td colspan="2">Prepare a 1 mM stock in ddH2O (1 mg/3 ml), prepare 100 &#181;l aliquots, and sotre at -20&#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td colspan="2">For use, dilute 2,000-fold with extracellular solution to a final concentration of 500 nM.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

zebrafish in situ spinal cord preparation for electrophysiological recordings from spinal sensory and motor neurons

Zebrafish, introdotto come modello di sviluppo, hanno guadagnato popolarità in molti altri campi. La facilità di allevamento gran numero di organismi rapido sviluppo, combinata con la chiarezza ottica embrionale, servito come attributi convincenti iniziali di questo modello. Nel corso degli ultimi due decenni, il successo di questo modello è stato ulteriormente spinto dalla sua riconducibilità agli schermi di mutagenesi su larga scala e dalla facilità di transgenesi. Più di recente, gene-editing approcci hanno esteso la potenza del modello. Per gli studi neurologico, zebrafish e larva forniscono un modello a cui possono essere applicati diversi metodi. Qui, ci concentriamo sui metodi che consentono lo studio di una proprietà essenziale dei neuroni, eccitabilità elettrica. La nostra preparazione per lo studio elettrofisiologico dei neuroni spinali zebrafish implica l&#39;uso di colla veterinario sutura per fissare la preparazione ad una camera di registrazione. Metodi alternativi per la registrazioneda embrioni zebrafish e larve comportare l&#39;attacco della preparazione per la camera con un perno multa tungsteno 1, 2, 3, 4, 5. Un perno di tungsteno è più spesso utilizzato per montare il preparato in un orientamento laterale, anche se è stato utilizzato per montare larve dorsale rivolta verso l&#39;alto 4. La colla sutura è stato utilizzato per montare embrioni e larve in entrambi gli orientamenti. Utilizzando la colla, una dissezione minima può essere eseguita, consentendo l&#39;accesso ai neuroni spinali senza l&#39;uso di un trattamento enzimatico, evitando così ogni danno risultante. Tuttavia, per le larve, è necessario applicare un trattamento enzimatico breve per rimuovere il tessuto muscolare che circonda il midollo spinale. I metodi descritti qui sono stati utilizzati per studiare le proprietà elettriche intrinseche dei neuroni motori, interneuroni e neuroni sensoriali in diversi Sviluppo deil stadi 6, 7, 8, 9.

Noi abbiamo registrato con successo da neuroni ROHON-barba in 17 HPF embrioni a 7 dpf larve (Figura 5A e 5B). Quando sono stati registrati cellule ROHON-barba, la preparazione è stata montata dorsale rivolta verso l&#39;alto. Tale montaggio consente l&#39;identificazione univoca delle cellule ROHON-barba basati sulle loro posizioni dorsali superficiali e grandi dimensioni soma. L&#39;identificazione è ulteriormente confermata dal potenziale di membrana...

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Zebrafish In Situ Spinal Cord Preparation for Electrophysiological Recordings from Spinal Sensory and Motor Neurons

Questo manoscritto descrive i metodi per le registrazioni elettrofisiologiche da neuroni spinali di embrioni di zebrafish e larve. La preparazione mantiene neuroni in situ e spesso comporta la dissezione minimo. Questi metodi consentono lo studio elettrofisiologico di una varietà di neuroni spinali, dalla acquisizione iniziale eccitabilità elettrica attraverso le prime fasi larvali.

zebrafish<em&gt; In Situ</em&gt; Spinal Cord Preparazione per elettrofisiologiche Le registrazioni da spinale sensoriali e motori neuroni

Zebrafish, first introduced as a developmental model, have gained popularity in many other fields. The ease of rearing large numbers of rapidly developing ...

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