Name: zebrafish in situ spinal cord preparation for electrophysiological recordings from spinal sensory and motor neurons
Uploaded: 2017-04-18T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Zebrafish In Situ Spinal Cord Preparation for Electrophysiological Recordings from Spinal Sensory and Motor Neurons at JoVE.com

Este trabalho foi apoiado por bolsas do NIH (F32 NS059120 para RLM e R01NS25217 e P30NS048154 a ABR).

Todos os procedimentos com animais foram aprovados pelo Comitê Institucional de Animal Care and Use (IACUC; Office of Laboratory Animal Resources, Universidade do Colorado Anschutz Medical Campus). 1. Zebrafish Husbandry <ol><li> Aumentar e manter o peixe-zebra adulto (Danio rerio) a 28,5 ° C em um / 14 h ciclo de luz de 10 h de escuro e com tratamento de água apropriado e troca 52. </li><li> Elevar zebrafish embriões / larvas a 28,5 ° C em meio de emb...

Os métodos aqui descritos permitem a caracterização eléctrica e morfológica dos neurónios sensoriais e motores de embriões de peixes-zebra após dissecção mínima da medula espinhal. Neurônios permanecem saudáveis ​​por pelo menos 1 h, o limite de tempo imposto sobre essas gravações. Os neurónios foram registados utilizando a configuração de célula inteira padrão, bem como a partir de manchas nucleadas; este último método minimiza os problemas de espaço-de braçadeira que pode impedir um estudo ...

<html> George Streisinger pioneira no uso de Danio rerio, vulgarmente conhecido como peixe-zebra, como um sistema modelo para a análise genética do desenvolvimento dos vertebrados 10. O modelo oferece várias vantagens, incluindo: (1) criação de animais relativamente simples e de baixo custo; (2) a fertilização externa, permitindo um acesso fácil aos embriões desde os primeiros estádios de desenvolvimento; e (3) um embrião transparente, permitindo observações directas e repetidas de células, tecidos e órgãos, como eles formam. Ao longo das décadas que se seguiram, vários avanços aumentou ainda mais o poder do modelo peixe-zebra. Em particular, telas genéticos para a frente e os esforços de sequenciação de todo o genoma desempenharam um papel-chave na identificação de mutações e genes críticos para muitos processos de desenvolvimento 11, 12, 13, 14,&quot;&gt; 15, os métodos de clonagem 16. Gateway permitiram a aplicação de rotina transgénico se aproxima de 17, 18. Recentes avanços na edição genoma, exemplificado pelo activador da transcrição do tipo (TALENS) e agrupados repete regularmente interspaced curtas palindrómicos (CRISPR) -Cas9 nucleases, permitir a introdução alvo de mutações, bem como knock-out e knock-in se aproxima de 19, 20, 21, 22. Combinada, estes métodos fazem peixe-zebra um poderoso modelo para o estudo dos mecanismos genéticos subjacentes comportamentos específicos e várias doenças humanas 23, 24, 25, 26, 27. Este trabalho se concentra em desenvolverregulação mental e o papel da atividade elétrica no desenvolvimento neuronal. O foco é sobre a medula espinal, para os quais o modelo de peixe-zebra proporciona várias vantagens. Em primeiro lugar, é relativamente fácil de acessar peixe-zebra em estágios embrionários e larval; portanto, pode-se estudar a função da medula espinal durante os estágios de desenvolvimento que têm menos neurónios e circuitos mais simples 28, 29. Além disso, a espinal medula de peixe-zebra tem um conjunto diversificado de neurónios, semelhante a outros vertebrados, como demonstrou padrões característicos e distintivas de factores de transcrição 30, 31, 32, 33, 34, 35. A maioria dos estudos em peixes-zebra que têm como objectivo de desvendar os mecanismos subjacentes à função de circuitos da medula espinhal, especialmenteaqueles que suportam a locomoção, são compreensivelmente focada em estágios larvais 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43. No entanto, muitos dos neurónios que formam as redes locomotiva espinhais iniciar a sua diferenciação em estágios embrionários iniciais, ~ 9-10 h pós-fertilização (HPF) 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51. Em vista disso, a compreensão de como as propriedades morfológicas e eléctricas dos neurónios espinais e surgem alterações entre os estágios embrionários e larval é importante para uma overacompreensão ll de formação e função circuito locomotor. Os métodos aqui descritos permitem dissecção gravações de patch clamp de neurónios espinais e têm sido aplicados com sucesso em estágios embrionários (~ 17-48 HPF) e as fases larvares (~ 3-7 dias após a fertilização [dpf]). Esta abordagem limita a quantidade de dissecção requerida para fornecer acesso aos neurônios de interesse. O protocolo difere da maioria dos outros métodos publicados para a gravação de neurónios espinais zebrafish em que a cola veterinário sutura é utilizado, em vez de um pino de tungsténio finos, para fixar o embrião ou larva para a câmara de registo. A disponibilidade de duas abordagens diferentes (isto é, cola de sutura contra o pino de tungsténio) para a montagem dos embriões de peixe-zebra ou larvas para análise electrofisiológica fornece investigadores com opções alternativas para alcançar os seus objectivos específicos experimentais. Em primeiro lugar, os procedimentos para acessar e gravar a partir de um pop<html> ulação de neurónios sensoriais primários, células Rohon-Beard, são descritos. Os corpos celulares destes neurónios se encontram dentro da espinal medula dorsal. Existem células Rohon-Beard em numerosas espécies de vertebrados, diferenciar no início do desenvolvimento, e estão subjacentes à resposta ao toque embrionário 6, 44, 47, 48. Em segundo lugar, os procedimentos de acesso e gravação de neurónios motores espinais são detalhados. Zebrafish neurónios motores espinais surgir durante duas ondas de neurogese. Os neurónios motores primários anterior-nascidos surgem no final da gastrulação (~ 9-16 HPF), com apenas 3-4 neurónios motores primária presentes por hemisegmento 45, 46, 49. Em contraste, a população depois-nascido de neurónios motores secundários é mais numerosos e surge durante um período prolongado, a partir das ~ 14 hpfef &quot;&gt; 45, 50. Secundário neurônio motor gênese nos segmentos mid-tronco é principalmente concluída até 51 hpf 50. neurônios motores secundários são considerados a contrapartida dos neurônios motores em amniotes 46. Curiosamente, os neurônios supraespinhais, via dopamina, regular locomoção na larva e motor secundário neurónio génese no embrião e jovem larva 50, 51. neurónios motores primários e secundários compreendem cada um vários subtipos diferentes. cada motor primário projectos neurónio subtipo a de axónios periférica que inerva um grupo muscular característico, resultando em um estereotipada, identificar trajectória axonal. Geralmente, os neurónios motores secundários seguir as vias axonais previamente estabelecidos por neurónios motores primários. Assim, no que diz respeito a trajectórias axonal, os neurónios motores primária e secundária são semelhantes, com a excepção de que a espessura axonal e uma somata tamanhore maior para os neurónios motores primários 45. Em terceiro lugar, são discutidos métodos para gravação de alguns tipos de interneurônios. No entanto, nestes casos, é necessária uma limitada quantidade de remoção de outras células do cordão espinal, e, assim, a medula espinal é menos intacta do que para as gravações de células Rohon-barba ou neurónios motores.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Vacuum filter/Storage bottle, 0.22 mm pore</td>
			<td>Corning</td>
			<td>431096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe filter 0.2 mm</td>
			<td>Whatman</td>
			<td>6780-2502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tricaine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A-5040</td>
			<td>Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>a-bugarotoxin</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>11032-79-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetrodotoxin</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>4368-28-9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa-549 hydrazine salt</td>
			<td>Molecular Probes</td>
			<td>A-10438</td>
			<td>fluorescent dye</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spin-X centrifuge tube filter</td>
			<td>Corning</td>
			<td>8161</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass microscope slide</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>12-550C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sylgard silicone elastomer kit</td>
			<td>Dow Corning</td>
			<td>184</td>
			<td>silicone elastomer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>351029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borosilicate glass capillaries</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>30-0038</td>
			<td>inner and outer diameters of 0.78 and 1.0 mm (thin walled glass capillaries)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borosilicate glass capillaries</td>
			<td>Drummond Scientific</td>
			<td>1-000-1000-100</td>
			<td>inner and outer diameters of 1.13 and 1.55 mm (thick walled glass capillaries)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Miniature barbed polypropylene fitting&#160;</td>
			<td>Cole-Palmer</td>
			<td>6365-90</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vetbond tissue adhesive&#160;</td>
			<td>3M</td>
			<td>1469SB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase XI</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C7657</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microelectrode puller</td>
			<td>Sutter Instruments</td>
			<td>&#160;Model P-97&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amplifier</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>Axopatch 200B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Head stage</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>CV203BU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Motorized micromanipulator&#160;&#160;</td>
			<td>Sutter Instruments</td>
			<td>MP-285</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tygon tubing</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>14-169-1B</td>
			<td>ID 1/16 IN, OD 1/8 IN and WALL 1/32 IN (flexible laboratory tubing)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrode holder</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>1-HC-U</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pharmaseal Three-Way Stopcocks&#160;</td>
			<td>Baxter</td>
			<td>K75</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digitizer</td>
			<td>Axon Instruments</td>
			<td>Digidata 1440A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted microscope&#160;</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>Axioskop2 FS plus</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40x/0.80w Achroplan objective</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Data acquisition and analysis software&#160;</td>
			<td>Axon Instruments</td>
			<td colspan="2">PClamp 10 - Clampex and Clampfit&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette puller</td>
			<td>Sutter Instruments</td>
			<td>Model P-97</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">Dissection and Recording Solutions(in mM)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">All solutions, except the intracellular, are stable for ~ 2 - 3 months when filtered (0.22 mm filter cups) and stored at room temperature (RT).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">The intracellular solution is filtered (0.2 mm syringe filters) and stored frozen (-20&#176;C) in small aliquots that are individually thawed on the day of use.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2" rowspan="1">Dissection/Ringer&#8217;s solution</td>
			<td></td>
			<td colspan="2">145 NaCl, 3 KCl, 1.8 CaCl2.2H2O, 10 HEPES; pH 7.4 (with NaOH)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">Pipette (intracellular) recording solution</td>
			<td></td>
			<td colspan="2">135 KCl, 10 EGTA-acid, 10 HEPES; pH 7.4 (with KOH).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">Bath (extracellular) recording solution/voltage and current-clamp</td>
			<td></td>
			<td colspan="2">125 NaCl, 2 KCl, 10 CaCl2.2H2O, 5 HEPES; pH 7.4 (with NaOH).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">Alexa-594 hydrazine salt stock solution.&#160;</td>
			<td></td>
			<td colspan="2">Prepare a 13.2 mM stock in ddH2O, aliquot (~ 100 &#181;l) and store at -20&#176;C. For use, dilute the stock solutiond 132 fold with pipette solution to a final concentration of 100 mM. After dilution, filter the Alexa-594 containing pipette solution&#160; with a centrifuge tube filter.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immobilizing agents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">0.4 % ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt (Tricaine)</td>
			<td></td>
			<td colspan="2">Prepare a 0.4% stock solution in 0.2M Tris, pH9 (0.4 g Tricaine/100 ml 0.2 M Tris</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td colspan="2">Adjust pH to 7 with NaOH and store at -20&#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td colspan="2">For use, dilute the stock solution ~ 25 fold in embryo media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>250 &#956;M &#945;-bungarotoxin</td>
			<td></td>
			<td colspan="2">Prepare a 250 &#956;M stock in ddH2O (1 mg/500 &#956;l), prepare 100 &#181;l aliquots, and sotre at -20&#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td colspan="2">For use, dilute 2,500-fold with extracellular solution to a final concentration of 100 nM.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 mM Tetrodotoxin</td>
			<td></td>
			<td colspan="2">Prepare a 1 mM stock in ddH2O (1 mg/3 ml), prepare 100 &#181;l aliquots, and sotre at -20&#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td colspan="2">For use, dilute 2,000-fold with extracellular solution to a final concentration of 500 nM.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

zebrafish in situ spinal cord preparation for electrophysiological recordings from spinal sensory and motor neurons

Peixe-zebra, introduzido pela primeira vez como um modelo de desenvolvimento, ganharam popularidade em muitos outros campos. A facilidade de criação de um grande número de organismos em rápido desenvolvimento, combinada com a clareza óptica embrionário, serviu como atributos atraentes iniciais deste modelo. Ao longo das últimas duas décadas, o sucesso deste modelo foi ainda mais impulsionado por sua receptividade às telas de mutagênese em larga escala e pela facilidade de transgenia. Mais recentemente, de edição de gene abordagens ter aumentado a potência do modelo. Para os estudos do neurodesenvolvimento, o embrião do peixe-zebra e larva de fornecer um modelo para que vários métodos podem ser aplicados. Aqui, vamos nos concentrar em métodos que permitem o estudo de uma propriedade essencial de neurônios, excitabilidade elétrica. A nossa preparação para o estudo electrofisiológico de neurónios espinais zebrafish envolve o uso de cola veterinário de sutura para fixar a preparação para uma câmara de registo. Métodos alternativos para gravaçãoa partir de embriões de peixe-zebra e larvas envolver a fixação da preparação para a câmara utilizando um pino fina de tungsténio de 1, 2, 3, 4, 5. Um pino de tungsténio é mais frequentemente usado para montar a preparação de uma orientação lateral, embora tenha sido usado para montar dorso-lateral larvas até 4. A cola de sutura tem sido utilizado para montar os embriões e larvas em ambas as orientações. Usando a cola, uma dissecção mínima pode ser realizada, permitindo o acesso a neurónios espinais sem o uso de um tratamento enzimático, evitando assim qualquer dano resultante. No entanto, para as larvas, é necessário aplicar um breve tratamento com enzima para remover o tecido muscular em torno da medula espinhal. Os métodos aqui descritos têm sido utilizados para estudar as propriedades eléctricas intrínsecas de neurónios motores, interneurónios, e neurónios sensoriais em vários DevelopmentAl módulos 6, 7, 8, 9.

Temos registos com sucesso a partir de neurónios Rohon-Beard em 17 hpf embriões através 7 dpf larvas (Figura 5A e 5B). Quando as células Rohon-Beard foram registados, a preparação foi montada do lado dorsal para cima. Essa montagem permite a identificação inequívoca de células Rohon-Beard com base nas suas posições dorsais superficiais e tamanhos grandes soma. A identificação é adicionalmente confirmada pelo potencial de membrana em repous...

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Zebrafish In Situ Spinal Cord Preparation for Electrophysiological Recordings from Spinal Sensory and Motor Neurons

Este manuscrito descreve métodos para registos electrofisiolicos de neurónios espinais de embriões de peixe-zebra e larvas. A preparação mantém neurónios in situ e muitas vezes envolve a dissecção mínima. Estes métodos permitem o estudo electrofisiológico de uma variedade de neurónios espinais, a partir da aquisição inicial excitabilidade eléctrica através dos primeiros estádios larvares.

zebrafish<em&gt; In Situ</em&gt; Spinal Cord Preparação para gravações eletrofisiológicas da Spinal Sensorial e Motor Neurons

Zebrafish, first introduced as a developmental model, have gained popularity in many other fields. The ease of rearing large numbers of rapidly developing ...

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JoVE Journal

Neuroscience

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