Name: in vitro and in vivo assessment of t, b and myeloid cells suppressive activity and humoral responses from transplant recipients
Uploaded: 2017-08-12T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about In Vitro and In Vivo Assessment of T, B and Myeloid Cells Suppressive Activity and Humoral Responses from Transplant Recipients at JoVE.com

यह काम Labex इगो परियोजना (n ° ANR-11-LABX-0016-01) के संदर्भ में महसूस किया गया जो "Investissements d'Avenir" फ्रेंच सरकार द्वारा प्रबंधित कार्यक्रम का हिस्सा है ANR (ANR-11-LABX-0016-01) और इहु-Cesti द्वारा वित्त पोषित परियोजना द्वारा भी " Investissements d'Avenir "फ्रांसीसी सरकारी कार्यक्रम, फ्रांसीसी राष्ट्रीय अनुसंधान एजेंसी (ANR) द्वारा प्रबंधित (ANR-10-IBHU-005) । इहु-Cesti परियोजना भी नांत Métropole द्वारा समर्थित है और Région de la लॉयर भुगतान करता है ।

नोट: सभी प्रोटोकॉल यहां एक नैतिक समिति द्वारा अनुमोदित किया गया है और एक बाँझ तरीके से किया जाना चाहिए ।
1. चूहे में कार्डियक Allograft के एक मॉडल में सहिष्णुता की पीढ़ी
<ol><li>
LEW. 1W to LEW. 1a allograft सामा
	<ol>
<l...

एक नव भ्रष्टाचारी प्राप्तकर्ता में कुल splenocytes के दत्तक हस्तांतरण एक कारगर तरीका है एक उपचार द्वारा प्रेरित या potentiated विनियामक कोशिकाओं की उपस्थिति का पता लगाने के लिए है । मेजबान विकिरण प्रेरित क्षणिक lymphop...

चूहे में कार्डियक allograft सहिष्णुता प्रेरण उपचार का आकलन करने के लिए एक विश्वसनीय अंग प्रत्यारोपण मॉडल है, सहिष्णुता प्रेरण और रखरखाव के तंत्र को समझने के लिए, और कार्यात्मक रूप से सक्षम और प्रमुख नियामक कोशिकाओं को प्रेरित करने की क्षमता है । नीचे दिए गए प्रोटोकॉल एक लुईस 1W दाता चूहा (LEW. 1W, RT1यू) एक लुईस 1a प्राप्तकर्ता चूहे (LEW. 1a, RT1ए) में से एक पूरी तरह से बेमेल heterotopic हृदय भ्रष्टाचार का वर्णन । इस भ्रष्टाचार संयोजन में तीव्र अस्वीकृति तेजी से होता है (के बारे में 7 दिनों में) और आसानी से पेट की टटोलने का कार्य के माध्यम से भ्रष्टाचार की धड़कन माप द्वारा मूल्यांकन किया जा सकता है. यहाँ हम तीन प्रोटोकॉल का प्रस्ताव करने के लिए चूहे में कार्डियक allograft के लिए सहिष्णुता प्रेरित. इन मॉडलों में, सहिष्णुता प्रेरित और/या अलग विनियामक सेल प्रकार के द्वारा बनाए रखा है । सबसे पहले, CD40 के अवरुद्ध-एक एडीनोवायरस एंकोडिंग CD40Ig के साथ CD40L बातचीत (AdCD40Ig) सीडी की पीढ़ी प्रेरित जब Tregs माध्यमिक भ्रष्टाचारी प्राप्तकर्ताओं को हस्तांतरित 1सहनशीलता उत्प्रेरण में सक्षम adoptively । इसके अलावा, सीडी+ कोशिकाओं की कमी (विरोधी CD8α एंटीबॉडी के साथ) AdCD40Ig-इलाज प्राप्तकर्ताओं में Bregs और RegMCs2उत्पंन । सीडी+ Tregs गुण के दीप विश्लेषण interleukin के रूप में परिभाषित कई immunoregulatory अणुओं की महत्वपूर्ण भूमिका पर प्रकाश डाला-३४ (IL-३४) और Fibroleukin-2 (FGL-2)3,4,5,6 . IL-३४ के व्यक्त (एक AAV वेक्टर के साथ) जबकि RegMCs, FGL के एक्सप्रेस-2 प्रेरित Bregs की पीढ़ी के माध्यम से प्रेरित Tregs, विनियामक कोशिकाओं के जटिल नेटवर्क अंतर्निहित ।
क्योंकि पुरानी अस्वीकृति धीरे विकसित करता है और दीर्घकालिक है, एक में गहराई से विश्लेषण के लिए सहिष्णुता बनाम पुरानी अस्वीकृति भेद की आवश्यकता है । भ्रष्टाचार आमतौर पर सेल घुसपैठ, फाइब्रोसिस, संवहनी दीवार की और अधिक मोटा होना के लिए मूल्यांकन किया गया है और immunohistology द्वारा C4d जमाव पूरक7। जबकि प्रोटोकॉल तरीकों पशु बलिदान या भ्रष्टाचार बायोप्सी की आवश्यकता होती है, यहां हम एक सरल विधि का वर्णन करने के लिए अलग सुविधाओं का आकलन बर्दाश्त allograft: उद्भव और समारोह विनियामक कोशिकाओं और विरोधी दाता विशिष्ट एंटीबॉडी प्रतिक्रियाओं रक्त से फ्लो cytometry द्वारा नमूना (यहाँ, हम प्रतिदीप्ति-सक्रिय सेल छँटाई (FACS) का इस्तेमाल किया).
उपचार की गिरफ्तारी के बाद allograft के लिए सहिष्णुता का रखरखाव आम तौर पर विनियामक कोशिकाओं की प्रेरण8के साथ जुड़ा हुआ है । पिछले दशकों में, सीडी पर ध्यान केंद्रित अध्ययन+Tregs सर्वसंमति से उंहें प्रमुख मार्करों द्वारा विशेषता Foxp3+, CD25उच्च, और CD127-9,10,11। इसी प्रकार, कई मार्करों को सीडी+ Tregs, जैसे CD122+, CD28-, CD45RCकम, PD1+, और Helios+ 1,12,13,14 को जिम्मेदार ठहराया गया , 15 , 16 , 17. वर्षों से, GITR, CTLA4, और साइटोकिंस (il-10, TGFβ, il-३४, il-३५, FGL-2) की अभिव्यक्ति इसके अतिरिक्त एक Treg प्रोफ़ाइल3,4,6,13के लिए जुड़े थे, 18,19,20,21. हालांकि, उभरते विनियामक कोशिका आबादी, जैसे Bregs, RegMCs, या NKTregs, प्रासंगिक विशिष्ट मार्करों की कमी है । दरअसल, Bregs ज्यादातर अपरिपक्व CD24+ कोशिकाओं के रूप में सूचित कर रहे हैं, अस्पष्ट CD27 अभिव्यक्ति और कई बार आईएल के उत्पादन के साथ-10, TGFβ, या granzyme बी22,23,24. माइलॉयड कोशिका वंश की जटिलता कई मार्करों के संयोजन जैसे CD14, CD16, CD80, CD86, CD40, CD209a, या CD16325,26के रूप में अपने विनियामक या भड़काऊ प्रोफ़ाइल को परिभाषित करने की आवश्यकता है । अंत में, कुछ मार्करों CD11b+, CD27+, TGFβ+जैसे NKTregs की पहचान करने के लिए सूचित किया गया है, लेकिन अधिक अध्ययन करने के लिए आगे की जरूरत है phenotypically उन्हें वर्णन27,28,29 ,30,31,३२. इस प्रकार, दमन गतिविधि के सबूत नए immunoregulatory मध्यस्थों की पहचान के लिए आगे phenotypic विवरण वैध करने के लिए, और नए सेल चिकित्सा के लिए गुंजाइश का विस्तार करने के लिए आवश्यक हैं ।
हम दो पूरक विधियों का प्रस्ताव कोशिकाओं के दमन गतिविधि का मूल्यांकन करने के लिए । सबसे पहले, इन विट्रो विधि के साथ संवर्धन दमन कोशिकाओं के होते है लेबल के प्रभाव से प्रेरित टी कोशिकाओं allogeneic दाता प्रतिजन प्रस्तुत करने से उत्तेजित कोशिकाओं (APCs) पर विभिंन अनुपात में 6 दिन, और प्रभाव टी सेल प्रसार का विश्लेषण है कि दाता-निर्देशित प्रतिरक्षा दमन को दर्शाता है । इलाज चूहों से कोशिकाओं को सीधे की तुलना में भोली चूहों और गैर-व्यवहारीय गतिविधि के लिए (या किसी भी अंय विनियामक सेल जनसंख्या के लिए चूहों), दमन की एक श्रेणी में: प्रभाव अनुपात में किया जा सकता है । इसके अलावा, इस विधि किसी भी प्रत्यारोपण की आवश्यकता नहीं है, और परिणाम 6 दिनों के भीतर प्राप्त कर रहे हैं । दूसरा, vivo में विधि एक इलाज चूहे से एक नए विकिरणित भ्रष्टाचारी प्राप्तकर्ता के लिए लक्षित विनियामक कोशिकाओं को स्थानांतरित करने के होते हैं । जबकि बी कोशिकाओं, माइलॉयड कोशिकाओं या गैर से टी कोशिकाओं-भोले चूहों का इलाज आम तौर पर तीव्र अस्वीकृति को बाधित करने में असमर्थ हैं और दत्तक ग्रहण स्थानांतरण पर भ्रष्टाचार अस्तित्व को लंबा करने के लिए, उपचार प्राप्तकर्ताओं से potentiated दमन गतिविधि के साथ कोशिकाओं को इन विशेषताओं है 1,2,3,4,३३. प्राप्तकर्ता के विकिरण से प्रेरित Lymphopenia adoptively हस्तांतरित कोशिकाओं को रक्त homeostasis से अप्रभावित रहने के लिए और अधिक आसानी से विरोधी दाता प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं गुरु की अनुमति के लिए सिफारिश की है । दोनों तरीकों के लिए, allogeneic तीसरे पक्ष के APCs या vivo में दमन कोशिकाओं के दत्तक हस्तांतरण में एक तीसरे पक्ष के दिल के साथ भ्रष्टाचार विरोधी दाता विशिष्टता के विश्लेषण की अनुमति के इन विट्रो उपयोग । जबकि vivo में विधि कोशिकाओं की एक पर्याप्त संख्या की आवश्यकता है, खराब प्रतिनिधित्व सेल उपजनसंख्या और अधिक आसानी से इन विट्रो३३में दमन गतिविधि के लिए मूल्यांकन किया जा सकता है ।
विनोदी प्रतिक्रियाएं भी सहिष्णुता की स्थिति और दाता एंटीजन को निर्देशित एंटीबॉडी प्रतिक्रियाओं के नियंत्रण का आकलन करने के लिए मापा जा सकता है । दरअसल, सहिष्णुता दाता लेकिन प्राप्तकर्ताओं के लिए नए एंटीजन और स्मृति प्रतिक्रियाओं के संरक्षण के लिए विनोदी प्रतिक्रिया विकसित करने के लिए क्षमता के संरक्षण की ओर विनोदी प्रतिक्रिया के अभाव की विशेषता हो सकती है । सबसे पहले, alloantibody का पता लगाने के सिद्धांत एक भ्रष्टाचारी प्राप्तकर्ता से सीरम के साथ दाता कोशिका प्रकार के प्राप्तकर्ता एंटीबॉडी निंनलिखित की मशीन द्वारा दाता कोशिकाओं की मांयता पर आधारित है । दूसरा, exogenous एंटीजन को निर्देशित विनोदी प्रतिक्रियाओं कीहोल Limpet Hemocyanin (KLH) सीफाइड के साथ पूरा Freund के सहायक के साथ दीर्घकालिक सहिष्णु प्राप्तकर्ताओं की उत्तेजना के बाद मूल्यांकन किया जा सकता है । एंटीजन के खिलाफ विशिष्ट आईजीएम और आईजीजी एंटीबॉडी की उपस्थिति 4 और 13 दिन का पता लगाया जा सकता है, क्रमशः, प्रतिरक्षण के बाद, एंजाइम से जुड़े ImmunoSorbent परख (एलिसा)३४। तीसरा, प्रतिरक्षा स्मृति प्रतिक्रियाओं के संरक्षण के दिनों में xenogeneic लाल रक्त कोशिकाओं (कोशिकाओं) के इंजेक्शन द्वारा मूल्यांकन किया जा सकता-7 और प्रत्यारोपण के 3 + और प्राप्तकर्ता सीरम के साथ दाग कोशिकाओं दिनों में एकत्र + 8 और + 17 निंनलिखित ट्रांसप्लांटेशन । इन सभी तरीकों विशिष्ट माध्यमिक एंटीबॉडी का उपयोग करके immunoglobulin उपप्रकार की पहचान के लिए अनुमति देते हैं, और FACS धुंधला या एलिसा द्वारा कुछ ही घंटों से कम १.५ ज में परिणामों के तेजी से अधिग्रहण ।
अंत में, इन प्रोटोकॉल प्रत्यारोपण मॉडल के लक्षण वर्णन के लिए डिजाइन किए हैं, और हो सकता है, कुछ हद तक, स्व-प्रतिरक्षित रोग मॉडल के लिए लागू किया । विधि के सिद्धांतों को सभी प्रजातियों में स्थानांतरित किया जा सकता है ।

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>animals</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LEW.1W and LEW.1A rats</td>
			<td>Janvier Labs, France</td>
			<td></td>
			<td>8 weeks old,&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BN third party donor rats</td>
			<td>Janvier Labs, France</td>
			<td></td>
			<td>8 weeks old,&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>name</td>
			<td>company</td>
			<td>catalogue number</td>
			<td>comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AdCD40Ig</td>
			<td>Viral Vector Core, INSERM UMR 1089, Nantes, France</td>
			<td></td>
			<td>home made plasmids</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IL34-AAV</td>
			<td>Viral Vector Core, INSERM UMR 1089, Nantes, France</td>
			<td></td>
			<td>home made plasmids</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FGL2-AAV</td>
			<td>Viral Vector Core, INSERM UMR 1089, Nantes, France</td>
			<td></td>
			<td>home made plasmids</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-TCR</td>
			<td>Hybridoma from European Collection of Cell Culture, Salisbury, U.K</td>
			<td>R7/3 clone</td>
			<td>Home made culture, purification and fluororophore coupling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-CD25</td>
			<td>Hybridoma from European Collection of Cell Culture, Salisbury, U.K</td>
			<td>OX39 clone</td>
			<td>Home made culture, purification and fluororophore coupling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-CD8</td>
			<td>Hybridoma from European Collection of Cell Culture, Salisbury, U.K</td>
			<td>OX8 clone</td>
			<td>Home made culture, purification and fluororophore coupling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-CD45RA</td>
			<td>Hybridoma from European Collection of Cell Culture, Salisbury, U.K</td>
			<td>OX33 clone</td>
			<td>Home made culture, purification and fluororophore coupling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-CD161</td>
			<td>Hybridoma from European Collection of Cell Culture, Salisbury, U.K</td>
			<td>3.2.3 clone</td>
			<td>Home made culture, purification and fluororophore coupling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-CD11b/c</td>
			<td>Hybridoma from European Collection of Cell Culture, Salisbury, U.K</td>
			<td>OX42 clone</td>
			<td>Home made culture, purification and fluororophore coupling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-TCRgd</td>
			<td>Hybridoma from European Collection of Cell Culture, Salisbury, U.K</td>
			<td>V65 clone</td>
			<td>Home made culture, purification and fluororophore coupling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-CD45RC</td>
			<td>Hybridoma from European Collection of Cell Culture, Salisbury, U.K</td>
			<td>OX22 clone</td>
			<td>Home made culture, purification and fluororophore coupling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-CD4</td>
			<td>Hybridoma from European Collection of Cell Culture, Salisbury, U.K</td>
			<td>OX35 clone</td>
			<td>Home made culture, purification and fluororophore coupling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-CD45R</td>
			<td>BD Biosciences, Mountain View, CA</td>
			<td>#554881, His24 clone</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-rat IgG-FITC</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch Laboratories, INC, Baltimore, USA</td>
			<td>#112-096-071</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-rat IgG1</td>
			<td>Serotec</td>
			<td>#MCA 194</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-rat IgG2a</td>
			<td>Serotec</td>
			<td>#MCA 278</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-rat IgG2b</td>
			<td>Serotec</td>
			<td>#MCA 195</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-rat IgM-FITC</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch Laboratories, INC, Baltimore, USA</td>
			<td>#115-095-164</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>streptavidin HRP</td>
			<td>BD Biosciences, Mountain View, CA</td>
			<td>#554066</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KLH</td>
			<td>Sigma Aldrich, St. Louis, USA</td>
			<td>#9013-72-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS 1X</td>
			<td>Thermo Fisher&#160;Scientific Inc, USA</td>
			<td></td>
			<td>Phosphate Buffer Solution without calcium and magnesium,&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Sigma, Saint-Louis, USA</td>
			<td>#9005-64-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TMB substrate reagent kit</td>
			<td>BD Biosciences, Mountain View, CA</td>
			<td>#555214</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellTraceTM CFSE cell proliferation kit</td>
			<td>Thermo Fisher&#160;Scientific Inc, USA</td>
			<td>#C34554</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640 medium 1X</td>
			<td>Thermo Fisher&#160;Scientific Inc, USA</td>
			<td>#31870-025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>penicilline streptomycine</td>
			<td>Thermo Fisher&#160;Scientific Inc, USA</td>
			<td>#15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hepes Buffer</td>
			<td>Thermo Fisher&#160;Scientific Inc, USA</td>
			<td>#15630-056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>non essential amino acids</td>
			<td>Thermo Fisher&#160;Scientific Inc, USA</td>
			<td>#11140-035</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium pyruvate</td>
			<td>Thermo Fisher&#160;Scientific Inc, USA</td>
			<td>#11360-039</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 beta mercaptoethanol</td>
			<td>Sigma, Saint-Louis, USA</td>
			<td>#M3148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Proliferation Dye eFluor&#174; 450 Cell</td>
			<td>Thermo Fisher&#160;Scientific Inc, USA</td>
			<td>#65-0842-85</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamine</td>
			<td>Sigma, Saint-Louis, USA</td>
			<td>#G3126</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Thermo Fisher&#160;Scientific Inc, USA</td>
			<td>#D1306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase D</td>
			<td>Roche Diagnostics, Germany</td>
			<td>#11088882001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Sigma, Saint-Louis, USA</td>
			<td>#E5134</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl 0.9%</td>
			<td>Fresenius Kabi</td>
			<td>#B230561</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic dynabeads</td>
			<td>Dynal, Invitrogen</td>
			<td>#11033</td>
			<td>Goat anti-mouse IgG</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>One Comp eBeads</td>
			<td>Ebiosciences, San Diego, USA</td>
			<td>#01-1111-42</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Betadine</td>
			<td>Refer to the institutional guidelines</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Refer to the institutional guidelines</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Naplbuphine</td>
			<td>Refer to the institutional guidelines</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Terramycine</td>
			<td>Refer to the institutional guidelines</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buprenorphine</td>
			<td>Refer to the institutional guidelines</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Meloxicam</td>
			<td>Refer to the institutional guidelines</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Complete Freund&#39;s adjuvant</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rompun</td>
			<td>Refer to the institutional guidelines</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ringer lactate</td>
			<td>Refer to the institutional guidelines</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketamine</td>
			<td>Refer to the institutional guidelines</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Red blood cell lysis solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Dilute 8,29g NH4Cl (Sigma, Saint-Louis, USA A-9434), 1g KHCO3 (Prolabo 26 733.292) and 37.2mg EDTA (Sigma, Saint-Louis, USA E5134) in 800ml H2O. Adjust pH to 7.2-7.4 and complete to 1L with H2O.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase D</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Dilute 1g collagenase in 500 ml RPMI-1640 + 5 ml Hepes + 2% FCS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS-FCS (2%)-EDTA (0.5%)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Add 5 mL EDTA 0,1M (Sigma, Saint-Louis, USA E5134) and 20ml FCS to 1ml PBS 1X</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CFSE (Vybrant CFDA SE Cell Tracer Kit Invitrogen)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Dilute 50&#181;g (=1 vial) of CFDA SE (component A) in 90&#956;l DMSO (component B) solution to obtain a 10mM stock solution. Then, dilute stock solution at 1/20 000 in PBS 1X to obtain a 0.5&#956;M solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>complete medium for coculture</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>500ml complete RPMI-1640 medium with 5 ml Penicillin (80 unit/ml)-Steptomycin (80 mg/ml), 5 ml L-Glutamine, 5 ml Non Essential Amino Acids (100X), 5ml Pyruvate Sodium (100mM), 5 ml HEPES buffer (1M), 2.5 ml b mercaptomethanol (7 ml of 2-bmercaptoethanol stock diluted in 10 ml RPMI), 10% FCS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>name</td>
			<td>company</td>
			<td>catalog number</td>
			<td>comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>equipments</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>falcon 50ml</td>
			<td>BD Biosciences, Mountain View, CA</td>
			<td>#227261</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>falcon 15ml</td>
			<td>BD Biosciences, Mountain View, CA</td>
			<td>#188271</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sieve</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning plastic culture dishes</td>
			<td>VWR, Pessac</td>
			<td>#391-0439</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100&#181;m and 60&#181;m tissue filters</td>
			<td>Sefar NITEX, Heiden, Switzerland</td>
			<td>#03-100/44 and #03-60/35</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 wells U bottom plates for coculture</td>
			<td>&#160;Falcon U-bottom Tissue Culture plate, sterile, Corning</td>
			<td>#353077</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 wells V bottom plates for FACS staining</td>
			<td>ThermoScientifique, Danemark</td>
			<td>#249570</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 wells flat bottom ELISA plates</td>
			<td>Nunc Maxisorb</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>seringue for spleen crush</td>
			<td>BD Biosciences, Mountain View, CA</td>
			<td>#309649</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ELISA reader</td>
			<td>SPARK 10M, Tecan, Switzerland</td>
			<td>SPARK 10M, Tecan, Switzerland</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>centrifuge</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>bain marie&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>X rays irradiator</td>
			<td>Lincolshire, England</td>
			<td>Faxitron CP160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>solar agitator</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACS Canto II</td>
			<td>BD Biosciences, Mountain View, CA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACS Aria II</td>
			<td>BD Biosciences, Mountain View, CA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>magnet</td>
			<td>Thermo Fisher&#160;Scientific Inc, USA</td>
			<td>12302D</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vitro and in vivo assessment of t, b and myeloid cells suppressive activity and humoral responses from transplant recipients

प्रत्यारोपण में मुख्य चिंता विनियामक कोशिकाओं के प्रेरण के माध्यम से विशिष्ट सहिष्णुता को प्राप्त करने के लिए है । सहिष्णुता तंत्र की समझ विश्वसनीय मॉडलों की आवश्यकता है । यहां, हम चूहे में कार्डियक allograft के लिए सहिष्णुता के मॉडल का वर्णन, costimulation संकेतों की नाकाबंदी द्वारा प्रेरित या जीन हस्तांतरण के माध्यम से immunoregulatory अणुओं के विनियमन द्वारा । इन मॉडलों में से प्रत्येक में vivo उत्पादन विनियामक कोशिकाओं जैसे नियामक टी कोशिकाओं (Tregs), विनियामक बी सेल (Bregs) या विनियामक माइलॉयड कोशिकाओं (RegMCs) की अनुमति दी । इस पांडुलिपि में, हम दो पूरक प्रोटोकॉल है कि पहचान और इन विट्रो में परिभाषित करने के लिए इस्तेमाल किया गया है का वर्णन और vivo विनियामक सेल गतिविधि में सहिष्णुता प्रेरण और रखरखाव में अपनी जिंमेदारी का निर्धारण करने के लिए। सबसे पहले, एक इन विट्रो दमन परख एक खुराक निर्भर तरीके में प्रभाव प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं पर दमन क्षमता के साथ कोशिकाओं की तेजी से पहचान की अनुमति दी, और cytokine माप या cytotoxicity के रूप में आगे विश्लेषण के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । दूसरा, एक नव विकिरणित भ्रष्टाचारी प्राप्तकर्ता को एक सहिष्णु इलाज प्राप्तकर्ता से कोशिकाओं के दत्तक हस्तांतरण, भ्रष्टाचार को नियंत्रित करने में इन कोशिकाओं के tolerogenic गुणों पर प्रकाश डाला प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं का निर्देशन किया और/ संक्रामक सहिष्णुता का कार्यकाल) । इन पद्धतियों ज्ञात phenotypic मार्करों के साथ कोशिकाओं तक ही सीमित नहीं है और किसी भी सेल जनसंख्या के लिए बढ़ाया जा सकता है । इसके अलावा, दाता विनियामक कोशिकाओं के allospecificity निर्देशित (क्षेत्र में एक महत्वपूर्ण लक्ष्य) तृतीय पक्ष दाता कोशिकाओं या या तो इन विट्रो में या vivo मेंभ्रष्टाचार का उपयोग करके मूल्यांकन किया जा सकता है । अंत में, इन विनियामक कक्षों की विशिष्ट tolerogenic क्षमता का निर्धारण करने के लिए, हम नए या पूर्व ज्ञात एंटीजन के विरुद्ध विनोदी प्रतिक्रियाओं को विकसित करने के लिए विनोदी विरोधी दाता एंटीबॉडी प्रतिक्रियाओं और प्राप्तकर्ता की क्षमता का आकलन करने के लिए प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं । वर्णित सहिष्णुता के मॉडल को आगे विनियामक कोशिकाओं की विशेषता इस्तेमाल किया जा सकता है, नए मार्क्स की पहचान करने के लिए, और immunoregulatory अणुओं, और अंय प्रत्यारोपण मॉडल या मूषक या मानव में स्व-प्रतिरक्षित रोगों के लिए अनुकूलनीय हैं ।

APCs (चित्रा 1), उत्तरदाता कोशिकाओं और Tregs एक साथ (चित्रा 2), या व्यक्तिगत रूप से (चित्रा 4), और किसी भी अन्य ख्यात विनियामक कोशिकाओं (चित्रा 3), हो सकता है क?...

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In Vitro and In Vivo Assessment of T, B and Myeloid Cells Suppressive Activity and Humoral Responses from Transplant Recipients

यहाँ, हम प्रत्यारोपण में सहिष्णुता प्रेरित करने के लिए एक प्रोटोकॉल मौजूद है, और इन विट्रो में आकलन और vivo में प्राप्तकर्ता से अलग सेल सबसेट की दमन क्षमता और दाता या exogenous एंटीजन की ओर प्राप्तकर्ता की प्रतिरक्षा स्थिति.

इन विट्रो में और टी, बी और माइलॉयड कोशिकाओं की दमन गतिविधि और प्रत्यारोपण प्राप्तकर्ताओं से विनोदी प्रतिक्रियाओं के Vivo आकलन में

The main concern in transplantation is to achieve specific tolerance through induction of regulatory cells. The understanding of tolerance mechanisms ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

In Vitro and In Vivo Assessment of T, B and Myeloid Cells Suppressive Activity and Humoral Responses from Transplant Recipients

Induction and Assessment of Class Switch Recombination in Purified Murine B Cells

प्रेरण और murine बी कक्ष शुद्ध में कक्षा स्विच पुनर्संयोजन के मूल्यांकन

Humoral immunity is the branch of the immune system maintained by B cells and mediated through the secretion of antibodies. Upon B cell activation, the ...

Retroviral Transduction of T-cell Receptors in Mouse T-cells

माउस टी कोशिकाओं में टी सेल रिसेप्टर्स की रेट्रोवायरल transduction

T-cell receptors (TCRs) play a central role in the immune system. TCRs on T-cell surfaces can specifically recognize peptide antigens presented by antigen ...

piggyBac Transposon System Modification of Primary Human T Cells

piggyBac Transposon System Modification of Primary Human T Cells

प्राथमिक मानव टी कोशिकाओं की piggyBac Transposon सिस्टम संशोधन

The piggyBac transposon system is naturally active, originally derived from the cabbage looper moth1,2. This non-viral system is plasmid based, most ...

The Use of Fluorescent Target Arrays for Assessment of T Cell Responses In vivo

The Use of Fluorescent Target Arrays for Assessment of T Cell Responses In vivo

टी सेल प्रतिक्रिया के मूल्यांकन के लिए फ्लोरोसेंट लक्ष्य सारणियों का प्रयोग करें<em&gt; में विवो</em

The ability to monitor T cell responses in vivo is important for the development of our understanding of the immune response and the design of ...

Derivation of T Cells In Vitro from Mouse Embryonic Stem Cells

Derivation of T Cells In Vitro from Mouse Embryonic Stem Cells

टी कोशिकाओं की व्युत्पत्ति<em&gt; इन विट्रो</em&gt; माउस भ्रूणीय स्टेम कोशिकाओं से

The OP9/OP9-DL1 co-culture system has become a well-established method for deriving differentiated blood cell types from embryonic and hematopoietic ...

Measurement of In Vitro Integration Activity of HIV-1 Preintegration Complexes

Measurement of In Vitro Integration Activity of HIV-1 Preintegration Complexes

का नाप<em&gt; इन विट्रो</em&gt; एचआईवी -1 Preintegration परिसर की एकता गतिविधि

HIV-1 envelope proteins engage cognate receptors on the target cell surface, which leads to viral-cell membrane fusion followed by the release of the ...

The Isolation, Differentiation, and Quantification of Human Antibody-secreting B Cells from Blood: ELISpot as a Functional Readout of Humoral Immunity

Humoral प्रतिरक्षण के एक कार्यात्मक readout के रूप में ELISPOT: अलगाव, भेदभाव, और मानव की मात्रा रक्त से एंटीबॉडी स्रावित बी प्रकोष्ठों

The hallmark of humoral immunity is to generate functional ASCs, which synthesize and secrete Abs specific to an antigen (Ag), such as a pathogen, and are ...

In Vitro Differentiation of Human CD4+FOXP3+ Induced Regulatory T Cells (iTregs) from Na&#239;ve CD4+ T Cells Using a TGF-&#946;-containing Protocol

In Vitro Differentiation of Human CD4+FOXP3+ Induced Regulatory T Cells iTregs from NaÃƒÆ’Ã†'Ãƒâ€šÃ‚Â¯ve CD4+ T Cells Using a TGF-ÃƒÆ’Ã…Â½Ãƒâ€šÃ‚Â²-containing Protocol

भोले सीडी 4 + टी कोशिकाओं से मानव सीडी 4 + Foxp3 + प्रेरित विनियामक टी कोशिकाओं (iTregs) एक TGF-β युक्त प्रोटोकॉल का उपयोग की इन विट्रो भेदभाव में

Regulatory T cells (Tregs) are an integral part of peripheral tolerance, suppressing immune reactions against self-structures and thus preventing ...

Isolation of Salmonella typhimurium-containing Phagosomes from Macrophages

Isolation of Salmonella typhimurium-containing Phagosomes from Macrophages

अलगाव साल्मोनेला typhimurium-मैक्रोफेज से युक्त Phagosomes का

Salmonella typhimurium is a facultative intracellular bacterium that causes gastroenteritis in humans. After invasion of the lamina propria, S. ...

A Suction Blister Protocol to Study Human T-cell Recall Responses In Vivo

A Suction Blister Protocol to Study Human T-cell Recall Responses In Vivo

Vivo में मानव टी सेल याद प्रतिक्रियाओं का अध्ययन करने के लिए एक चूषण छाला प्रोटोकॉल

Cutaneous antigen-recall models allow for studies of human memory responses in vivo. When combined with skin suction blister (SB) induction, this model ...