Name: zebrafish in situ spinal cord preparation for electrophysiological recordings from spinal sensory and motor neurons
Uploaded: 2017-04-18T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Zebrafish In Situ Spinal Cord Preparation for Electrophysiological Recordings from Spinal Sensory and Motor Neurons at JoVE.com

Dette arbeid ble støttet med tilskudd fra NIH (F32 NS059120 til RLM og R01NS25217 og P30NS048154 til ABR).

Alle dyr prosedyrer ble godkjent av Institutional Animal Care og bruk Committee (IACUC, Office of Laboratory Animal Resources, University of Colorado Anschutz medisinske høyskole). 1. Sebrafisk Husbandry <ol><li> Øke og bibeholde voksne sebrafisk (Danio rerio) ved 28,5 ° C på en 10 timers mørk / 14 h lett syklus og med passende vannbehandling og utveksling 52. </li><li> Hev sebrafisk embryoer / larver ved 28,5 ° C i embryo medium inntil de når det ø...

Metodene som beskrives her muliggjør den elektriske og morfologiske karakterisering av sensoriske og motoriske nerveceller av sebrafisk embryoer etter minimal disseksjon av ryggmargen. Neuroner holde seg friske i minst 1 h, som er grensen pålegges disse opptakene. Neuroner blitt tatt opp ved bruk av standard helcellekonfigurasjonen, samt fra kjerneholdige flekker; den sistnevnte metode reduserer avstanden-clamp-problemer som kan utelukke en detaljert biofysisk studie av ionestrømmer 9. <p ...

<html> George Streisinger banebrytende bruk av Danio rerio, vanligvis kjent som sebrafisk, som et modellsystem for den genetiske analyse av virveldyr utvikling 10. Modellen gir flere fordeler, inkludert: (1) forholdsvis enkel og rimelig husdyrhold; (2) ytre befruktning, noe som gir enkel tilgang til embryoer fra de tidligste utviklingsstadier; og (3) en gjennomsiktig embryo, noe som tillater direkte og gjentatt observasjoner av celler, vev og organer som de danner. I løpet av de neste tiårene, flere fremskritt ytterligere økt effekt av sebrafisk modell. Spesielt termin genetiske skjermer og hel-genomsekvense anstrengelser vært sentrale i identifikasjon av mutasjoner og gener som er kritiske for mange utviklingsmessige prosesser 11, 12, 13, 14,&quot;&gt; 15, har 16. Gateway kloningsfremgangsmåter tillot rutinemessig anvendelse av transgene nærmer seg 17, 18. Nylige fremskritt innen genomet redigering, eksemplifisert ved transkripsjonsaktivator-lignende (Talens) og gruppert regelmessig avstandsplasserte korte palindromiske gjentagelser (CRISPR) -Cas9 nukleaser, muliggjøre målrettet innføring av mutasjoner, samt knock-out og knock-in nærmer seg 19, 20, 21, 22. Kombinert disse metoder gjør sebrafisk et kraftig modell for studiet av de genetiske mekanismer som ligger under spesiell oppførsel og en rekke menneskelige sykdommer 23, 24, 25, 26, 27. Dette arbeidet fokuserer på å utviklemental regulering og rollen til elektriske aktiviteten i neuronal utvikling. Fokuset er på ryggmargen, som sebrafisk-modellen gir flere fordeler. For det første er det relativt enkelt å få tilgang til sebrafisk på embryonale og larvestadier; Derfor kan man studere ryggmarg funksjon under utviklingsstadier som har færre nevroner og enklere kretser 28, 29. Dessuten har den sebrafisk ryggmarg et variert sett av neuroner, i likhet med andre virveldyr, som vist ved karakteristiske og karakteristiske mønster av transkripsjonsfaktorene 30, 31, 32, 33, 34, 35. De fleste studier i zebrafisk som tar sikte på å avdekke de mekanismer som ligger til grunn for funksjonen til ryggmargkretser, særligde som støtter bevegelse, er forståelig fokusert på larvestadier 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43. Imidlertid er mange av de nervecellene som danner rygg lokomotiv nettverkene initiere deres differensiering på tidlige stadier embryonale, ~ 9-10 timer etter befruktning (HPF) 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51. I lys av dette, forstå hvordan de morfologiske og elektriske egenskapene til spinal nevroner oppstår og endring mellom embryonale og larvestadier er viktig for en Overall forståelse av muskel krets dannelse og funksjon. Disseksjon metoder som er beskrevet her tillater patch clamp opptak fra spinale nerveceller, og har blitt brukt ved embryonale stadier (~ 17-48 HPF) og larvestadier (~ 3-7 dager efter befruktning [dpf]). Denne tilnærmingen begrenser mengden av disseksjon er nødvendig for å gi tilgang til nervecellene av interesse. Protokollen er forskjellig fra de fleste av de andre publiserte metoder for innspilling fra sebrafisk spinale nerveceller i den veterinær sutur lim anvendes, snarere enn en fin wolfram tapp, for å feste embryoet eller larve til opptakskammeret. Tilgjengeligheten av to forskjellige fremgangsmåter (dvs. sutur lim versus wolfram pin) for montering av sebrafisk embryoer eller larver for elektrofysiologisk analyse gir forskere med alternative muligheter for å oppnå deres spesifikke eksperimentelle mål. Først prosedyrer for tilgang til og opptak fra en pop<html> stimulering av primære sensoriske nevroner, Rohon-Beard-celler, er beskrevet. Cellelegemer av disse nevronene ligge innenfor den dorsale ryggmargen. Rohon-Beard celler eksistere i tallrike virveldyrarter, differensiere tidlig i utviklingen, og til grunn for den embryonale trykkpunkt 6, 44, 47, 48. For det andre rutiner for tilgang og opptak fra spinal motor nevroner er detaljert. Sebrafisk spinal motoriske nerveceller oppstår i løpet av to bølger av neurogenesis. De tidligere-født primære motoriske nevroner oppstår ved slutten av gastrulation (~ 9-16 HPF), med bare 3-4 primære motoriske neuroner tilstede pr hemisegment 45, 46, 49. I motsetning til dette, er det senere-fødte populasjon av sekundære motoriske nevroner mer tallrike, og det oppstår i løpet av en forlenget periode, som starter på ~ 14 HPFef &quot;&gt; 45, 50. Sekundær motoriske nevroner genese i midten av transportsegmenter er hovedsakelig fullført etter 51 HPF 50. Sekundære motoriske neuroner er ansett for å være av den motsvarende motoriske nevroner i amniotes 46. Interessant nok supraspinal neuroner, via dopamin, regulere bevegelses i larven og sekundære motoriske nevroner genese i embryo og unge larver 50, 51. primære og sekundære motoriske nevroner hver omfatter flere forskjellige subtyper. hver primære motoriske nevron subtype prosjekter en perifer nervefiber som innerverer en karakteristisk muskelgruppe, noe som resulterer i en stereotype, identifisering av aksonal bane. Vanligvis sekundære motoriske nevroner følge aksonale veier som tidligere er etablert av primær motoriske neuroner. Således, med hensyn til aksonal baner, primære og sekundære motoriske nevroner er like, med unntak av at axonal tykkelse og størrelse somata enre større for primære motoriske nevroner 45. For det tredje, er fremgangsmåter for innspilling fra noen få typer av interneuroner diskutert. I disse tilfeller er en begrenset mengde av fjerning av andre ryggmarg celler som kreves, og dermed ryggmargen er mindre enn intakt for opptak fra Rohon-Beard celler eller motoriske neuroner.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Vacuum filter/Storage bottle, 0.22 mm pore</td>
			<td>Corning</td>
			<td>431096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe filter 0.2 mm</td>
			<td>Whatman</td>
			<td>6780-2502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tricaine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A-5040</td>
			<td>Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>a-bugarotoxin</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>11032-79-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetrodotoxin</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>4368-28-9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa-549 hydrazine salt</td>
			<td>Molecular Probes</td>
			<td>A-10438</td>
			<td>fluorescent dye</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spin-X centrifuge tube filter</td>
			<td>Corning</td>
			<td>8161</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass microscope slide</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>12-550C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sylgard silicone elastomer kit</td>
			<td>Dow Corning</td>
			<td>184</td>
			<td>silicone elastomer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>351029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borosilicate glass capillaries</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>30-0038</td>
			<td>inner and outer diameters of 0.78 and 1.0 mm (thin walled glass capillaries)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borosilicate glass capillaries</td>
			<td>Drummond Scientific</td>
			<td>1-000-1000-100</td>
			<td>inner and outer diameters of 1.13 and 1.55 mm (thick walled glass capillaries)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Miniature barbed polypropylene fitting&#160;</td>
			<td>Cole-Palmer</td>
			<td>6365-90</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vetbond tissue adhesive&#160;</td>
			<td>3M</td>
			<td>1469SB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase XI</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C7657</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microelectrode puller</td>
			<td>Sutter Instruments</td>
			<td>&#160;Model P-97&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amplifier</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>Axopatch 200B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Head stage</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>CV203BU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Motorized micromanipulator&#160;&#160;</td>
			<td>Sutter Instruments</td>
			<td>MP-285</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tygon tubing</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>14-169-1B</td>
			<td>ID 1/16 IN, OD 1/8 IN and WALL 1/32 IN (flexible laboratory tubing)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrode holder</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>1-HC-U</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pharmaseal Three-Way Stopcocks&#160;</td>
			<td>Baxter</td>
			<td>K75</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digitizer</td>
			<td>Axon Instruments</td>
			<td>Digidata 1440A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted microscope&#160;</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>Axioskop2 FS plus</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40x/0.80w Achroplan objective</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Data acquisition and analysis software&#160;</td>
			<td>Axon Instruments</td>
			<td colspan="2">PClamp 10 - Clampex and Clampfit&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette puller</td>
			<td>Sutter Instruments</td>
			<td>Model P-97</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">Dissection and Recording Solutions(in mM)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">All solutions, except the intracellular, are stable for ~ 2 - 3 months when filtered (0.22 mm filter cups) and stored at room temperature (RT).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">The intracellular solution is filtered (0.2 mm syringe filters) and stored frozen (-20&#176;C) in small aliquots that are individually thawed on the day of use.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2" rowspan="1">Dissection/Ringer&#8217;s solution</td>
			<td></td>
			<td colspan="2">145 NaCl, 3 KCl, 1.8 CaCl2.2H2O, 10 HEPES; pH 7.4 (with NaOH)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">Pipette (intracellular) recording solution</td>
			<td></td>
			<td colspan="2">135 KCl, 10 EGTA-acid, 10 HEPES; pH 7.4 (with KOH).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">Bath (extracellular) recording solution/voltage and current-clamp</td>
			<td></td>
			<td colspan="2">125 NaCl, 2 KCl, 10 CaCl2.2H2O, 5 HEPES; pH 7.4 (with NaOH).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">Alexa-594 hydrazine salt stock solution.&#160;</td>
			<td></td>
			<td colspan="2">Prepare a 13.2 mM stock in ddH2O, aliquot (~ 100 &#181;l) and store at -20&#176;C. For use, dilute the stock solutiond 132 fold with pipette solution to a final concentration of 100 mM. After dilution, filter the Alexa-594 containing pipette solution&#160; with a centrifuge tube filter.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immobilizing agents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">0.4 % ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt (Tricaine)</td>
			<td></td>
			<td colspan="2">Prepare a 0.4% stock solution in 0.2M Tris, pH9 (0.4 g Tricaine/100 ml 0.2 M Tris</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td colspan="2">Adjust pH to 7 with NaOH and store at -20&#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td colspan="2">For use, dilute the stock solution ~ 25 fold in embryo media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>250 &#956;M &#945;-bungarotoxin</td>
			<td></td>
			<td colspan="2">Prepare a 250 &#956;M stock in ddH2O (1 mg/500 &#956;l), prepare 100 &#181;l aliquots, and sotre at -20&#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td colspan="2">For use, dilute 2,500-fold with extracellular solution to a final concentration of 100 nM.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 mM Tetrodotoxin</td>
			<td></td>
			<td colspan="2">Prepare a 1 mM stock in ddH2O (1 mg/3 ml), prepare 100 &#181;l aliquots, and sotre at -20&#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td colspan="2">For use, dilute 2,000-fold with extracellular solution to a final concentration of 500 nM.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

zebrafish in situ spinal cord preparation for electrophysiological recordings from spinal sensory and motor neurons

Sebrafisk, først introdusert som en utviklingsmodell, har vunnet popularitet på mange andre områder. Den enkle oppdrett av et stort antall av rask utvikling av organismer, kombinert med den embryoniske optisk klarhet, tjente som initielle overbevisende egenskaper i denne modellen. I løpet av de siste to tiårene, har suksessen med denne modellen blitt ytterligere drevet av sin amenability til store mutagenese skjermer og av den enkle transgenesis. Mer nylig har gen-redigering tilnærminger utvidet makt modellen. For nevrologiske undersøkelser, sebrafisk embryo og larve tilveiebringe en modell for hvilken flere fremgangsmåter kan anvendes. Her fokuserer vi på metoder som gjør studiet av en essensiell egenskap av nerveceller, elektrisk oppstemthet. Vår forberedelse for den elektrofysiologisk undersøkelse av sebrafisk spinalnerveceller innebærer bruk av veterinær sutur lim til feste av preparatet til et registreringskammer. Alternative metoder for opptakfra sebrafisk embryoer og larver involverer festing av preparatet til kammeret ved hjelp av en fin wolfram pinne 1, 2, 3, 4, 5. En wolfram tapp blir oftest brukt til å montere preparatet i en lateral retning, selv om det har vært brukt for å montere larver ryggsiden opp fire. Suturen limet er blitt brukt til å montere embryoer og larver i begge orienteringer. Ved hjelp av lim, kan en minimal disseksjon skal utføres, noe som gir tilgang til spinale nerveceller uten bruk av en enzymatisk behandling, for derved å unngå eventuelle skader. Men for larver, er det nødvendig å bruke en kort enzym behandling for å fjerne muskelvevet som omgir ryggmargen. Metodene som beskrives her er blitt brukt til å studere de iboende elektriske egenskapene til motoriske nevroner, interneuroner og sensoriske neuroner hos flere developmentâl trinn 6, 7, 8, 9.

Vi har nå registrert fra Rohon-Beard nevroner i 17 HPF embryoer gjennom syv dpf larver (figur 5A og 5B). Når Rohon-Beard celler ble registrert, ble preparatet montert ryggsiden opp. En slik montering gjør det mulig å entydig identifisering av Rohon-Beard celler basert på deres overfladiske dorsal stilling og store soma størrelser. Identifiseringen er i tillegg bekreftet av den stereotype hyperpolariserte hvile-membranpotensialet av disse neuronene ...

Watch this Scientific Journal Video about Zebrafish In Situ Spinal Cord Preparation for Electrophysiological Recordings from Spinal Sensory and Motor Neurons at JoVE.com

Zebrafish In Situ Spinal Cord Preparation for Electrophysiological Recordings from Spinal Sensory and Motor Neurons

Dette manuskriptet beskriver fremgangsmåter for elektrofysiologiske opptak fra spinalnerveceller sebrafisk embryoer og larver. Preparatet holder neuroner in situ og ofte innebærer minimal disseksjon. Disse fremgangsmåter tillater for den elektrofysiologisk undersøkelse av en rekke av spinalnerveceller, fra den første elektriske eksitabilitet anskaffelse gjennom de tidlige larvestadier.

sebrafisk<em&gt; In Situ</em&gt; Spinal Cord Forberedelse til Elektrofysiologiske Opptak fra Spinal sensoriske og motoriske nevroner

Zebrafish, first introduced as a developmental model, have gained popularity in many other fields. The ease of rearing large numbers of rapidly developing ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Zebrafish In Situ Spinal Cord Preparation for Electrophysiological Recordings from Spinal Sensory and Motor Neurons

Dissection and Culture of Commissural Neurons from Embryonic Spinal Cord

Commissural neurons have been widely used to investigate the mechanisms underlying axon guidance during embryonic spinal cord development. The cell bodies ...

DiI-Labeling of DRG Neurons to Study Axonal Branching in a Whole Mount Preparation of Mouse Embryonic Spinal Cord

DII-Merking av DRG Neurons til Study aksonal Avgrening i en hel Mount Utarbeidelse av Mouse Embryonic Spinal Cord

Here we  present a technique to label the trajectories of small groups of DRG neurons  into the embryonic spinal cord by diffusive staining using the ...

Spinal Cord Transection in the Larval Zebrafish

Spinal Cord tran i Larve Sebrafisk

Mammals fail in sensory and motor recovery following spinal cord injury due to lack of axonal regrowth below the level of injury as well as an inability ...

The Preparation of Oblique Spinal Cord Slices for Ventral Root Stimulation

Utarbeidelse av Oblique Spinal Cord Slices for Ventralt Root Stimulering

Electrophysiological recordings from spinal cord slices have proven to be a valuable technique to investigate a wide range of questions, from cellular to ...

Preparation of Primary Mixed Glial Cultures from Adult Mouse Spinal Cord Tissue

Utarbeidelse av Primary Mixed Glial kulturer fra Adult Mouse Spinal Cord Tissue

It has been well-accepted that spinal cord glial responses contribute significantly to the development of neuropathic pain. Tremendous information ...

Spinal Cord Neurons Isolation and Culture from Neonatal Mice

Spinal Cord Neurons Isolasjon og kultur fra neonatale mus

We present a protocol for the isolation and culture of spinal cord neurons. The neurons are obtained from neonatal C57BL/6 mice and are isolated on ...

Preparation of Acute Spinal Cord Slices for Whole-cell Patch-clamp Recording in Substantia Gelatinosa Neurons

Utarbeidelse av akutt ryggmargen skiver for hele celle Patch-klemme opptak i Substantia Gelatinosa nerveceller

Recent whole-cell patch-clamp studies from substantia gelatinosa (SG) neurons have provided a large body of information about the spinal mechanisms ...

Isolation and Culture of Oculomotor, Trochlear, and Spinal Motor Neurons from Prenatal Islmn:GFP Transgenic Mice

Isolation and Culture of Oculomotor, Trochlear, and Spinal Motor Neurons from Prenatal Islmn:GFP Transgenic Mice

Isolering og kultur av nervus, Trochlear, og spinal motor neurons fra prenatal ISLMN: GFP transgene mus

Oculomotor neurons (CN3s) and trochlear neurons (CN4s) exhibit remarkable resistance to degenerative motor neuron diseases such as amyotrophic lateral ...

Optogenetic Phase Transition of TDP-43 in Spinal Motor Neurons of Zebrafish Larvae

Optogenetisk faseovergang av TDP-43 i spinalmotor neuroner av sebrafisk larver

Abnormal protein aggregation and selective neuronal vulnerability are two major hallmarks of neurodegenerative diseases. Causal relationships between ...

A Minimally Invasive, Fast Spinal Cord Lateral Hemisection Technique for Modeling Open Spinal Cord Injuries in Rats

Open spinal cord injury techniques modeling laceration-like injuries are time-consuming and invasive because they involve laminectomy. This new technique ...