Name: in vitro and in vivo assessment of t, b and myeloid cells suppressive activity and humoral responses from transplant recipients
Uploaded: 2017-08-12T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about In Vitro and In Vivo Assessment of T, B and Myeloid Cells Suppressive Activity and Humoral Responses from Transplant Recipients at JoVE.com

עבודה זו מומש בהקשר של הפרויקט Labex IGO (n ° ANR-11-LABX-0016-01) המהווה חלק מנוהל על ידי את ANR (ANR-11-LABX-0016-01) על ידי IHU-צ'סטי הפרוייקט ממומן גם על ידי התוכנית ממשלת צרפת "Investissements d'Avenir" " תוכנית ממשלת צרפת Investissements d'Avenir", מנוהלים על ידי הצרפתי הלאומי מחקר סוכנות (ANR) (ANR-10-IBHU-005). פרויקט IHU-צ'סטי נתמך גם על ידי נאנט Métropole Région פיי דה לה לואר.

הערה: כל הפרוטוקולים כאן אושרו על ידי ועדת אתית, יש לבצעו בצורה סטרילית.
1. דור של סובלנות במודל של להשתלת לב בעכברוש
<ol><li>
LEW.1W לשגרת להשתלת LEW.1A
	<ol>
<li>עזים ומתנגד זכר התורם LEW.1W עכברוש באמצעות אינהלציה איזופלוריין-O2 , בתוספת 1% N2O לאחר 5 דק במקום החיה בתוך חמצ...

העברה המאמצת של splenocytes הכולל אל נמען לאחרונה המושתל הוא דרך יעילה כדי לזהות הנוכחות של תאים תקינה הנגרמת או potentiated על ידי טיפול. הקרנה-induced lymphopenia ארעי מארח מקדמת תא ההישרדות לאחר העברת והקמת סובלנות. יתר על כן, הקרנה תת קטלני משאיר זמן עבור תאים עם מאפיינים tolerogenic כדי להמיר תאים רגולטוריים ח?...

להשתלת לב בעכברוש הוא מודל השתלת איבר אמין כדי להעריך טיפולים אינדוקציה סובלנות, לפענח את המנגנונים של סובלנות אינדוקציה ותחזוקה, ויש לו פוטנציאל לגרום תאים תקינה מבחינה פונקציונלית המוסמכת ודומיננטית. הפרוטוקולים שלהלן מתארים באופן מלא אי-התאמה הטרוטופי לב השתלה של עכברוש התורם 1W לואיס (LEW.1W, RT1u) לתוך לואיס 1A הנמען חולדה (LEW.1A, RT1). שילוב זה שתל, דחייה חריפה מתרחשת במהירות רבה (עוד 7 ימים), יכול להיות מוערך בקלות על ידי שתל להכות מדידה באמצעות מישוש הבטן. כאן אנו מציעים שלושה פרוטוקולים לזירוז עמידות בפני להשתלת לב בעכברוש. דגמים אלה, סובלנות המושרה ו/או המתוחזקים על-ידי סוגי תאים רגולטוריים שונים. קודם כל, החסימה של CD40 CD40L אינטראקציות עם אדנו קידוד CD40Ig (AdCD40Ig) המושרה הדור של CD8+ Tregs מסוגל גרימת רגישות כאשר adoptively הועבר משני הנמענים המושתל1. יתר על כן, דלדול של CD8+ תאים (עם נוגדנים anti-CD8α) נמענים שטופלו AdCD40Ig שנוצר Bregs ו- RegMCs2. ניתוח עמוק של CD8+ Tregs מאפיינים מודגש התפקיד של מספר מולקולות immunoregulatory כהגדרתו אינטרלוקין-34 (IL-34) ו- Fibroleukin-2 (FGL 2)3,4,5,6 . ואילו ביטוי של IL-34 (עם וקטור AAV) הנגרמת Tregs דרך דור של RegMCs, ביטוי של FGL-2 המושרה Bregs, שבבסיס הרשת מורכב של תאים תקינה.
כי דחייה כרונית מתפתח לאט, הוא ארוך טווח, ניתוח מעמיק נדרש כדי להבחין בין סובלנות נגד דחייה כרונית. שתל בדרך כלל שקובעת חדירה לתא, פיברוזיס, עיבוי של כלי הדם קיר וה משלים C4d תצהיר מאת פראפין7. בעוד שיטות היסטולוגיה דרוש להקריב חיה או להשתיל ביופסיה, כאן אנו מתארים שיטה פשוטה כדי להעריך את תכונות שונות של להשתלת נסבל: הופעתה והתפקוד של תאים רגולטוריים, את תגובות נוגדנים ספציפיים נגד תורם דם דוגמה מאת cytometry זרימה (כאן, השתמשנו תא לפעיל על-ידי קרינה פלואורסצנטית מיון (FACS)).
תחזוקה של סובלנות להשתלת לאחר מעצרו של הטיפול משויכת בדרך כלל תנאי הגיוס של תאים רגולטוריים8. בעשרות השנים האחרונות, מחקרים התמקדו CD4+Tregs פה אחד מאופיין אותם על ידי הסמנים מפתח Foxp3+CD25גבוהה, CD127–9,10,11. באופן דומה, סמני מספר יוחסו CD8+ Tregs, כמו CD122+, CD28-, CD45RCנמוך, PD1+, הליוס+1,12,13,14 , 15 , 16 , 17. שנים, ביטוי של GITR, CTLA4 ו ציטוקינים (IL-10, TGFβ, IL-34, IL-35, FGL-2) היו קשורים בנוסף Treg פרופיל3,4,6,13, 18,19,20,21. עם זאת, מתעוררים תא רגולטורי אוכלוסיות, כגון Bregs, RegMCs או NKTregs, חסרים סמני ספציפי רלוונטי. אכן, Bregs מדווחים בעיקר בתור לא בוגר CD24 תאים+ , עם ביטוי CD27 רב-משמעי, ולעיתים הייצור של IL-10, TGFβ או granzyme B22,23,24. המורכבות של שושלת התאים מיאלואידית דורשת שילוב של מספר סמנים להגדרת הפרופיל שלהם תקינה או proinflammatory כגון CD14, CD16, CD80, CD86, CD40, CD209a או CD16325,26. לבסוף, כמה סימונים דווחו לזהות את NKTregs כמו CD11b+, CD27+, TGFβ+, אך מחקרים נוספים נדרשים עוד יותר phenotypically לתאר אותם27,28,29 ,30,31,32. לפיכך, עדויות של המדכא פעילות נדרשים להכשיר עוד תיאור פנוטיפי לצורך זיהוי סמנים ביולוגיים חדש, מגשרים חדשים immunoregulatory, וכדי להרחיב את ההיקף לטיפולים תאים חדשים.
אנו מציעים שתי שיטות משלימות כדי להעריך את הפעילות המדכא של תאים. ראשית, השיטה במבחנה מורכב culturing מדכא תאים עם תוויות אפקטור T תאים מגורה על ידי התורם allogeneic אנטיגן הצגת תאים (נגמ שים)-יחס שונה במשך 6 ימים ולאחר ניתוח אפקטור את תא T התפשטות זה משקף מכוון תורם לדיכוי מערכת החיסון. תאים חולדות שטופלו ניתן להשוות ישירות לתאים של תמים עכברים וחולדות שאינם מטופלים המושתל מדכאים פעילות (או כל האוכלוסייה תא רגולטורי אחרים), בטווח של יחסי משתיק קול: אפקטור. יתר על כן, שיטה זו אינה דורשת כל השתלת, התוצאות מתקבלים שישה ימים. שנית, שיטת ויוו כוללת העברת תאים רגולטוריים המיועד חולדה שטופלו לנמען המושתל לקרינה לאחרונה. בעוד B תאים, התאים מיאלואידית או T תאים מחלון תמימים שאינם מטופלים עכברים לא מצליחות בדרך כלל כדי לעכב דחייה חריפה וכדי להאריך את הישרדות השתל בעת העברה המאמצת, תאים עם potentiated מדכאים פעילות של מטופלים נמענים יש תכונות אלה 1,2,3,4,33. Lymphopenia המושרה על ידי הקרנה של הנמען מומלץ לאפשר הועבר adoptively תאים כדי לא להיות מושפע דם הומאוסטזיס וכדי לשלוט בקלות רבה יותר את תגובות מערכת החיסון נגד התורם. עבור שתי השיטות, ניצול במבחנה של allogeneic צד ג' נגמ שים או ויוו העברה המאמצת של מדכא תאים לתוך נמענים הושתל בלב חיצוני לאפשר ניתוח של התורם אנטי יחודיות. בעוד השיטה ויוו דורש מספר ניכר של תאים, גרוע ייצג תא subpopulations יכול להיות בקלות רבה יותר שקובעת מדכאים פעילות במבחנה33.
ניתן גם למדוד התגובות ההורמונאלית כדי להעריך את המצב של סובלנות ואת השליטה של נוגדן מכוונת התגובות התורם אנטיגנים. אכן, סובלנות יכול להיות מאופיין על ידי העדר תגובה הומוראלית כלפי התורם אבל שימור היכולת לנמענים לפתח תגובה הומוראלית אנטיגנים חדשים ושימור הזיכרון תגובות. ראשית, עקרון alloantibody זיהוי מבוסס על זיהוי של תאי התורם באמצעות נוגדנים הנמען בעקבות דגירה של התורם סוג התא עם סרום מן הנמען המושתל. שנית, ההורמונאלית תגובות מכוונת ל אקסוגניים אנטיגנים ניתן גירוי הבאים המוערך של נמענים סובלנית לטווח ארוך עם חור המנעול מגנטיים המוציאנין (KLH) emulsified עם מלא אדג'וונט של פרוינד. הנוכחות של נוגדנים ספציפיים IgG ו- IgM נגד אנטיגנים ניתן להבחין 4 ו- 13 ימים, בהתאמה, בעקבות חיסון, אנזים מקושרים ImmunoSorbent Assay (אליסה)34. שלישית, שימור זיכרון המערכת החיסונית תגובות יכול להיות מוערך על ידי הזרקה של תאי דם אדומים xenogeneic (RBCs)-ימי-7 ו +3 השתלת RBCs מכתים עם הנמען סרום שנאספו ימים +8, +17 בעקבות השתלת. כל השיטות האלה מאפשרים זיהוי בנוגדנים יחוברו באמצעות נוגדנים ספציפיים משני, ולא רכישה מהירה של תוצאות פחות מ 1.5 h על-ידי FACS מכתים או כמה שעות מאת אליסה.
בסופו של דבר, פרוטוקולים אלה מיועדים אפיון של השתלת מודלים, והוא יכול להיות, במידה מסוימת, חלה על מודלים מחלות אוטואימוניות. העקרונות של השיטה ניתן משורבב כדי כל המינים.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>animals</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LEW.1W and LEW.1A rats</td>
			<td>Janvier Labs, France</td>
			<td></td>
			<td>8 weeks old,&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BN third party donor rats</td>
			<td>Janvier Labs, France</td>
			<td></td>
			<td>8 weeks old,&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>name</td>
			<td>company</td>
			<td>catalogue number</td>
			<td>comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AdCD40Ig</td>
			<td>Viral Vector Core, INSERM UMR 1089, Nantes, France</td>
			<td></td>
			<td>home made plasmids</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IL34-AAV</td>
			<td>Viral Vector Core, INSERM UMR 1089, Nantes, France</td>
			<td></td>
			<td>home made plasmids</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FGL2-AAV</td>
			<td>Viral Vector Core, INSERM UMR 1089, Nantes, France</td>
			<td></td>
			<td>home made plasmids</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-TCR</td>
			<td>Hybridoma from European Collection of Cell Culture, Salisbury, U.K</td>
			<td>R7/3 clone</td>
			<td>Home made culture, purification and fluororophore coupling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-CD25</td>
			<td>Hybridoma from European Collection of Cell Culture, Salisbury, U.K</td>
			<td>OX39 clone</td>
			<td>Home made culture, purification and fluororophore coupling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-CD8</td>
			<td>Hybridoma from European Collection of Cell Culture, Salisbury, U.K</td>
			<td>OX8 clone</td>
			<td>Home made culture, purification and fluororophore coupling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-CD45RA</td>
			<td>Hybridoma from European Collection of Cell Culture, Salisbury, U.K</td>
			<td>OX33 clone</td>
			<td>Home made culture, purification and fluororophore coupling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-CD161</td>
			<td>Hybridoma from European Collection of Cell Culture, Salisbury, U.K</td>
			<td>3.2.3 clone</td>
			<td>Home made culture, purification and fluororophore coupling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-CD11b/c</td>
			<td>Hybridoma from European Collection of Cell Culture, Salisbury, U.K</td>
			<td>OX42 clone</td>
			<td>Home made culture, purification and fluororophore coupling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-TCRgd</td>
			<td>Hybridoma from European Collection of Cell Culture, Salisbury, U.K</td>
			<td>V65 clone</td>
			<td>Home made culture, purification and fluororophore coupling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-CD45RC</td>
			<td>Hybridoma from European Collection of Cell Culture, Salisbury, U.K</td>
			<td>OX22 clone</td>
			<td>Home made culture, purification and fluororophore coupling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-CD4</td>
			<td>Hybridoma from European Collection of Cell Culture, Salisbury, U.K</td>
			<td>OX35 clone</td>
			<td>Home made culture, purification and fluororophore coupling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-CD45R</td>
			<td>BD Biosciences, Mountain View, CA</td>
			<td>#554881, His24 clone</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-rat IgG-FITC</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch Laboratories, INC, Baltimore, USA</td>
			<td>#112-096-071</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-rat IgG1</td>
			<td>Serotec</td>
			<td>#MCA 194</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-rat IgG2a</td>
			<td>Serotec</td>
			<td>#MCA 278</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-rat IgG2b</td>
			<td>Serotec</td>
			<td>#MCA 195</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-rat IgM-FITC</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch Laboratories, INC, Baltimore, USA</td>
			<td>#115-095-164</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>streptavidin HRP</td>
			<td>BD Biosciences, Mountain View, CA</td>
			<td>#554066</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KLH</td>
			<td>Sigma Aldrich, St. Louis, USA</td>
			<td>#9013-72-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS 1X</td>
			<td>Thermo Fisher&#160;Scientific Inc, USA</td>
			<td></td>
			<td>Phosphate Buffer Solution without calcium and magnesium,&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Sigma, Saint-Louis, USA</td>
			<td>#9005-64-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TMB substrate reagent kit</td>
			<td>BD Biosciences, Mountain View, CA</td>
			<td>#555214</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellTraceTM CFSE cell proliferation kit</td>
			<td>Thermo Fisher&#160;Scientific Inc, USA</td>
			<td>#C34554</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640 medium 1X</td>
			<td>Thermo Fisher&#160;Scientific Inc, USA</td>
			<td>#31870-025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>penicilline streptomycine</td>
			<td>Thermo Fisher&#160;Scientific Inc, USA</td>
			<td>#15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hepes Buffer</td>
			<td>Thermo Fisher&#160;Scientific Inc, USA</td>
			<td>#15630-056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>non essential amino acids</td>
			<td>Thermo Fisher&#160;Scientific Inc, USA</td>
			<td>#11140-035</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium pyruvate</td>
			<td>Thermo Fisher&#160;Scientific Inc, USA</td>
			<td>#11360-039</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 beta mercaptoethanol</td>
			<td>Sigma, Saint-Louis, USA</td>
			<td>#M3148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Proliferation Dye eFluor&#174; 450 Cell</td>
			<td>Thermo Fisher&#160;Scientific Inc, USA</td>
			<td>#65-0842-85</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamine</td>
			<td>Sigma, Saint-Louis, USA</td>
			<td>#G3126</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Thermo Fisher&#160;Scientific Inc, USA</td>
			<td>#D1306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase D</td>
			<td>Roche Diagnostics, Germany</td>
			<td>#11088882001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Sigma, Saint-Louis, USA</td>
			<td>#E5134</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl 0.9%</td>
			<td>Fresenius Kabi</td>
			<td>#B230561</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic dynabeads</td>
			<td>Dynal, Invitrogen</td>
			<td>#11033</td>
			<td>Goat anti-mouse IgG</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>One Comp eBeads</td>
			<td>Ebiosciences, San Diego, USA</td>
			<td>#01-1111-42</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Betadine</td>
			<td>Refer to the institutional guidelines</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Refer to the institutional guidelines</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Naplbuphine</td>
			<td>Refer to the institutional guidelines</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Terramycine</td>
			<td>Refer to the institutional guidelines</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buprenorphine</td>
			<td>Refer to the institutional guidelines</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Meloxicam</td>
			<td>Refer to the institutional guidelines</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Complete Freund&#39;s adjuvant</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rompun</td>
			<td>Refer to the institutional guidelines</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ringer lactate</td>
			<td>Refer to the institutional guidelines</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketamine</td>
			<td>Refer to the institutional guidelines</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Red blood cell lysis solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Dilute 8,29g NH4Cl (Sigma, Saint-Louis, USA A-9434), 1g KHCO3 (Prolabo 26 733.292) and 37.2mg EDTA (Sigma, Saint-Louis, USA E5134) in 800ml H2O. Adjust pH to 7.2-7.4 and complete to 1L with H2O.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase D</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Dilute 1g collagenase in 500 ml RPMI-1640 + 5 ml Hepes + 2% FCS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS-FCS (2%)-EDTA (0.5%)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Add 5 mL EDTA 0,1M (Sigma, Saint-Louis, USA E5134) and 20ml FCS to 1ml PBS 1X</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CFSE (Vybrant CFDA SE Cell Tracer Kit Invitrogen)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Dilute 50&#181;g (=1 vial) of CFDA SE (component A) in 90&#956;l DMSO (component B) solution to obtain a 10mM stock solution. Then, dilute stock solution at 1/20 000 in PBS 1X to obtain a 0.5&#956;M solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>complete medium for coculture</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>500ml complete RPMI-1640 medium with 5 ml Penicillin (80 unit/ml)-Steptomycin (80 mg/ml), 5 ml L-Glutamine, 5 ml Non Essential Amino Acids (100X), 5ml Pyruvate Sodium (100mM), 5 ml HEPES buffer (1M), 2.5 ml b mercaptomethanol (7 ml of 2-bmercaptoethanol stock diluted in 10 ml RPMI), 10% FCS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>name</td>
			<td>company</td>
			<td>catalog number</td>
			<td>comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>equipments</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>falcon 50ml</td>
			<td>BD Biosciences, Mountain View, CA</td>
			<td>#227261</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>falcon 15ml</td>
			<td>BD Biosciences, Mountain View, CA</td>
			<td>#188271</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sieve</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning plastic culture dishes</td>
			<td>VWR, Pessac</td>
			<td>#391-0439</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100&#181;m and 60&#181;m tissue filters</td>
			<td>Sefar NITEX, Heiden, Switzerland</td>
			<td>#03-100/44 and #03-60/35</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 wells U bottom plates for coculture</td>
			<td>&#160;Falcon U-bottom Tissue Culture plate, sterile, Corning</td>
			<td>#353077</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 wells V bottom plates for FACS staining</td>
			<td>ThermoScientifique, Danemark</td>
			<td>#249570</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 wells flat bottom ELISA plates</td>
			<td>Nunc Maxisorb</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>seringue for spleen crush</td>
			<td>BD Biosciences, Mountain View, CA</td>
			<td>#309649</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ELISA reader</td>
			<td>SPARK 10M, Tecan, Switzerland</td>
			<td>SPARK 10M, Tecan, Switzerland</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>centrifuge</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>bain marie&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>X rays irradiator</td>
			<td>Lincolshire, England</td>
			<td>Faxitron CP160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>solar agitator</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACS Canto II</td>
			<td>BD Biosciences, Mountain View, CA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACS Aria II</td>
			<td>BD Biosciences, Mountain View, CA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>magnet</td>
			<td>Thermo Fisher&#160;Scientific Inc, USA</td>
			<td>12302D</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vitro and in vivo assessment of t, b and myeloid cells suppressive activity and humoral responses from transplant recipients

החשש העיקרי של השתלת היא להשיג סובלנות ספציפי באמצעות אינדוקציה של תאים תקינה. ההבנה של מנגנונים סובלנות דורש מודלים אמינים. כאן, אנו מתארים מודלים של סובלנות להשתלת לב בראט, המושרה המצור של אותות costimulation או על ידי קולטנים upregulation של מולקולות immunoregulatory דרך העברה גנטית. כל אחד המודלים האלה מותר ויוו דור של תאים רגולטוריים כמו בתאי T רגולטוריים (Tregs), תאים B רגולטוריות (Bregs) או התאים מיאלואידית רגולטוריות (RegMCs). כתב יד זה, אנו מתארים שני פרוטוקולים משלימים השתמשו כדי לזהות ולהגדיר במבחנה ויוו תא רגולטורי פעילות כדי לקבוע אחריותם סובלנות אינדוקציה ותחזוקה. ראשית, במבחנה מדכאים assay מותר זיהוי מהיר של תאים עם קיבולת מדכאים על תגובות חיסוניות אפקטור באופן תלוי מינון, יכול לשמש עבור ניתוח נוסף כגון ציטוקין מדידה או cytotoxicity. שנית, העברת המאמצת של תאים מן הנמען המטופלים סובלנית לנמען המושתל לקרינה לאחרונה, הדגיש את המאפיינים tolerogenic של תאים אלה שליטה תגובות חיסוניות שתל ביים ו/או המרה (תאים תקינה חדשה כינה סובלנות זיהומיות). שיטות אלה אינם רק תאים עם סמנים פנוטיפי ידוע, ניתן להרחיב את כל אוכלוסיית תאים. יתר על כן, תורם ביים allospecificity של תאים תקינה (מטרה חשובה בתחום) יכול להיות מוערך על ידי באמצעות צד שלישי תורם תאי או להשתיל או בתוך חוץ גופית או ויוו. לבסוף, כדי לקבוע את הקיבולת tolerogenic ספציפיים של תאים רגולטוריים אלה, אנו מספקים פרוטוקולים כדי להעריך את התגובות ההורמונאלית נוגדן אנטי-תורם והיכולת של המטופל לפתח תגובות ההורמונאלית נגד אנטיגנים מוכרים חדשים או לשעבר. הדגמים של סובלנות המתוארת ניתן לאפיין עוד תאים רגולטוריים, לזהות סמנים חדשים, ומולקולות immunoregulatory, והם וישימה השתלת מודלים או מחלות אוטואימוניות מכרסם או אנושיים אחרים.

ההערכה של המדכא פעילות בעקבות מיון של נגמ שים (איור 1), המשיב תאים Tregs בו זמנית (איור 2), או בנפרד (איור 4), אחרים בשם רגולטוריות תאים (איור 3), יכול להיות בוצע ויוו על ידי הזרקה ישירה של תאים רגולטוריים, במב?...

Watch this Scientific Journal Video about In Vitro and In Vivo Assessment of T, B and Myeloid Cells Suppressive Activity and Humoral Responses from Transplant Recipients at JoVE.com

In Vitro and In Vivo Assessment of T, B and Myeloid Cells Suppressive Activity and Humoral Responses from Transplant Recipients

כאן, אנו מציגים פרוטוקול כדי לגרום סובלנות ב השתלת ולאחר להעריך חוץ גופית בתוך ויוו הקיבולת המדכא של תאים נפרדים קבוצות משנה של המטופל, את מצב המערכת החיסונית של המטופל כלפי התורם או אנטיגנים אקסוגני.

במבחנה In Vivo למזהמים סביבתיים T, B והתאים מיאלואידית פעילות מדכא ומענים ההורמונאלית מן המקבלים

The main concern in transplantation is to achieve specific tolerance through induction of regulatory cells. The understanding of tolerance mechanisms ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

In Vitro and In Vivo Assessment of T, B and Myeloid Cells Suppressive Activity and Humoral Responses from Transplant Recipients

Induction and Assessment of Class Switch Recombination in Purified Murine B Cells

אינדוקציה והערכה של רקומבינציה החלף מחלקה ב מטוהרים תאים B Murine

Humoral immunity is the branch of the immune system maintained by B cells and mediated through the secretion of antibodies. Upon B cell activation, the ...

Retroviral Transduction of T-cell Receptors in Mouse T-cells

התמרה retroviral של T-cell קולטנים עכבר מתאי T

T-cell receptors (TCRs) play a central role in the immune system. TCRs on T-cell surfaces can specifically recognize peptide antigens presented by antigen ...

piggyBac Transposon System Modification of Primary Human T Cells

piggyBac Transposon System Modification of Primary Human T Cells

שינוי מערכת Transposon piggyBac של תאי T אנושיים ראשוניים

The piggyBac transposon system is naturally active, originally derived from the cabbage looper moth1,2. This non-viral system is plasmid based, most ...

The Use of Fluorescent Target Arrays for Assessment of T Cell Responses In vivo

The Use of Fluorescent Target Arrays for Assessment of T Cell Responses In vivo

השימוש במערכי יעד פלורסנט להערכה של תגובות תא T<em&gt; בvivo</em

The ability to monitor T cell responses in vivo is important for the development of our understanding of the immune response and the design of ...

Derivation of T Cells In Vitro from Mouse Embryonic Stem Cells

Derivation of T Cells In Vitro from Mouse Embryonic Stem Cells

גזירה של תאי T<em&gt; במבחנה</em&gt; מתאי עכבר גזע העובריים

The OP9/OP9-DL1 co-culture system has become a well-established method for deriving differentiated blood cell types from embryonic and hematopoietic ...

Measurement of In Vitro Integration Activity of HIV-1 Preintegration Complexes

Measurement of In Vitro Integration Activity of HIV-1 Preintegration Complexes

מדידה<em&gt; במבחנה</em&gt; פעילות האינטגרציה של HIV-1 Preintegration מכלולים

HIV-1 envelope proteins engage cognate receptors on the target cell surface, which leads to viral-cell membrane fusion followed by the release of the ...

The Isolation, Differentiation, and Quantification of Human Antibody-secreting B Cells from Blood: ELISpot as a Functional Readout of Humoral Immunity

הבידוד, בידול, וכימות של האדם נוגדן מפריש תאים B מדם: ELISPOT בתור Readout פונקציונלי של חסינות הלחות

The hallmark of humoral immunity is to generate functional ASCs, which synthesize and secrete Abs specific to an antigen (Ag), such as a pathogen, and are ...

In Vitro Differentiation of Human CD4+FOXP3+ Induced Regulatory T Cells (iTregs) from Na&#239;ve CD4+ T Cells Using a TGF-&#946;-containing Protocol

In Vitro Differentiation of Human CD4+FOXP3+ Induced Regulatory T Cells iTregs from NaÃƒÆ’Ã†'Ãƒâ€šÃ‚Â¯ve CD4+ T Cells Using a TGF-ÃƒÆ’Ã…Â½Ãƒâ€šÃ‚Â²-containing Protocol

במבחנה בידול של האדם CD4 + FOXP3 + מושרה תקינה בתאי T (iTregs) מ נאיבית CD4 + T תאים באמצעות פרוטוקול TGF-β-המכיל

Regulatory T cells (Tregs) are an integral part of peripheral tolerance, suppressing immune reactions against self-structures and thus preventing ...

Isolation of Salmonella typhimurium-containing Phagosomes from Macrophages

Isolation of Salmonella typhimurium-containing Phagosomes from Macrophages

בידוד של סלמונלה typhimurium-המכיל Phagosomes של מקרופאגים

Salmonella typhimurium is a facultative intracellular bacterium that causes gastroenteritis in humans. After invasion of the lamina propria, S. ...

A Suction Blister Protocol to Study Human T-cell Recall Responses In Vivo

A Suction Blister Protocol to Study Human T-cell Recall Responses In Vivo

פרוטוקול שלפוחית היניקה לימודים אדם T-cell האחזור תגובות In Vivo

Cutaneous antigen-recall models allow for studies of human memory responses in vivo. When combined with skin suction blister (SB) induction, this model ...