Name: in vitro and in vivo assessment of t, b and myeloid cells suppressive activity and humoral responses from transplant recipients
Uploaded: 2017-08-12T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about In Vitro and In Vivo Assessment of T, B and Myeloid Cells Suppressive Activity and Humoral Responses from Transplant Recipients at JoVE.com

Dit werk werd gerealiseerd in het kader van het project Labex IGO (n ° ANR-11-LABX-0016-01), dat deel uitmaakt van het "Investissements d'Avenir" Franse regering programma beheerd door de ANR (ANR-11-LABX-0016-01) en de IHU-Cesti project gefinancierd wordt ook door de " Investissements d'Avenir"Franse regering programma, beheerd door de Franse nationale onderzoek Bureau (ANR) (ANR-10-IBHU-005). Het IHU-Cesti project wordt ook ondersteund door de Nantes Métropole en Région Pays de la Loire.

Opmerking: Alle protocollen hier door een ethisch comité zijn goedgekeurd en in een steriele wijze moeten worden uitgevoerd.
1. generatie van tolerantie in een Model van cardiale Allograft in Rat
<ol><li>
Lew.1w LEW.1A allograft procedure
	<ol>
<li>Een mannetje van de donor LEW.1W rat met behulp van Isofluraan-O2 inademing, aangevuld met 1% N2O na 5 min. plaats het dier in de dorsale decubitus, en ontsmetten van de buik met betadine te voeren een Thora...

Adoptief overdracht van totale splenocytes in een nieuw geënte ontvanger is een efficiënte manier om de aanwezigheid van regelgevende cellen veroorzaakt of versterkt door een behandeling. Host bestraling-geïnduceerde voorbijgaande lymphopenia bevordert de overleving van de cel na overdracht en vestiging van tolerantie. Bovendien laat subletale bestraling tijd voor cellen met tolerogenic eigenschappen tijdens wilt converteren naar nieuwe regelgevende cellen immuunsysteem reconstitutie, een verschijnsel genaamd besmette...

Cardiale allograft in rat is een betrouwbare orgaan transplantatie model te beoordelen tolerantie inductie behandelingen, om te ontcijferen van de mechanismen van de inductie van de tolerantie en onderhoud, en heeft het potentieel voor het opwekken van de functioneel bevoegde en dominante regulatoire cellen. De protocollen hieronder beschrijven een volledig mismatch heterotopic cardiale transplantaat van een Lewis 1W donor rat (LEW.1W, RT1u) in een Lewis 1A ontvangende rat (LEW.1A, RT1een). In deze combinatie van de graft, acute afwijzing gebeurt snel (in ongeveer 7 dagen) en gemakkelijk kan worden geëvalueerd door graft verslaan meting door middel van palpatie van de buik. Hier stellen wij drie protocollen voor het opwekken van tolerantie voor de cardiale allograft in rat. Deze modellen, tolerantie wordt geïnduceerd en/of onderhouden door verschillende regelgevende celtypes. Eerste, de blokkade van interactie CD40-CD40L interacties met een adenovirus codering van CD40Ig (AdCD40Ig) de generatie van CD8 geïnduceerde+ Tregs staat inducerende tolerantie wanneer adoptively overgedragen aan secundaire geënte ontvangers1. Bovendien, uitputting van CD8+ cellen (met anti-CD8α antilichamen) in2Bregs en RegMCs AdCD40Ig-behandelde ontvangers gegenereerd. Diepgaande analyse van CD8+ Tregs eigenschappen de sleutelrol van verschillende immunoregulerende moleculen gedefinieerd als Interleukine-34 (IL-34) en Fibroleukin-2 (FGL-2)3,4,5,6 benadrukt . Overwegende dat de overexpressie van IL-34 (met een vector van AAV) geïnduceerde Tregs door middel van de generatie van RegMCs, geïnduceerde overexpressie van FGL-2 Bregs, ten grondslag liggen aan het complexe netwerk van regulatoire cellen.
Omdat chronische afwijzing langzaam ontwikkelt en op lange termijn, is een diepgaande analyse vereist om te onderscheiden van tolerantie ten opzichte van chronische afwijzing. Graft is meestal beoordeeld op cel infiltratie, fibrose, verdikking van vasculaire muur en aanvulling C4d depositie door immunohistology7. Terwijl histologie methoden dierlijke offer vereisen of biopsie graft, hier beschrijven we een eenvoudige methode om te beoordelen van verschillende kenmerken van getolereerd allograft: de opkomst en de functie van de regulatoire cellen en de reacties van de anti-donor specifiek antilichaam van bloed monster door stroom cytometry (hier, wij gebruikten fluorescentie-activated cell sorting (FACS)).
Onderhoud van tolerantie-doorbraak tot de allograft na arrestatie van de behandeling is over het algemeen geassocieerd met de inductie van regulatoire cellen8. In de laatste decennia, studies gericht op CD4+Tregs met eenparigheid van stemmen gekenmerkt hen door de belangrijke markeringen Foxp3+,hogeCD25 en CD127-9,10,11. Ook verschillende markeringen werden toegeschreven aan CD8+ Tregs, zoals CD122+, CD28-, CD45RClage, PD1+, en Helios+ 1,12,13,14 , 15 , 16 , 17. over het jaar, de uiting van GITR, CTLA4 en cytokines (IL-10, TGFβ, IL-34, IL-35, FGL-2) werden bovendien gekoppeld aan een Treg profiel3,4,6,13, 18,19,20,21. Echter een opkomende regelgevende cel populaties, zoals Bregs, RegMCs of NKTregs, gebrek aan relevante specifieke markers. Inderdaad, Bregs zijn meestal gemeld als onvolwassen CD24+ cellen, met meervoudige CD27 expressie en soms de productie van IL-10, TGFβ of granzyme B22,23,24. De complexiteit van de myeloïde cel overdrachtslijn vereist een combinatie van verschillende markers te definiëren hun regelgevende of proinflammatoire profiel zoals CD14, CD16, CD80, CD86, interactie CD40, CD209a of CD16325,-26. Tot slot, sommige markeringen zijn gemeld bij het identificeren van NKTregs zoals CD11b+, CD27+, TGFβ+, maar meer studies nodig zijn om verdere fenotypische beschrijven ze27,28,29 ,30,31,32. Dus, bewijzen van onderdrukkende activiteit moeten legitimeren verder fenotypische beschrijving voor de identificatie van nieuwe biomarkers, nieuwe immunoregulerende bemiddelaars/mediators, en uitbreiding van het toepassingsgebied tot nieuwe celtherapieën.
Wij stellen twee complementaire methoden om te evalueren van de onderdrukkende activiteit van cellen. Ten eerste, de in vitro -methode bestaat uit het kweken van onderdrukkende cellen met gelabelde effector T cellen gestimuleerd door allogene donor antigeen presenteert cellen (APCs) op verschillende ratio's over 6 dagen en analyseren van de effector T cel proliferatie die donor-geleide immuun onderdrukking weerspiegelt. Cellen uit behandelde ratten kunnen worden vergeleken rechtstreeks met cellen van naïeve ratten en niet-behandelde geënte ratten voor onderdrukkende activiteit (of enige andere regelgevende celpopulatie), in een waaier van suppressor: effector ratio's. Bovendien, deze methode hoeft niet een transplantatie, en resultaten worden verkregen binnen 6 dagen. Ten tweede bestaat de in vivo -methode uit het overzetten van de beoogde regulatoire cellen van een behandelde rat naar een nieuw bestraalde geënte ontvanger. Terwijl B myeloïde cellen, cellen en T cellen van niet-behandelde naïef ratten zijn gewoonlijk niet voor de remming van de acute afwijzing en te verlengen graft overleving bij adoptief overdracht, cellen met medicijn onderdrukkende activiteit van behandeld-ontvangers hebben deze kenmerken 1,2,,3,,4,33. Lymphopenia geïnduceerd door bestraling van de ontvanger wordt aanbevolen om adoptively overgedragen cellen onaangetast blijven door bloed homeostase en meester gemakkelijker de immuunrespons van de anti-donor toestaan. Voor beide methoden, de besteding in vitro van allogene derden APCs of in vivo adoptief overdracht van onderdrukkende toestaan cellen ontvangers geënt met een derde-partij hart analyse van de specificiteit van de anti-donor. Overwegende dat de in-vivo -methode een groot aantal cellen, slecht vertegenwoordigd vereist kunnen cel subpopulaties gemakkelijker worden beoordeeld voor onderdrukkende activiteit in vitro33.
Humorale reacties kunnen ook worden gemeten om te beoordelen van de toestand van de tolerantie en de controle van gestuurde antilichaam reacties op antigenen van de donor. Inderdaad, tolerantie kan worden gekenmerkt door het ontbreken van humorale respons naar de donor maar behoud van de capaciteit van de geadresseerden te ontwikkelen humorale reactie op nieuwe antigenen en het behoud van geheugen reacties. Ten eerste is het beginsel van alloantibody detectie gebaseerd op de erkenning van de donor cellen door ontvangende antilichamen na incubatie van donor celtype met serum van een geënte ontvanger. Tweede, humorale antwoorden gericht aan exogene antigenen kunnen beoordeeld volgende stimulatie van langdurige tolerant ontvangers met sleutelgat Limpet hemocyanine (HC) geëmulgeerd met compleet Freund van adjuvans. De aanwezigheid van specifiek IgM en IgG antistoffen tegen antigenen kan worden gedetecteerd 4 en 13 dagen, respectievelijk na immunisatie, met enzym gekoppelde ImmunoSorbent Assay (ELISA)34. Ten derde, het behoud van immuun geheugen reacties kan worden beoordeeld door injectie van XENOGENECELLEN rode bloedcellen (RBC) dagen -7 en + 3 van transplantatie en RBC kleuring met geadresseerden serum verzameld op dagen + 8 en +17 na transplantatie. Al deze methoden toestaan voor de identificatie van immunoglobuline subtypen met behulp van specifieke secundaire antilichamen, en snelle verwerving van resultaten in minder dan 1,5 h door FACS kleuring of een paar uur door ELISA.
Ten slotte, deze protocollen zijn ontworpen voor karakterisering van transplantatie modellen, en kunnen, tot op zekere hoogte, toegepast op auto-immuunziekte modellen. De beginselen van de methode kunnen worden omgezet naar alle soorten.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>animals</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LEW.1W and LEW.1A rats</td>
			<td>Janvier Labs, France</td>
			<td></td>
			<td>8 weeks old,&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BN third party donor rats</td>
			<td>Janvier Labs, France</td>
			<td></td>
			<td>8 weeks old,&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>name</td>
			<td>company</td>
			<td>catalogue number</td>
			<td>comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AdCD40Ig</td>
			<td>Viral Vector Core, INSERM UMR 1089, Nantes, France</td>
			<td></td>
			<td>home made plasmids</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IL34-AAV</td>
			<td>Viral Vector Core, INSERM UMR 1089, Nantes, France</td>
			<td></td>
			<td>home made plasmids</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FGL2-AAV</td>
			<td>Viral Vector Core, INSERM UMR 1089, Nantes, France</td>
			<td></td>
			<td>home made plasmids</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-TCR</td>
			<td>Hybridoma from European Collection of Cell Culture, Salisbury, U.K</td>
			<td>R7/3 clone</td>
			<td>Home made culture, purification and fluororophore coupling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-CD25</td>
			<td>Hybridoma from European Collection of Cell Culture, Salisbury, U.K</td>
			<td>OX39 clone</td>
			<td>Home made culture, purification and fluororophore coupling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-CD8</td>
			<td>Hybridoma from European Collection of Cell Culture, Salisbury, U.K</td>
			<td>OX8 clone</td>
			<td>Home made culture, purification and fluororophore coupling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-CD45RA</td>
			<td>Hybridoma from European Collection of Cell Culture, Salisbury, U.K</td>
			<td>OX33 clone</td>
			<td>Home made culture, purification and fluororophore coupling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-CD161</td>
			<td>Hybridoma from European Collection of Cell Culture, Salisbury, U.K</td>
			<td>3.2.3 clone</td>
			<td>Home made culture, purification and fluororophore coupling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-CD11b/c</td>
			<td>Hybridoma from European Collection of Cell Culture, Salisbury, U.K</td>
			<td>OX42 clone</td>
			<td>Home made culture, purification and fluororophore coupling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-TCRgd</td>
			<td>Hybridoma from European Collection of Cell Culture, Salisbury, U.K</td>
			<td>V65 clone</td>
			<td>Home made culture, purification and fluororophore coupling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-CD45RC</td>
			<td>Hybridoma from European Collection of Cell Culture, Salisbury, U.K</td>
			<td>OX22 clone</td>
			<td>Home made culture, purification and fluororophore coupling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-CD4</td>
			<td>Hybridoma from European Collection of Cell Culture, Salisbury, U.K</td>
			<td>OX35 clone</td>
			<td>Home made culture, purification and fluororophore coupling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-CD45R</td>
			<td>BD Biosciences, Mountain View, CA</td>
			<td>#554881, His24 clone</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-rat IgG-FITC</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch Laboratories, INC, Baltimore, USA</td>
			<td>#112-096-071</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-rat IgG1</td>
			<td>Serotec</td>
			<td>#MCA 194</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-rat IgG2a</td>
			<td>Serotec</td>
			<td>#MCA 278</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-rat IgG2b</td>
			<td>Serotec</td>
			<td>#MCA 195</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-rat IgM-FITC</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch Laboratories, INC, Baltimore, USA</td>
			<td>#115-095-164</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>streptavidin HRP</td>
			<td>BD Biosciences, Mountain View, CA</td>
			<td>#554066</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KLH</td>
			<td>Sigma Aldrich, St. Louis, USA</td>
			<td>#9013-72-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS 1X</td>
			<td>Thermo Fisher&#160;Scientific Inc, USA</td>
			<td></td>
			<td>Phosphate Buffer Solution without calcium and magnesium,&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Sigma, Saint-Louis, USA</td>
			<td>#9005-64-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TMB substrate reagent kit</td>
			<td>BD Biosciences, Mountain View, CA</td>
			<td>#555214</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellTraceTM CFSE cell proliferation kit</td>
			<td>Thermo Fisher&#160;Scientific Inc, USA</td>
			<td>#C34554</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640 medium 1X</td>
			<td>Thermo Fisher&#160;Scientific Inc, USA</td>
			<td>#31870-025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>penicilline streptomycine</td>
			<td>Thermo Fisher&#160;Scientific Inc, USA</td>
			<td>#15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hepes Buffer</td>
			<td>Thermo Fisher&#160;Scientific Inc, USA</td>
			<td>#15630-056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>non essential amino acids</td>
			<td>Thermo Fisher&#160;Scientific Inc, USA</td>
			<td>#11140-035</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium pyruvate</td>
			<td>Thermo Fisher&#160;Scientific Inc, USA</td>
			<td>#11360-039</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 beta mercaptoethanol</td>
			<td>Sigma, Saint-Louis, USA</td>
			<td>#M3148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Proliferation Dye eFluor&#174; 450 Cell</td>
			<td>Thermo Fisher&#160;Scientific Inc, USA</td>
			<td>#65-0842-85</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamine</td>
			<td>Sigma, Saint-Louis, USA</td>
			<td>#G3126</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Thermo Fisher&#160;Scientific Inc, USA</td>
			<td>#D1306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase D</td>
			<td>Roche Diagnostics, Germany</td>
			<td>#11088882001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Sigma, Saint-Louis, USA</td>
			<td>#E5134</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl 0.9%</td>
			<td>Fresenius Kabi</td>
			<td>#B230561</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic dynabeads</td>
			<td>Dynal, Invitrogen</td>
			<td>#11033</td>
			<td>Goat anti-mouse IgG</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>One Comp eBeads</td>
			<td>Ebiosciences, San Diego, USA</td>
			<td>#01-1111-42</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Betadine</td>
			<td>Refer to the institutional guidelines</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Refer to the institutional guidelines</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Naplbuphine</td>
			<td>Refer to the institutional guidelines</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Terramycine</td>
			<td>Refer to the institutional guidelines</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buprenorphine</td>
			<td>Refer to the institutional guidelines</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Meloxicam</td>
			<td>Refer to the institutional guidelines</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Complete Freund&#39;s adjuvant</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rompun</td>
			<td>Refer to the institutional guidelines</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ringer lactate</td>
			<td>Refer to the institutional guidelines</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketamine</td>
			<td>Refer to the institutional guidelines</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Red blood cell lysis solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Dilute 8,29g NH4Cl (Sigma, Saint-Louis, USA A-9434), 1g KHCO3 (Prolabo 26 733.292) and 37.2mg EDTA (Sigma, Saint-Louis, USA E5134) in 800ml H2O. Adjust pH to 7.2-7.4 and complete to 1L with H2O.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase D</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Dilute 1g collagenase in 500 ml RPMI-1640 + 5 ml Hepes + 2% FCS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS-FCS (2%)-EDTA (0.5%)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Add 5 mL EDTA 0,1M (Sigma, Saint-Louis, USA E5134) and 20ml FCS to 1ml PBS 1X</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CFSE (Vybrant CFDA SE Cell Tracer Kit Invitrogen)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Dilute 50&#181;g (=1 vial) of CFDA SE (component A) in 90&#956;l DMSO (component B) solution to obtain a 10mM stock solution. Then, dilute stock solution at 1/20 000 in PBS 1X to obtain a 0.5&#956;M solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>complete medium for coculture</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>500ml complete RPMI-1640 medium with 5 ml Penicillin (80 unit/ml)-Steptomycin (80 mg/ml), 5 ml L-Glutamine, 5 ml Non Essential Amino Acids (100X), 5ml Pyruvate Sodium (100mM), 5 ml HEPES buffer (1M), 2.5 ml b mercaptomethanol (7 ml of 2-bmercaptoethanol stock diluted in 10 ml RPMI), 10% FCS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>name</td>
			<td>company</td>
			<td>catalog number</td>
			<td>comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>equipments</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>falcon 50ml</td>
			<td>BD Biosciences, Mountain View, CA</td>
			<td>#227261</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>falcon 15ml</td>
			<td>BD Biosciences, Mountain View, CA</td>
			<td>#188271</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sieve</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning plastic culture dishes</td>
			<td>VWR, Pessac</td>
			<td>#391-0439</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100&#181;m and 60&#181;m tissue filters</td>
			<td>Sefar NITEX, Heiden, Switzerland</td>
			<td>#03-100/44 and #03-60/35</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 wells U bottom plates for coculture</td>
			<td>&#160;Falcon U-bottom Tissue Culture plate, sterile, Corning</td>
			<td>#353077</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 wells V bottom plates for FACS staining</td>
			<td>ThermoScientifique, Danemark</td>
			<td>#249570</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 wells flat bottom ELISA plates</td>
			<td>Nunc Maxisorb</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>seringue for spleen crush</td>
			<td>BD Biosciences, Mountain View, CA</td>
			<td>#309649</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ELISA reader</td>
			<td>SPARK 10M, Tecan, Switzerland</td>
			<td>SPARK 10M, Tecan, Switzerland</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>centrifuge</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>bain marie&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>X rays irradiator</td>
			<td>Lincolshire, England</td>
			<td>Faxitron CP160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>solar agitator</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACS Canto II</td>
			<td>BD Biosciences, Mountain View, CA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACS Aria II</td>
			<td>BD Biosciences, Mountain View, CA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>magnet</td>
			<td>Thermo Fisher&#160;Scientific Inc, USA</td>
			<td>12302D</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vitro and in vivo assessment of t, b and myeloid cells suppressive activity and humoral responses from transplant recipients

De belangrijkste zorg in transplantatie is het bereiken van specifieke tolerantie door inductie van regulatoire cellen. Het begrip van tolerantie mechanismen vereist betrouwbare modellen. Hier beschrijven we modellen van tolerantie-doorbraak tot cardiale allograft in rat, veroorzaakt door blokkade van costimulatie signalen of opregulatie van immunoregulerende moleculen door genenoverdracht. Elk van deze modellen toegestaan in vivo generatie regulatoire cellen zoals regulatoire T-cellen (Tregs), regelgevende B cellen (Bregs) of regelgevende myeloïde cellen (RegMCs). In dit manuscript beschrijven we de twee aanvullende protocollen die zijn gebruikt om te identificeren en te definiëren in vitro en in vivo regelgevende cel activiteit om te bepalen hun verantwoordelijkheid in tolerantie inductie en onderhoud. Eerst een in vitro onderdrukkende assay toegestaan snelle identificatie van cellen met onderdrukkende capaciteit op effector immuunrespons op een dosis-afhankelijke wijze, en kan worden gebruikt voor verdere analyse zoals cytokine meting of cytotoxiciteit. Ten tweede, de adoptieve overdracht van cellen van een tolerante behandelde ontvanger aan een nieuw bestraalde geënte geadresseerde, benadrukt de tolerogenic eigenschappen van deze cellen in graft geregisseerd immuunresponsen beheersen en/of omzetten van nieuwe regelgevende cellen ( besmettelijke tolerantie genoemd). Deze methoden zijn niet beperkt tot cellen met bekende fenotypische markeringen en kunnen worden uitgebreid tot iedere cel bevolking. Bovendien niet donor gericht allospecificity van regelgevende cellen (een belangrijk doel in het veld) kunnen worden beoordeeld met behulp van derden donor cellen of graft in vitro of in vivo. Tot slot, om te bepalen van de capaciteit van de specifieke tolerogenic van deze regelgevende cellen, bieden wij protocollen voor de beoordeling van de humorale anti-donor antilichaam reacties en de capaciteit van de ontvanger te ontwikkelen humorale reacties tegen nieuwe of oude bekende antigenen. De modellen van tolerantie beschreven kunnen worden gebruikt om verder karakteriseren regulatoire cellen, ter identificatie van nieuwe biomarkers en immunoregulerende moleculen, en zijn aan te passen aan andere transplantatie modellen of auto-immune ziekten in knaagdieren of menselijke.

De beoordeling van de onderdrukkende activiteit na het sorteren van de APCs (Figuur 1), responder cellen en Tregs tegelijk (Figuur 2), of afzonderlijk (Figuur 4), en alle andere vermeende regelgevende cellen (Figuur 3), kan worden gedaan in vivo door directe inspuiting van de regulatoire cellen en in vitro door meting van de helderheid van de CFSE (<str...

Watch this Scientific Journal Video about In Vitro and In Vivo Assessment of T, B and Myeloid Cells Suppressive Activity and Humoral Responses from Transplant Recipients at JoVE.com

In Vitro and In Vivo Assessment of T, B and Myeloid Cells Suppressive Activity and Humoral Responses from Transplant Recipients

Hier presenteren we een protocol bij het opwekken van tolerantie in transplantatie, en beoordelen van in vitro en in vivo de onderdrukkende capaciteit van afzonderlijke cel subsets van de ontvanger en de immuunstatus van de ontvanger naar donor of exogene antigenen.

In Vitro en In Vivo beoordeling van T-, B- en myeloïde cellen onderdrukkende activiteit en humorale reacties van transplantatie ontvangers

The main concern in transplantation is to achieve specific tolerance through induction of regulatory cells. The understanding of tolerance mechanisms ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

In Vitro and In Vivo Assessment of T, B and Myeloid Cells Suppressive Activity and Humoral Responses from Transplant Recipients

Induction and Assessment of Class Switch Recombination in Purified Murine B Cells

Inductie en beoordeling van klasse Switch recombinatie in gezuiverd Murine B-cellen

Humoral immunity is the branch of the immune system maintained by B cells and mediated through the secretion of antibodies. Upon B cell activation, the ...

Retroviral Transduction of T-cell Receptors in Mouse T-cells

Retrovirale Transductie van T-cel-receptoren in Mouse T-cellen

T-cell receptors (TCRs) play a central role in the immune system. TCRs on T-cell surfaces can specifically recognize peptide antigens presented by antigen ...

piggyBac Transposon System Modification of Primary Human T Cells

piggyBac Transposon System Modification of Primary Human T Cells

piggyBac Transposon Systeem Wijziging van primaire menselijke T-cellen

The piggyBac transposon system is naturally active, originally derived from the cabbage looper moth1,2. This non-viral system is plasmid based, most ...

The Use of Fluorescent Target Arrays for Assessment of T Cell Responses In vivo

The Use of Fluorescent Target Arrays for Assessment of T Cell Responses In vivo

Het gebruik van TL-Target Arrays voor het beoordelen van de T-cel responsen<em&gt; In vivo</em

The ability to monitor T cell responses in vivo is important for the development of our understanding of the immune response and the design of ...

Derivation of T Cells In Vitro from Mouse Embryonic Stem Cells

Derivation of T Cells In Vitro from Mouse Embryonic Stem Cells

Afleiding van T cellen<em&gt; In Vitro</em&gt; Van muis embryonale stamcellen

The OP9/OP9-DL1 co-culture system has become a well-established method for deriving differentiated blood cell types from embryonic and hematopoietic ...

Measurement of In Vitro Integration Activity of HIV-1 Preintegration Complexes

Measurement of In Vitro Integration Activity of HIV-1 Preintegration Complexes

Meting van<em&gt; In Vitro</em&gt; Integratie activiteit van HIV-1 Preintegration Complexen

HIV-1 envelope proteins engage cognate receptors on the target cell surface, which leads to viral-cell membrane fusion followed by the release of the ...

The Isolation, Differentiation, and Quantification of Human Antibody-secreting B Cells from Blood: ELISpot as a Functional Readout of Humoral Immunity

De isolatie, differentiatie en kwantificering van menselijk antilichaam-uitscheidende B-cellen uit bloed: ELISpot als functionele Uitlezing van humorale immuniteit

The hallmark of humoral immunity is to generate functional ASCs, which synthesize and secrete Abs specific to an antigen (Ag), such as a pathogen, and are ...

In Vitro Differentiation of Human CD4+FOXP3+ Induced Regulatory T Cells (iTregs) from Na&#239;ve CD4+ T Cells Using a TGF-&#946;-containing Protocol

In Vitro Differentiation of Human CD4+FOXP3+ Induced Regulatory T Cells iTregs from NaÃƒÆ’Ã†'Ãƒâ€šÃ‚Â¯ve CD4+ T Cells Using a TGF-ÃƒÆ’Ã…Â½Ãƒâ€šÃ‚Â²-containing Protocol

In vitro differentiatie van humane CD4 + FOXP3 + geïnduceerde regulatoire T-cellen (iTregs) van naïeve CD4 + T cellen met behulp van een TGF-β-bevattende Protocol

Regulatory T cells (Tregs) are an integral part of peripheral tolerance, suppressing immune reactions against self-structures and thus preventing ...

Isolation of Salmonella typhimurium-containing Phagosomes from Macrophages

Isolation of Salmonella typhimurium-containing Phagosomes from Macrophages

Isolatie van Salmonella typhimurium-met Phagosomes van Macrophages

Salmonella typhimurium is a facultative intracellular bacterium that causes gastroenteritis in humans. After invasion of the lamina propria, S. ...

A Suction Blister Protocol to Study Human T-cell Recall Responses In Vivo

A Suction Blister Protocol to Study Human T-cell Recall Responses In Vivo

Een zuig Blister-Protocol om menselijke T-cel Recall reacties In Vivo te studeren

Cutaneous antigen-recall models allow for studies of human memory responses in vivo. When combined with skin suction blister (SB) induction, this model ...