Name: zebrafish in situ spinal cord preparation for electrophysiological recordings from spinal sensory and motor neurons
Uploaded: 2017-04-18T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Zebrafish In Situ Spinal Cord Preparation for Electrophysiological Recordings from Spinal Sensory and Motor Neurons at JoVE.com

この作品は、NIH（ABRにRLMとR01NS25217とP30NS048154にF32のNS059120）からの助成金によってサポートされていました。

すべての動物の手順は、施設内動物管理使用委員会（;実験動物資源のオフィス、コロラドアンシュッツメディカルキャンパスの大学IACUC）によって承認されました。 1.ゼブラフィッシュの飼育<ol><li>上げ、10時間の暗/ 14時間の明サイクルで、適切な水処理及び交換52と28.5℃の成体ゼブラフィッシュ（ ゼブラフィッシュ ） を維持します。 ...

ここで説明する方法は、脊髄の最小限の解剖後のゼブラフィッシュ胚の感覚と運動ニューロンの電気的および形態学的特性評価を可能とします。ニューロンは、少なくとも1時間、これらの記録に課される時間制限のために健康なままです。ニューロンは、標準の全細胞構成を使用して記録だけでなく、有核パッチからされています。後者の方法は、イオン電流9の詳細な生?...

<html>ジョージ・ストレジンガー脊椎動物の発生10の遺伝子分析のためのモデル系として、一般的にゼブラフィッシュとして知られ、 ゼブラフィッシュの使用を開拓しました。モデルは、以下を含むいくつかの利点が提供しています：（1）比較的単純で安価な畜産を、 （2）体外受精、最も初期の発達段階から胚への容易なアクセスを可能にします。 （3）透明胚、それらが形成するように、細胞、組織、および器官の直接繰り返し観察を可能にします。 その後数十年にわたり、いくつかの進歩はさらにゼブラフィッシュモデルのパワーを増加させました。具体的には、フォワード遺伝子スクリーニング及び全ゲノム配列決定努力は、14、13、12、11、多くの発生過程に重要な変異および遺伝子の同定に重要な役割を果たし「&gt; 15、16。Gatewayクローニング方法は、転写活性化因子様（TALENs）によって例示さ、トランスジェニックのルーチンアプリケーション17、18に近づくゲノム編集の最近の進歩を可能にし、クラスタ化された定期的interspaced短いパリンドローム反復（CRISPR）-Cas9ヌクレアーゼ、 19、20、21、22に近づく変異の標的に導入を可能と同様に、ノックアウトおよびインをノック。組み合わせ、これらの方法では、ゼブラフィッシュ、特定の行動の根底にある遺伝的メカニズムと、いくつかのヒト疾患の研究のための強力なモデルを作ります23、24、25、26、27。 この作品は、開発に焦点を当てて精神的な規制や神経の発達における電気的活動の役割。焦点は、ゼブラフィッシュモデルはいくつかの利点を提供するために脊髄にあります。まず、胚および幼生の段階でゼブラフィッシュにアクセスすることは比較的容易です。そのため、人は少ないニューロンとシンプルな回路28、29を持っているの発達段階中に脊髄機能を研究することができます。また、ゼブラフィッシュ脊髄は、転写の特性及び特徴的なパターンによって実証されるように、他の脊椎動物と同様ニューロンの多様なセットを持っている30、31、32、33、34、35因子 。 特に、脊髄回路の機能の根底にあるメカニズムを解明することを目指しゼブラフィッシュにおける大多数の研究歩行をサポートするものは、当然のことながら幼虫36、37、38、39、40、41、42、43に焦点を当てています。しかしながら、脊椎機関車のネットワークを形成するニューロンの多くは、初期胚の段階でそれらの分化を開始する、〜9-10時間後に受精（HPF）44、45、46、47、48、49、50、51。そこで、脊髄神経細胞の形態学的および電気的特性が生じ、胚および幼虫期の間でどのように変化するかを理解することOveraのために重要です運動回路の形成と機能のLL理解。 ここで説明する解剖方法は、脊髄の神経細胞からパッチクランプ記録を許可し、正常胚期（〜17から48 HPF）と幼生期（〜3-7日受精後[DPF]）で適用されています。このアプローチは、関心のニューロンへのアクセスを提供するために必要な解剖の量を制限します。プロトコルは、獣医の縫合接着剤におけるゼブラフィッシュ脊髄ニューロンから記録するための他の公表された方法の大部分とは異なる記録チャンバーに胚または幼虫を取り付けるために、かなり微細なタングステンピンよりも、使用されています。 2つの異なるアプローチの可用性は（ すなわち、タングステンピン対縫合のり）電気生理学的解析のためにゼブラフィッシュの胚や幼生を取り付けるための代替オプションを持つ研究者が具体的な実験の目標を達成するために用意されています。 まず、ポップからアクセスして記録するための手順<html>一次感覚ニューロンのピュレーションは、Rohon-ベアード細胞は、記載されています。これらのニューロンの細胞体は、背側脊髄内にあります。 Rohon・ベアード細胞は、多数の脊椎動物種に存在する初期の開発で差別化、および胚タッチレスポンス6、44、47、48の基礎となります。 第二に、脊髄運動ニューロンからアクセスして記録するための手順が詳述されています。ゼブラフィッシュ脊髄運動ニューロンは、神経発生の二つの波の間に生じます。以前生まれの一次運動ニューロンはhemisegment 45、46、49あたりに存在するだけで3-4一次運動ニューロンと、原腸形成の終わり（〜9-16 HPF）で発生します。これとは対照的に、二次運動ニューロンの後に生まれ人口は、より多数で、長期間の間に発生する、〜14 HPFで始まりますEF &quot;&gt; 45、50。中間トランクセグメントにおける二次運動ニューロン起源が主に51 HPF 50によって完成される。二次運動ニューロンは、羊膜46における運動ニューロンの相手であると考えられる。興味深いことに、脊柱上のニューロンは、ドーパミンを介して、運動を制御します胚及び若い幼虫50における幼虫と二次運動ニューロン起源で、51。一次および二次運動ニューロンそれぞれは、いくつかの異なるサブタイプを含む。各一次運動ニューロンのサブタイプは、ステレオタイプその結果、特性の筋肉群を神経支配する末梢軸索を投射軸索の軌跡を識別する。一般に、二次運動ニューロンは、以前に一次運動ニューロンによって確立された軸索の経路をたどる。このように、軸索軌道に対して、一次および二次運動ニューロンを除いて、類似している軸索の厚さと細胞体サイズA一次運動ニューロン45のための大きい再。 第三に、介在ニューロンの数のタイプからの記録のための方法が説明されています。しかしながら、これらの場合に、他の脊髄細胞の除去の限られた量が必要であり、従って脊髄Rohon-ひげ細胞又は運動ニューロンから記録のためのより少ない無傷です。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Vacuum filter/Storage bottle, 0.22 mm pore</td>
			<td>Corning</td>
			<td>431096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe filter 0.2 mm</td>
			<td>Whatman</td>
			<td>6780-2502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tricaine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A-5040</td>
			<td>Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>a-bugarotoxin</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>11032-79-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetrodotoxin</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>4368-28-9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa-549 hydrazine salt</td>
			<td>Molecular Probes</td>
			<td>A-10438</td>
			<td>fluorescent dye</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spin-X centrifuge tube filter</td>
			<td>Corning</td>
			<td>8161</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass microscope slide</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>12-550C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sylgard silicone elastomer kit</td>
			<td>Dow Corning</td>
			<td>184</td>
			<td>silicone elastomer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>351029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borosilicate glass capillaries</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>30-0038</td>
			<td>inner and outer diameters of 0.78 and 1.0 mm (thin walled glass capillaries)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borosilicate glass capillaries</td>
			<td>Drummond Scientific</td>
			<td>1-000-1000-100</td>
			<td>inner and outer diameters of 1.13 and 1.55 mm (thick walled glass capillaries)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Miniature barbed polypropylene fitting&#160;</td>
			<td>Cole-Palmer</td>
			<td>6365-90</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vetbond tissue adhesive&#160;</td>
			<td>3M</td>
			<td>1469SB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase XI</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C7657</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microelectrode puller</td>
			<td>Sutter Instruments</td>
			<td>&#160;Model P-97&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amplifier</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>Axopatch 200B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Head stage</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>CV203BU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Motorized micromanipulator&#160;&#160;</td>
			<td>Sutter Instruments</td>
			<td>MP-285</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tygon tubing</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>14-169-1B</td>
			<td>ID 1/16 IN, OD 1/8 IN and WALL 1/32 IN (flexible laboratory tubing)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrode holder</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>1-HC-U</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pharmaseal Three-Way Stopcocks&#160;</td>
			<td>Baxter</td>
			<td>K75</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digitizer</td>
			<td>Axon Instruments</td>
			<td>Digidata 1440A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted microscope&#160;</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>Axioskop2 FS plus</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40x/0.80w Achroplan objective</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Data acquisition and analysis software&#160;</td>
			<td>Axon Instruments</td>
			<td colspan="2">PClamp 10 - Clampex and Clampfit&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette puller</td>
			<td>Sutter Instruments</td>
			<td>Model P-97</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">Dissection and Recording Solutions(in mM)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">All solutions, except the intracellular, are stable for ~ 2 - 3 months when filtered (0.22 mm filter cups) and stored at room temperature (RT).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">The intracellular solution is filtered (0.2 mm syringe filters) and stored frozen (-20&#176;C) in small aliquots that are individually thawed on the day of use.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2" rowspan="1">Dissection/Ringer&#8217;s solution</td>
			<td></td>
			<td colspan="2">145 NaCl, 3 KCl, 1.8 CaCl2.2H2O, 10 HEPES; pH 7.4 (with NaOH)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">Pipette (intracellular) recording solution</td>
			<td></td>
			<td colspan="2">135 KCl, 10 EGTA-acid, 10 HEPES; pH 7.4 (with KOH).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">Bath (extracellular) recording solution/voltage and current-clamp</td>
			<td></td>
			<td colspan="2">125 NaCl, 2 KCl, 10 CaCl2.2H2O, 5 HEPES; pH 7.4 (with NaOH).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">Alexa-594 hydrazine salt stock solution.&#160;</td>
			<td></td>
			<td colspan="2">Prepare a 13.2 mM stock in ddH2O, aliquot (~ 100 &#181;l) and store at -20&#176;C. For use, dilute the stock solutiond 132 fold with pipette solution to a final concentration of 100 mM. After dilution, filter the Alexa-594 containing pipette solution&#160; with a centrifuge tube filter.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immobilizing agents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">0.4 % ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt (Tricaine)</td>
			<td></td>
			<td colspan="2">Prepare a 0.4% stock solution in 0.2M Tris, pH9 (0.4 g Tricaine/100 ml 0.2 M Tris</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td colspan="2">Adjust pH to 7 with NaOH and store at -20&#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td colspan="2">For use, dilute the stock solution ~ 25 fold in embryo media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>250 &#956;M &#945;-bungarotoxin</td>
			<td></td>
			<td colspan="2">Prepare a 250 &#956;M stock in ddH2O (1 mg/500 &#956;l), prepare 100 &#181;l aliquots, and sotre at -20&#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td colspan="2">For use, dilute 2,500-fold with extracellular solution to a final concentration of 100 nM.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 mM Tetrodotoxin</td>
			<td></td>
			<td colspan="2">Prepare a 1 mM stock in ddH2O (1 mg/3 ml), prepare 100 &#181;l aliquots, and sotre at -20&#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td colspan="2">For use, dilute 2,000-fold with extracellular solution to a final concentration of 500 nM.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

zebrafish in situ spinal cord preparation for electrophysiological recordings from spinal sensory and motor neurons

ゼブラフィッシュは、最初に発達モデルとして導入、他の多くの分野で人気を得ています。急速に発展する生物の大量飼育の容易さは、胚の光学的透明性と組み合わせて、このモデルの初期の魅力的な属性を務めていました。過去20年間、このモデルの成功は、さらに大規模突然変異誘発画面へと遺伝子導入の容易さによって、その従順によって推進されてきました。さらに最近では、遺伝子編集手法は、モデルの力を高めています。 神経発達の研究のために、ゼブラフィッシュ胚及び幼虫は、複数の方法が適用可能なモデルを提供します。ここでは、神経細胞の本質的な特性、電気的興奮の研究を可能にする方法に焦点を当てています。ゼブラフィッシュ脊髄ニューロンの電気生理学的研究のための私たちの準備は、記録室への準備を確保する獣医師の縫合接着剤の使用を含みます。記録のための代替方法ゼブラフィッシュ胚および幼虫から微細なタングステンピン1、2、3、4、5を用いてチャンバに製剤の付着を含みます。最大4幼虫の背側をマウントするために使用されてきたものの、タングステンピンはほとんどの場合、横方向で準備を取り付けるために使用されます。縫合糸の接着剤は両方の向きで胚および幼生をマウントするために使用されています。接着剤を使用して、最小限の解剖は、それによってどんな結果として損傷を回避する、酵素処理を使用せずに脊髄の神経細胞へのアクセスを許可する、実行することができます。しかし、幼虫のために、脊髄の周囲の筋肉組織を除去するために簡単な酵素処理を施す必要があります。ここで説明する方法は、いくつかのdevelopmentaで運動ニューロン、介在ニューロン、及び感覚ニューロンの固有の電気的特性を研究するために使用されていますLステージ6、7、8、9。

我々が正常幼虫DPF 7を介して17個のHPF胚でRohon-ひげニューロンから記録された（ 図5Aおよび5B）。 Rohon-ベアード細胞を記録した場合、調製物は、背側を上に取り付けました。そのような実装は、その表層背側位置と大細胞体のサイズに基づいRohon-ビアード細胞の明確な同定を可能にします。識別は、さらにこれらのニューロンのステレオタイ?...

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Zebrafish In Situ Spinal Cord Preparation for Electrophysiological Recordings from Spinal Sensory and Motor Neurons

この原稿は、ゼブラフィッシュの胚および幼生の脊髄神経細胞からの電気生理学的記録のための方法を説明します。準備は、 その場で神経細胞を維持し、多くの場合、最小の切開を必要とします。これらのメソッドは、最初の電気的興奮の買収からの早期の幼虫の段階を経て、脊髄神経細胞の様々な電気生理学的研究が可能になります。

ゼブラフィッシュ<em&gt;その場での</em&gt;脊髄脊髄感覚運動ニューロンからの電気生理学的記録のための準備

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