Name: zebrafish in situ spinal cord preparation for electrophysiological recordings from spinal sensory and motor neurons
Uploaded: 2017-04-18T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Zebrafish In Situ Spinal Cord Preparation for Electrophysiological Recordings from Spinal Sensory and Motor Neurons at JoVE.com

Detta arbete har finansierats med bidrag från NIH (F32 NS059120 till RLM och R01NS25217 och P30NS048154 till ABR).

Alla djurförsök har godkänts av Institutional Animal Care och användning kommittén (IACUC, Office of Laboratory Animal Resources, University of Colorado Anschutz Medical Campus). 1. Zebrafish Husbandry <ol><li> Höja och upprätthålla vuxna zebrafisk (Danio rerio) vid 28,5 ° C på en 10 h mörker / 14 h ljuscykel och med lämplig vattenbehandling och utbyte 52. </li><li> Höja zebrafisk embryon / larver vid 28,5 ° C i embryo medium tills de når det...

De metoder som beskrivs här gör det möjligt att elektriska och morfologiska karakteriseringen av sensoriska och motoriska nervceller i zebrafiskembryon efter minimal dissektion av ryggmärgen. Nervceller förblir friska i minst 1 timme, den tidsfrist som ålagts dessa inspelningar. Neuroner har registrerats med användning av standard helcells-konfiguration, samt från kärnförsedda patchar; den senare metoden minimerar utrymmes clamp frågor som kan utesluta en detaljerad biofysiska studier av jonströmmar <sup cla...

<html> George Streisinger börjat använda sig av Danio rerio, allmänt känd som zebrafisk, som ett modellsystem för den genetiska analysen av vertebrat utveckling 10. Modellen erbjuder flera fördelar inklusive: (1) relativt enkel och billig djurhållning; (2) yttre befruktning, vilket tillåter enkel tillgång till embryon från de tidigaste utvecklingsstadierna; och (3) ett transparent embryo, vilket medger direkt och upprepade observationer av celler, vävnader och organ när de bildas. Under de följande decennierna, flera framsteg ökade ytterligare kraften i zebrafisk modell. I synnerhet, framåt genetiska skärmar och hel-genomsekvenseringsinsatser spelade nyckelroller vid identifiering av mutationer och gener som är kritiska för många utvecklingsprocesser 11, 12, 13, 14,&quot;&gt; 15, 16. Gateway kloningsmetoder har gjort att rutinmässig tillämpning av transgen närmar 17, 18. Senaste framstegen inom genomet redigering, exemplifieras av transkriptionsaktivator-liknande (Talens) och klustrade regelbundet mellanrum korta palindromiska upprepningar (CRISPR) -Cas9 nukleaser, möjliggöra den målinriktade införandet av mutationer, samt knock-out och knock-in närmar 19, 20, 21, 22. Kombinerade, dessa metoder gör zebrafisk en kraftfull modell för studier av de genetiska mekanismer som ligger bakom specifika beteenden och flera humana sjukdomar 23, 24, 25, 26, 27. Arbetet är inriktat på att utvecklamental reglering och rollen av elektrisk aktivitet i neuronal utveckling. Fokus ligger på ryggmärgen, som zebrafisk modellen ger flera fördelar. För det första är det relativt lätt att få tillgång till zebrafisk på embryonala och larvstadier; Därför kan man studera ryggmärgen funktion under utvecklingsstadier som har färre nervceller och enklare kretsar 28, 29. Dessutom har zebrafisk ryggmärgen en mångfaldig uppsättning av neuroner, liknande andra ryggradsdjur, såsom demonstreras genom karakteristiska och särskiljande mönster av transkriptionsfaktorer 30, 31, 32, 33, 34, 35. Majoriteten av studier i zebrafisk som syftar till att avslöja de mekanismer som ligger bakom funktionen hos ryggmärgskretsar, särskiltsådana som stödjer förflyttning, är förståeligt fokuserade på larvstadier 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43. Dock många av de neuroner som bildar de spinal lokomotivnäten initiera deras differentiering vid tidiga embryonala stadier, ~ 9-10 timmar efter befruktning (HPF) 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51. Mot bakgrund av detta, att förstå hur de morfologiska och elektriska egenskaperna hos ryggrads nervceller uppstår och förändringen mellan embryonala och larvstadier är viktigt för en Overall förståelse av lokomotorisk kretsbildning och funktion. De dissektion metoder som beskrivs här tillåter patch clamp-registreringar från spinala neuroner och har tillämpats med framgång på embryonala stadier (~ 17-48 HPF) och larvstadier (~ 3-7 dagar efter befruktning [dpf]). Detta tillvägagångssätt begränsar mängden dissekering som krävs för att ge tillgång till nervceller av intresse. Protokollet skiljer sig från majoriteten av de andra publicerade metoder för inspelning från zebrafisk spinala neuroner i det veterinär sutur lim används, snarare än en fin volfram stift, för att fästa embryo eller larv till inspelningen kammaren. Tillgängligheten av två olika metoder (dvs sutur lim kontra volfram stift) sörjer för montering av de zebrafisk embryon eller larver för elektrofysiologisk analys forskare med alternativa möjligheter att uppnå sina specifika experimentella mål. Först förfaranden för att få tillgång och inspelning från en pop<html> ulation av primära sensoriska neuroner, Rohon-Beard-celler, beskrivs. Cell organ dessa nervceller ligger inom rygg ryggmärgen. Rohon-Beard celler finns i många ryggradsdjur, skiljer tidigt i utvecklingen, och bakom den embryonala anslagskänslighet 6, 44, 47, 48. För det andra, förfaranden för att få tillgång och inspelning från spinal motoriska nervceller är detaljerade. Zebrafisk spinala motorneuroner uppstå under två vågor av neurogenes. De tidigare födda primära motoriska nervceller uppstår vid slutet av gastrulation (~ 9-16 HPF), med bara 3-4 primära motoriska nervceller närvarande per hemisegment 45, 46, 49. I motsats, är den senare födda befolkningen av sekundära motoriska nervceller talrikare och uppstår under en långvarig period, som börjar vid ~ 14 hpfef &quot;&gt; 45, 50. Sekundär motor neuron genesis i mitten av trunkavsnitt är oftast kompletteras med 51 HPF 50. Sekundära motomeuroner anses vara motsvarigheten av motomeuroner i amnioternas 46. Intressant supraspinala neuroner, via dopamin, reglera locomotion hos larven och sekundär motor neuron genes i embryot och unga larv 50, 51. primära och sekundära motoriska nervceller varje innefatta flera olika subtyper. varje primära motoriska neuron subtyp projekt en perifer axon som innerverar en karakteristisk muskelgrupp, vilket resulterar i en stereotyp, identifiera axonal bana. i allmänhet sekundära motoriska nervceller följer de axonala banorna tidigare fastställts av primära motoriska nervceller. Således, med avseende på axonal banor, primära och sekundära motoriska nervceller är likartade, med undantag av att axonal tjocklek och somata storlek enre större för primära motoriska neuroner 45. För det tredje, är metoder för inspelning från ett fåtal typer av interneuronen diskuteras. Emellertid, i dessa fall, är en begränsad mängd av avlägsnandet av andra ryggmärgsceller krävs, och sålunda ryggmärgen är mindre intakt än för inspelningar från Rohon-Beard celler eller motoriska nervceller.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Vacuum filter/Storage bottle, 0.22 mm pore</td>
			<td>Corning</td>
			<td>431096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe filter 0.2 mm</td>
			<td>Whatman</td>
			<td>6780-2502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tricaine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A-5040</td>
			<td>Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>a-bugarotoxin</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>11032-79-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetrodotoxin</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>4368-28-9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa-549 hydrazine salt</td>
			<td>Molecular Probes</td>
			<td>A-10438</td>
			<td>fluorescent dye</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spin-X centrifuge tube filter</td>
			<td>Corning</td>
			<td>8161</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass microscope slide</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>12-550C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sylgard silicone elastomer kit</td>
			<td>Dow Corning</td>
			<td>184</td>
			<td>silicone elastomer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>351029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borosilicate glass capillaries</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>30-0038</td>
			<td>inner and outer diameters of 0.78 and 1.0 mm (thin walled glass capillaries)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borosilicate glass capillaries</td>
			<td>Drummond Scientific</td>
			<td>1-000-1000-100</td>
			<td>inner and outer diameters of 1.13 and 1.55 mm (thick walled glass capillaries)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Miniature barbed polypropylene fitting&#160;</td>
			<td>Cole-Palmer</td>
			<td>6365-90</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vetbond tissue adhesive&#160;</td>
			<td>3M</td>
			<td>1469SB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase XI</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C7657</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microelectrode puller</td>
			<td>Sutter Instruments</td>
			<td>&#160;Model P-97&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amplifier</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>Axopatch 200B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Head stage</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>CV203BU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Motorized micromanipulator&#160;&#160;</td>
			<td>Sutter Instruments</td>
			<td>MP-285</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tygon tubing</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>14-169-1B</td>
			<td>ID 1/16 IN, OD 1/8 IN and WALL 1/32 IN (flexible laboratory tubing)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrode holder</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>1-HC-U</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pharmaseal Three-Way Stopcocks&#160;</td>
			<td>Baxter</td>
			<td>K75</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digitizer</td>
			<td>Axon Instruments</td>
			<td>Digidata 1440A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted microscope&#160;</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>Axioskop2 FS plus</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40x/0.80w Achroplan objective</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Data acquisition and analysis software&#160;</td>
			<td>Axon Instruments</td>
			<td colspan="2">PClamp 10 - Clampex and Clampfit&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette puller</td>
			<td>Sutter Instruments</td>
			<td>Model P-97</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">Dissection and Recording Solutions(in mM)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">All solutions, except the intracellular, are stable for ~ 2 - 3 months when filtered (0.22 mm filter cups) and stored at room temperature (RT).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">The intracellular solution is filtered (0.2 mm syringe filters) and stored frozen (-20&#176;C) in small aliquots that are individually thawed on the day of use.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2" rowspan="1">Dissection/Ringer&#8217;s solution</td>
			<td></td>
			<td colspan="2">145 NaCl, 3 KCl, 1.8 CaCl2.2H2O, 10 HEPES; pH 7.4 (with NaOH)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">Pipette (intracellular) recording solution</td>
			<td></td>
			<td colspan="2">135 KCl, 10 EGTA-acid, 10 HEPES; pH 7.4 (with KOH).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">Bath (extracellular) recording solution/voltage and current-clamp</td>
			<td></td>
			<td colspan="2">125 NaCl, 2 KCl, 10 CaCl2.2H2O, 5 HEPES; pH 7.4 (with NaOH).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">Alexa-594 hydrazine salt stock solution.&#160;</td>
			<td></td>
			<td colspan="2">Prepare a 13.2 mM stock in ddH2O, aliquot (~ 100 &#181;l) and store at -20&#176;C. For use, dilute the stock solutiond 132 fold with pipette solution to a final concentration of 100 mM. After dilution, filter the Alexa-594 containing pipette solution&#160; with a centrifuge tube filter.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immobilizing agents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">0.4 % ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt (Tricaine)</td>
			<td></td>
			<td colspan="2">Prepare a 0.4% stock solution in 0.2M Tris, pH9 (0.4 g Tricaine/100 ml 0.2 M Tris</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td colspan="2">Adjust pH to 7 with NaOH and store at -20&#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td colspan="2">For use, dilute the stock solution ~ 25 fold in embryo media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>250 &#956;M &#945;-bungarotoxin</td>
			<td></td>
			<td colspan="2">Prepare a 250 &#956;M stock in ddH2O (1 mg/500 &#956;l), prepare 100 &#181;l aliquots, and sotre at -20&#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td colspan="2">For use, dilute 2,500-fold with extracellular solution to a final concentration of 100 nM.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 mM Tetrodotoxin</td>
			<td></td>
			<td colspan="2">Prepare a 1 mM stock in ddH2O (1 mg/3 ml), prepare 100 &#181;l aliquots, and sotre at -20&#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td colspan="2">For use, dilute 2,000-fold with extracellular solution to a final concentration of 500 nM.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

zebrafish in situ spinal cord preparation for electrophysiological recordings from spinal sensory and motor neurons

Zebrafisk, först introducerades som en utvecklingsmodell, har vunnit popularitet på många andra områden. Lättheten att uppfödning stort antal snabbt växande organismer, i kombination med den embryonala optisk klarhet, tjänstgjorde som initiala tvingande attributen i denna modell. Under de senaste två decennierna har framgången för denna modell ytterligare drivs av dess mottaglighet för storskalig mutagenes skärmar och hur lätt genmodifiering. På senare tid har gen-redigering metoder förlängt kraften i modellen. För nerv studier, zebrafisk embryot och larv tillhandahålla en modell, till vilken flera metoder kan tillämpas. Här fokuserar vi på metoder som gör det möjligt att studera en väsentlig egenskap av nervceller, elektrisk retbarhet. Vår förberedelse för elektro studier av zebrafisk spinal nervceller innebär användning av veterinär sutur lim för att fästa beredningen till en inspelning kammare. Alternativa metoder för inspelningfrån zebrafisk embryon och larver involverar fastsättning av preparatet till kammaren med hjälp av en fin volfram stift 1, 2, 3, 4, 5. En volframstift är oftast används för att montera beredningen i en lateral riktning, även om det har använts för att montera larver dorsal-sidan uppåt 4. Suturen lim har använts för att montera embryon och larver i båda riktningarna. Med hjälp av lim, kan en minimal dissektion utföras, som ger tillgång till spinala neuroner utan användning av en enzymatisk behandling, varigenom man undviker skador uppstår. Men för larver, är det nödvändigt att tillämpa en kort enzymbehandling för att ta bort muskelvävnaden som omger ryggmärgen. De metoder som beskrivs här har använts för att studera de inneboende elektriska egenskaperna hos motoriska neuroner, interneuronen och sensoriska neuroner vid flera developmental stegen 6, 7, 8, 9.

Vi har framgångsrikt spelats in från Rohon-Beard neuroner i 17 HPF embryon genom 7 dpf larver (figur 5A och 5B). När Rohon-Beard celler registrerades, var preparatet monterade dorsal-sidan upp. Sådan montering möjliggör entydig identifiering av Rohon-Beard celler baserat på deras ytliga rygglägen och stora Soma storlekar. Identifieringen är dessutom bekräftas av den stereotypa hyperpolariserade vilande membranpotential av dessa neuroner <strong...

Watch this Scientific Journal Video about Zebrafish In Situ Spinal Cord Preparation for Electrophysiological Recordings from Spinal Sensory and Motor Neurons at JoVE.com

Zebrafish In Situ Spinal Cord Preparation for Electrophysiological Recordings from Spinal Sensory and Motor Neurons

Detta manuskript beskriver metoder för elektrofysiologiska registreringar från spinala neuroner i zebrafisk embryon och larver. Beredningen håller nervceller in situ och ofta innebär minimal dissektion. Dessa metoder medger för den elektrofysiologiska studier av en mängd olika spinala neuroner, från den inledande elektriska retbarhet förvärv genom de tidiga larvstadier.

zebrafisk<em&gt; In Situ</em&gt; Spinal Cord Förberedelse för elektrofysiologiska inspelningar från Spinal sensoriska och motoriska nervceller

Zebrafish, first introduced as a developmental model, have gained popularity in many other fields. The ease of rearing large numbers of rapidly developing ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Zebrafish In Situ Spinal Cord Preparation for Electrophysiological Recordings from Spinal Sensory and Motor Neurons

Dissection and Culture of Commissural Neurons from Embryonic Spinal Cord

Dissektion och kultur commissural neuroner från embryonala ryggmärg

Commissural neurons have been widely used to investigate the mechanisms underlying axon guidance during embryonic spinal cord development. The cell bodies ...

DiI-Labeling of DRG Neurons to Study Axonal Branching in a Whole Mount Preparation of Mouse Embryonic Spinal Cord

Dii-märkning av DRG nervceller att Studera axonal Förgrening i en hel Mount Beredning av Mouse Embryonala ryggmärg

Here we  present a technique to label the trajectories of small groups of DRG neurons  into the embryonic spinal cord by diffusive staining using the ...

Spinal Cord Transection in the Larval Zebrafish

Spinal Cord transection i Larvernas Zebrafish

Mammals fail in sensory and motor recovery following spinal cord injury due to lack of axonal regrowth below the level of injury as well as an inability ...

The Preparation of Oblique Spinal Cord Slices for Ventral Root Stimulation

Beredning av Oblique ryggmärgs skivor för ventrala Root Stimulering

Electrophysiological recordings from spinal cord slices have proven to be a valuable technique to investigate a wide range of questions, from cellular to ...

Preparation of Primary Mixed Glial Cultures from Adult Mouse Spinal Cord Tissue

Framställning av primära blandade Glial kulturer från vuxen mus ryggmärg

It has been well-accepted that spinal cord glial responses contribute significantly to the development of neuropathic pain. Tremendous information ...

Spinal Cord Neurons Isolation and Culture from Neonatal Mice

Ryggmärgsneurons isolering och kultur från neonatala möss

We present a protocol for the isolation and culture of spinal cord neurons. The neurons are obtained from neonatal C57BL/6 mice and are isolated on ...

Preparation of Acute Spinal Cord Slices for Whole-cell Patch-clamp Recording in Substantia Gelatinosa Neurons

Beredning av akut ryggmärgen skivor för hela-cell Patch-clamp inspelning i Substantia Gelatinosa nervceller

Recent whole-cell patch-clamp studies from substantia gelatinosa (SG) neurons have provided a large body of information about the spinal mechanisms ...

Isolation and Culture of Oculomotor, Trochlear, and Spinal Motor Neurons from Prenatal Islmn:GFP Transgenic Mice

Isolation and Culture of Oculomotor, Trochlear, and Spinal Motor Neurons from Prenatal Islmn:GFP Transgenic Mice

Isolering och kultur av Oculomotor, trochlear, och spinal motoriska nervceller från prenatal ISLmn: GFP transgena möss

Oculomotor neurons (CN3s) and trochlear neurons (CN4s) exhibit remarkable resistance to degenerative motor neuron diseases such as amyotrophic lateral ...

Optogenetic Phase Transition of TDP-43 in Spinal Motor Neurons of Zebrafish Larvae

Optogenetisk fasövergång av TDP-43 i spinalmotoriska nervceller av zebrafisk larver

Abnormal protein aggregation and selective neuronal vulnerability are two major hallmarks of neurodegenerative diseases. Causal relationships between ...

A Minimally Invasive, Fast Spinal Cord Lateral Hemisection Technique for Modeling Open Spinal Cord Injuries in Rats

Open spinal cord injury techniques modeling laceration-like injuries are time-consuming and invasive because they involve laminectomy. This new technique ...