Name: a simple method to identify kinases that regulate embryonic stem cell pluripotency by high-throughput inhibitor screening
Uploaded: 2017-05-12T12:30:00
Duration: 7 min 18 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Simple Method to Identify Kinases That Regulate Embryonic Stem Cell Pluripotency by High-throughput Inhibitor Screening at JoVE.com

CACW נתמך על ידי דוקטורט המועצה למחקר רפואי PhD. GMF נתמך בחלקו על ידי מחקר רפואי המועצה פרס חדש החוקר (MR / N000609 / 1) ומענק מחקר Tenovus סקוטלנד.

1. איסוף של קטן מולקולה Kinase מעכבי ספריות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> איסוף ספריות מעכבות מאוספי מעכבי קינאז נגישים לציבור, כגון ספריית הרשתות המשולבות מבוססות רשת (LINCS) מבית הספר לרפואה של הרווארד, אוסף ממוקד של 228 מעכבי קינאז רבי עוצמה וסלקטיביים (http://lincs.hms.harvard.edu) , ואת Proinin Kinase inhibitor Set (PKIS), אוסף 376 המתחם התאספו על ידי חוקרים תעשייתיים (https://www.ebi.ac.uk/chembldb/extra/PKIS) 13 . לחלופין, להרכיב אוסף מעכב קינאז מעכב מתוך תרכובות זמין מסחרית. הערה: במעבדה שלנו, יש לנו התאספו אוסף של 72 מעכבי קינאז כלי חזק סלקטיבי המכסים 51 קינאזות היעד העיקרי, כל אלה זמינים ממקורות מסחריים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרכיב מעכבי קינאז לתוך צלחות 96-היטב עבור עיבוד תפוקה גבוהה אופטימלית בריכוזים מרובים (השתמש 1, 0.1 aNd 0.01 מ&quot;מ). כלול בכל בארות בקרת צלחת המכילה DMSO בלבד מעכבי בקרה התייחסות PD173074 (FGFRi) ו Ruxolitinib (JAKi), אשר ידועים לקדם מדינות pluripotent נאיבי מתוחכם בהתאמה. הוסף הערות בגיליון אלקטרוני או בתוכנה דומה. </li></ol> 2. mESC תנאי התרבות והנהלים להכנת מסך <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן 0.1% ג &#39;לטין מצופה 10 ס&quot;מ מנות על ידי הוספת 5 מ&quot;ל של 0.1% (w / V) ג&#39; לטין עד 10 צלחות ס&quot;מ ו דגירה בטמפרטורת החדר למשך 5 דקות. לשאוב ג&#39;לטין ולתת צלחת יבש במשך 2 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תרבות כל קו mESC רגיל ב 37 ° C 5% CO 2 על 0.1% ג &#39;לטין מצופה 10 ס&quot;מ מנות בתקשורת mESC סטנדרטי (ראה טבלה חומרים) המכיל 100 ng / mL GST-LIF, 10% עגל סרום סרום 5% סרום נוקאוט תַחֲלִיף. החלף מדי יום את התקשורת ואת mESCs המעבר סביב confluency 80% בכל יום שני בדילול של 1: 5-1: 10. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לעבור mESCs, לשאוב התקשורת לשטוף עם 5 מ&quot;ל oF פוספט שנאגרו מלוחים (PBS) לכל צלחת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 1 מ&quot;ל טריפסין-EDTA (0.05% טריפסין, 0.02% EDTA) לכל צלחת של mESCs ו דגירה על 37 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend תאים trypsinized ב 4 מ&quot;ל של התקשורת mESC ו צנטריפוגה בסל&quot;ד 1,200 במשך 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ביסודיות resuspend תא גלולה ב 5 מ&quot;ל של התקשורת mESC, pipetting למעלה ולמטה כדי ליצור השעיה תא בודד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספירת תאים על ידי שילוב של השעיה 10 תא μL ו 10 μL של Trypan כחול (0.4%). מקום לתא ספירה תא או להשתמש hemocytometer ומיקרוסקופ אור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זרע 3 x 10 3 mESCs לתוך 0.1% ג&#39;לטין מצופה 96 צלחות היטב, נפח סופי 100 μL של התקשורת, באמצעות פיפטה רב ערוצי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החל מעכבי קינאז ב דילול 1: 100 (מעכב 1 μL הוסיף 100 Media μL) באמצעות פיפטה רב ערוצי. בעדינות פיפטה התקשורת לערבב מעכב ההשעיה תא, ולאחר מכן לאפשר תאים להתיישב ברדס תרבות רקמה עבור 1 שעות כדי להבטיח את הפצה שווה אקרוSs משטח ציפוי. תרבות תאים במשך 48 שעות מבלי לשנות את התקשורת. הערה: לוחות מלאי של 0.1 / 0.1 / 0.01 מ&quot;מ ייתן ריכוז מעכב סופי של 10/1 / 0.1 מיקרומטר בהתאמה. אנו ממליצים להתחיל את המסך בריכוז סופי של 1 מיקרומטר כדי להבטיח עיכוב יעיל של קינאזים היעד העיקרי תוך מזעור מחוץ לכוון השפעות. </li></ol> 3. קינאז מעכבים ניתוח הקרנה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף 96 צלחות mESC גם 200 μL PBS באמצעות אספירטור רב ערוצי ו pipettes. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפוך את תמציות התא μL 150 של חיץ תמוגה (20 מ&quot;מ טריס pH 7.4, 150 מ&quot;מ NaCl, 1 מ&quot;מ EDTA, 1% NP-40 (v / v), 0.5% נתרן deoxycholate (w / v), 10 מ&quot;מ β-glycerophosphate , 10 מ&quot;ל pyrophosphate נתרן, 1 NaF mM, 2 mM Na 3 VO 4 , Protease מעכב שלם קוקטייל טבליות). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להבהיר תמציות על ידי צנטריפוגה ב XG 1500 במשך 30 דקות V- התחתונה 96 צלחות היטב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Immobilize 100 μL של supernatants על nitrocel<html> קרום lulose באמצעות 96-גם ואקום נקודה כתם סעפת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יבש את הממברנה, ואת הכתם עם 40 מ&quot;ל של Ponceau S כדי להבטיח העברה עקבית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף קרום עם TBST ולחסום ב TBST / 3% (w / V) חלב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה בננוג ו Dnmt3b נוגדנים בדילול של 1: 1000 (v / v) ב TBST / 3% (w / v) אבקת חלב לילה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף את הממברנות ב 3 x 10 דקות ב TBST ו דגירה ב 30 מ&quot;ל של נוגדנים משניים בדילול של 1: 10,000 (v / v) ב TBST / 3% (w / V) חלב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפתח באמצעות מערכת דיגיטלית immunoblotting הדמיה. הערה: אם אפשר, להשתמש immunoblotting פלואורסצנטי כמותי כדי לזהות Nanog ו Dnmt3b. עם זאת, האות הרקע של Dnmt3b על ידי immunoblotting פלואורסצנטי גבוה מדי. לכן, 800 ננומטר פלואורסצנטי נגד ארנבת (ננוג) ו anti-mouse-HRP (Dnmt3b) נוגדנים משניים משמשים. </li></ol> 4. ניתוח של נתוני המסך ו אימות של מעכבים כמו רגולטוריים plaipipotency בתום לב &gt; הערה: זהו צעד קריטי כדי להבטיח כי רק מאפננים ploreipotency בתום לב מזוהים. זה חיוני מעכבי triage מבוסס על שניהם Nanog: יחס Dnmt3b ואת האות הכולל, כדי להבטיח כי מעכבי קינאז אשר משפיעים לרעה הישרדות mESC לא נבחרו לניתוח נוסף. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לכמת ננוג האות Dnmt3b באמצעות תוכנת ניתוח immunoblotting, ואת ערכי ייבוא ​​לתוך גיליון אלקטרוני או תוכנה דומה. חישוב ננוג: יחס Dnmt3b עבור כל דגימות לעומת שליטה DMSO. כמו כן, לקבוע את סך Nanog ו Dnmt3b האות כדי להבטיח כי מעכבי kinase לא משפיעים על Nanog: Dnmt3b יחס ידי שינוי mESC הכדאיות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש דירוג ננוג: יחסי Dnmt3b לזהות מעכבים אשר לקדם את pluripotency נאיבי (Nanog: Dnmt3b יחס גבוה יותר מאשר שליטה) ו ploripotency מתוחכם (Nanog: Dnmt3b יחס נמוך יותר מאשר שליטה). הגדר לחתוך סטייה 2x מערכי הבקרה, לסנן מעכבי kinase אשר מייצרים סך Nanog + Dnmt3b האות פחות מזה50% מערך הבקרה DMSO כדי ליצור רשימת אמון גבוהה של מעכבי קינאז אשר מייצב נאיבי (גבוה Nanog: Dnmt3b יחס) ו מתוחכם (נמוך Nanog: Dnmt3b יחס) pluripotent מדינות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אימות מעכבי קינאז ידי זריעת mESCs ב 2 x 10 5 תאים לכל 6 היטב התקשורת 2 מ&quot;ל, ולהוסיף מעכבי קינאז ב 1 מיקרומטר במשך 48 שעות, ללא שינוי התקשורת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Lyse mESCs במאגר תמוגה ולנתח ביטוי Nanog ו Dnmt3b ידי immunoblotting SDS-PAGE קונבנציונאלי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עוד לאמת את הלהיטים על ידי SDS-PAGE immunoblotting עבור סמנים pluripotency נאיבי Klf2 ו Klf4, ו Oct4 כדי להבטיח כי pluripotency נשמר לאחר טיפול 48 שעות מעכב. </li></ol>

<ol>
	<li>Evans, M. J., Kaufman, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+in+culture+of+pluripotential+cells+from+mouse+embryos.">Establishment in culture of pluripotential cells from mouse embryos.</a> Nature. 292 (5819), 154-156 (1981).</li><li>Nichols, J., Smith, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Naive+and+primed+pluripotent+states.">Naive and primed pluripotent states.</a> Cell Stem Cell. 4 (6), 487-492 (2009).</li><li>Boroviak, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lineage-Specific+Profiling+Delineates+the+Emergence+and+Progression+of+Naive+Pluripotency+in+Mammalian+Embryogenesis.">Lineage-Specific Profiling Delineates the Emergence and Progression of Naive Pluripotency in Mammalian Embryogenesis.</a> Developmental Cell. 35 (3), 366-382 (2015).</li><li>Tesar, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+cell+lines+from+mouse+epiblast+share+defining+features+with+human+embryonic+stem+cells.">New cell lines from mouse epiblast share defining features with human embryonic stem cells.</a> Nature. 448 (7150), 196-199 (2007).</li><li>Brons, I. G. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Derivation+of+pluripotent+epiblast+stem+cells+from+mammalian+embryos.">Derivation of pluripotent epiblast stem cells from mammalian embryos.</a> Nature. 448 (7150), 191-195 (2007).</li><li>Festuccia, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Esrrb+is+a+direct+Nanog+target+gene+that+can+substitute+for+Nanog+function+in+pluripotent+cells.">Esrrb is a direct Nanog target gene that can substitute for Nanog function in pluripotent cells.</a> Cell Stem Cell. 11 (4), 477-490 (2012).</li><li>Ficz, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FGF+signaling+inhibition+in+ESCs+drives+rapid+genome-wide+demethylation+to+the+epigenetic+ground+state+of+pluripotency.">FGF signaling inhibition in ESCs drives rapid genome-wide demethylation to the epigenetic ground state of pluripotency.</a> Cell Stem Cell. 13 (3), 351-359 (2013).</li><li>Guo, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Klf4+reverts+developmentally+programmed+restriction+of+ground+state+pluripotency.">Klf4 reverts developmentally programmed restriction of ground state pluripotency.</a> Development. 136 (7), 1063-1069 (2009).</li><li>Chambers, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanog+safeguards+pluripotency+and+mediates+germline+development.">Nanog safeguards pluripotency and mediates germline development.</a> Nature. 450 (7173), 1230-1234 (2007).</li><li>Findlay, G. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interaction+domains+of+Sos1/Grb2+are+finely+tuned+for+cooperative+control+of+embryonic+stem+cell+fate.">Interaction domains of Sos1/Grb2 are finely tuned for cooperative control of embryonic stem cell fate.</a> Cell. 152 (5), 1008-1020 (2013).</li><li>Niwa, H., Burdon, T., Chambers, I., Smith, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-renewal+of+pluripotent+embryonic+stem+cells+is+mediated+via+activation+of+STAT3.">Self-renewal of pluripotent embryonic stem cells is mediated via activation of STAT3.</a> Genes Dev. 12 (13), 2048-2060 (1998).</li><li>Kunath, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FGF+stimulation+of+the+Erk1/2+signalling+cascade+triggers+transition+of+pluripotent+embryonic+stem+cells+from+self-renewal+to+lineage+commitment.">FGF stimulation of the Erk1/2 signalling cascade triggers transition of pluripotent embryonic stem cells from self-renewal to lineage commitment.</a> Development. 134 (16), 2895-2902 (2007).</li><li>Elkins, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+characterization+of+the+Published+Kinase+Inhibitor+Set.">Comprehensive characterization of the Published Kinase Inhibitor Set.</a> Nature Biotechnology. 34 (1), 95-103 (2016).</li><li>Williams, C. A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Erk5+Is+a+Key+Regulator+of+Naive-Primed+Transition+and+Embryonic+Stem+Cell+Identity.">Erk5 Is a Key Regulator of Naive-Primed Transition and Embryonic Stem Cell Identity.</a> Cell Reports. 16 (7), 1820-1828 (2016).</li><li>Cao, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conversion+of+human+fibroblasts+into+functional+cardiomyocytes+by+small+molecules.">Conversion of human fibroblasts into functional cardiomyocytes by small molecules.</a> Science. 352 (6290), (2016).</li><li>Zhang, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pharmacological+reprogramming+of+fibroblasts+into+neural+stem+cells+by+signaling-directed+transcriptional+activation.">Pharmacological reprogramming of fibroblasts into neural stem cells by signaling-directed transcriptional activation.</a> Cell Stem Cell. 18 (5), 653-667 (2016).</li></ol>

המחברים אינם מכריזים על ניגודי אינטרסים הנובעים ממחקר זה.

כאן אנו מדגימים מתודולוגיה נגישה נרחב כדי לחקור את התפקיד של נתיבי איתות kinase ב ויסות המעבר pluripotent נאיבי מתוחכם. זה מתייחס לשאלת מפתח בתחום ESC. למרות גישות גבוהות גנומיקה ו transcriptomics משמשים באופן שגרתי כדי לזהות הרגולטורים תמלול מפתח של מדינות pluripotent תמים ו מתוחכם, רשתות איתות איתות pluripotency הוכיחה להיות מאתגר. כעת אנו מספקים אסטרטגיה גמישה המעסיקים מעכבים כימיים כדי לזהות קינאזות השולטות המעבר pluripotent נאיבי תחולתי ב mESCs. זה מסתמך על ציוד פשוט, ריאגנטים וחומרים הזמינים ברוב המעבדות כי המחקר תא איתות ESC ביולוגיה. קריטי להצלחת פלטפורמה זו הוא הפיתוח שלנו assay חסון לכמת את המעבר בין מדינות pluripotent נאיבי מתוחכם. הקמת assay זה נדרש שינויים משמעותיים iterative כדי plat התאצפיפות ing, זמן הדגירה inhibitor ו immunoblotting תנאים. גישות מולקולות קטנות צוברים מתיחה לשימוש רציונלי ביישומים ESC טיפוליים 15 , 16 . כוח גדול של מולקולה קטנה ההקרנה היא כי תרכובות כלי מתוכננים ו / או שונה עבור ספיגת יעיל הסלולר. יעילות Transfection אינו מגביל, ושימוש במערכות מסירה מסוכנים כגון lentivirus אינו הכרחי. יתר על כן, מעכבים לעיתים קרובות לעכב מספר isoforms בתוך משפחה kinase ( למשל Fgfr1-4, Jak1-3), אשר מתגבר יתירות תפקודית כי מעכב גנטי / גנומי טכניקות הפרעה כגון RNAi ו CRISPR / Cas9. כמו תרכובות כלי חזק יותר סלקטיבי להיות זמין הן אקדמיות והן תרופות גילוי תרופות, מובחנים ולא מבינים קינאזות יהיה דחף לחזית המחקר ESC. לכן אנו מציעים כי זה גבוהגישת הקרנת הגלם תפתח אפיקים חדשים של מחקר לתוך רשתות הליבה ESC הליבה. מגבלה אחת קטנה של טכנולוגיה זו היא שאפילו המעכבים המולקולים הקטנים והסלקטיביים ביותר מעכבים ומעכבים קינאזות רבות שאינן קשורות ל- vivo . עם זאת, נתונים מקיפים יותר ויותר קינאז מעכב פרופיל מאפשר מטרות פונקציונליות של מעכבי קינאז להיות מזוהה בקלות (http://lincs.hms.harvard.edu/kinomescan; http://www.kinase-screen.mrc.ac.uk/kinase מעכבים). לבסוף, באופן עקרוני הפלטפורמה שלנו ניתן להחיל לחקור כל אוסף מולקולה קטנה ו / או assay הסלולר אשר באיכות גבוהה immunoblotting נוגדנים זמינים. זה יאפשר לימוד של מספר מערכות רגולטוריות ב ויסות pluripotency ולאפשר זיהוי של מעכבי מולקולה קטנה אשר לשנות תהליכים תאיים מגוונים. באופן ספציפי, אנו רואים כי יישום של אוספי מולקולה קטנה המתעוררים כגון האפיגאןבדיקות טיק המפותחות על ידי קונסורציום גנומי מבנית (http://www.thesgc.org/chemical-probes/epigenetics) יש פוטנציאל לחשוף רגולטורים רומן נוסף של מעברים pluripotent.

תאי גזע עובריים (ESC) יש את היכולת עצמית לחדש או להבדיל לתוך כל סוג התא בגוף המבוגר, תופעה הידועה בשם pluripotency 1 . עדויות אחרונות מצביעות על כך שקיימות מצבים מובהקים מבחינה התפתחותית, הנקראים &quot;יכולת נאיבית&quot; ו&quot;מתוחכמת &quot;. ESCs נאיבי מייצגים מצב של התפתחות דומה לזו שנמצאה בעובר preimplantation 3 . לעומת זאת, ESCs pledipotent מתוחכם עומדים לצאת pluripotency ולהבדיל לשושלות עובריים מיוחדים 4 , 5 . מדינות נאיביות ופלומות מסומנות מסומנות על ידי רשתות רגולטוריות שונות. פלוריפוטיות נאיבית מאופיינת על ידי ביטוי של גורמי תעתיק גורמי מפתח כגון ננוג, גורמי תעתיק כמו Krueppel (Klfs), Rex1 2 ו Esrrb <supClass = &quot;xref&quot;&gt; 6. ב ESCs העכבר (mESCs), pluripotency מתוחכם מאופיין בביטוי מופחת של סמנים נאיבי ביטוי ביטוי גנטי ספציפי הכולל את דה novo DNA methyltransferase Dnmt3b 7 . ב vivo , מתוחכם pluripotent שלאחר השתלת epiblast בתאי גזע (EpiSCs) 4 , 5 בנוסף לבטא את הסמן Epiglast Fgf5 ו סמנים של תחול השושלת כגון Brachyury 8 . MESCs לספק מודל tractable כדי לחקור מנגנונים השולטים נאיבי- primed מעברים pluripotent במבחנה . כאשר מתורבת גורם בלוקמיה מעכב (LIF) וסרום שור העובר (FBS), mESCs עוברים המעבר הדינמי בין מדינות pluripotent נאיבי ו מתוחכם 9 , 10 . LIF-Jak-Stat3 פונקציות איתות כדי לקדם את רשת נאיבית רגולטורית רשת 11 </Sup&gt;, בעוד איתות אוטוקריני באמצעות גורם הצמיחה fibroblast 4 (Fgf4) Erk1 / 2 נתיבים המעבר למצב תחולתי 12 . עם זאת, זה נשאר אתגר כדי להעריך באופן שיטתי את התפקיד של קינאזות חלבון בקביעת מדינות pluripotent מובהק. כאן, אנו מתארים פלטפורמה כמותית ומדרגית שבאמצעותה ניתן לבצע מסכי מולקולה קטנים הממוקדים עבור הרגולטורים של קינאז של המעבר pluripotent נאיבי תחולתי. אנו משתמשים בתנאים פשוטים תרבות mESC ו ריאגנטים סטנדרטיים, חומרים וציוד לחשוף ולאמת מעכבי קינאז עם יכולת unrecreciated עד כה לייצב pluripotency נאיבי. יתר על כן, אנו דנים יישומים מורחבת פוטנציאליים עבור טכנולוגיה זו, כולל עבור הקרנה של אוספים מולקולה קטנה אחרים כגון ספריות מעכבי המתעוררים המכוונים הרגולטורים epigenetic.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="573">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">mESC media</td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">CCE mESCs</td>
			<td style="width:71px;">ATCC</td>
			<td style="width:119px;">ATCC&#160;SCRC-1023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">DMEM Media</td>
			<td style="width:71px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">11965092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">L-Glutamine</td>
			<td style="width:71px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">25030081</td>
			<td>Final: 2mM</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Penicillin/Streptomycin</td>
			<td style="width:71px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">15140122</td>
			<td>Final: 50U/ml</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">2-mercaptoethanol</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">M6250</td>
			<td>Final: 0.1mM</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:216px;">Leukemia Inhibitory Factor (GST fusion)</td>
			<td style="width:71px;">MRC-PPU reagents and services</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Final: 100ng/ml</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Leukemia Inhibitory Factor</td>
			<td style="width:71px;">Thermo</td>
			<td style="width:119px;">PMC9484</td>
			<td>Final: 100ng/ml</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Non-Essential Amino Acids</td>
			<td style="width:71px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">11140050</td>
			<td>Final: 0.1mM</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Sodium Pyruvate</td>
			<td style="width:71px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">11360070</td>
			<td>Final: 1mM</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">KnockOut Serum Replacement</td>
			<td style="width:71px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">10828-028</td>
			<td>Final: 5%</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Defined Fetal Bovine Serum</td>
			<td style="width:71px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">10703464</td>
			<td>Final: 10%</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Name</td>
			<td style="width:71px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">TC materials</td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red</td>
			<td style="width:71px;">Thermo</td>
			<td style="width:119px;">25300054&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Gelatin from porcine skin</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">1890</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Nunc MicroWell 96-Well Microplates</td>
			<td style="width:71px;">Thermo</td>
			<td style="width:119px;">156545</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">DPBS, no calcium, no magnesium</td>
			<td style="width:71px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">14190136</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">V-bottom 96 well plates</td>
			<td style="width:71px;">Greiner Bio-one</td>
			<td style="width:119px;">651261</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Name</td>
			<td style="width:71px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Lysis Buffer</td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Tris buffer</td>
			<td style="width:71px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">103157P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Sodium Chloride</td>
			<td style="width:71px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">97061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">EDTA</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">E4884</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">1% NP-40</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">9016-45-9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Sodium Deoxycholate</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">D6750-100g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">&#946;-glycerophosphate</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">G9422</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Sodium Pyrophosphate</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">13472-36-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Sodium Fluoride</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">450022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Sodium Orthovanadate</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">450243</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Roche Complete Protease Inhibitor Cocktail Tablets</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">CO-RO</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Name</td>
			<td style="width:71px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Chemicals</td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Tween</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">P1379-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Milk Powder</td>
			<td style="width:71px;">Marvel</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Name</td>
			<td style="width:71px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Western Blotting</td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Protran BA 85 Nitrocellulose 0.45uM&#160; Pore size (20 X 20cm Sheets) (25 Sheet)</td>
			<td style="width:71px;">GE</td>
			<td style="width:119px;">10401191</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Ponceau S</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">P7170-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Name</td>
			<td style="width:71px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Laboratory Equipment</td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Minifold I System</td>
			<td style="width:71px;">GE</td>
			<td style="width:119px;">10447850</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">ChemiDoc imager</td>
			<td style="width:71px;">BioRad</td>
			<td style="width:119px;">1708280&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">LiCor Odyssey Imager</td>
			<td style="width:71px;">LiCor</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Name</td>
			<td style="width:71px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Antibodies</td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Anti-mouse Nanog</td>
			<td style="width:71px;">Reprocell</td>
			<td style="width:119px;">RCAB001P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Anti-Dnmt3b</td>
			<td>Imgenex</td>
			<td>IMG-184A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">IRDye 800CW Donkey anti-Rabbit</td>
			<td style="width:71px;">Licor</td>
			<td style="width:119px;">926-32213</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:216px;">Anti-mouse-HRP</td>
			<td style="width:71px;">Cell Signalling Technology</td>
			<td>7076S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Anti-Klf2</td>
			<td style="width:71px;">Millipore</td>
			<td style="width:119px;">09-820</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Anti-Klf4</td>
			<td style="width:71px;">R&#38;D Systems</td>
			<td style="width:119px;">AF3158</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Anti-Oct4</td>
			<td style="width:71px;">Santa Cruz</td>
			<td style="width:119px;">sc-5279</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a simple method to identify kinases that regulate embryonic stem cell pluripotency by high-throughput inhibitor screening

תאי גזע עובריים (ESCs) יכולים לחדש את עצמם או לבדל אותם לכל סוגי התאים, תופעה הידועה בשם pluripotency. מדינות מובחנות מובחנות תוארו, מכנות &quot;יכולת נאיביות&quot; ו&quot;מתוחכמת &quot;. המנגנונים השולטים במעבר מתוחכם נאיבי אינם מובנים כלל. בפרט, אנו נשארים גרועים על קינאזות חלבון המציינות מדינות pluripotent נאיבי ו מתוחכם, למרות זמינות מוגברת של תרכובות כלי באיכות גבוהה כדי לחקור פונקציה קינאז. כאן, אנו מתארים פלטפורמה מדרגית לבצע מסכי מולקולה קטנים ממוקד עבור הרגולטורים kinase של המעבר pluripotent נאיבי מתוחכם ESCs העכבר. גישה זו מנצלת תנאים פשוטים תרבות התא ריאגנטים סטנדרטיים, חומרים וציוד לחשוף ולאמת מעכבי קינאז עם השפעות שטרם הוערכו עד כה על pluripotency. אנו דנים ביישומים פוטנציאליים לטכנולוגיה זו, כולל הקרנה של מולקולה קטנה אחרתאוספים כגון מעכבי קינאז מתוחכמים יותר ויותר וספריות מתפתחות של תרכובות כלי אפיגנטיות.

באמצעות הנוהל המוצג כאן ( איור 1 ), אנו המסך הספרייה LINCS של 228 מעכבי קינאז עוצמה סלקטיבית לזהות את אלה אשר לווסת את mESC pluripotency. הספרייה מוכנה בריכוז של 0.1 מ&quot;מ עבור דילול 1: 100 וריכוז ההקרנה הסופית של 1 מיקרומטר ב mESCs. 48 שעות מאוחר יותר, mESCs היו lysed ותמציות מוכן ניתוח כמותי כתם נקודה של הביטוי Nanog ו Dnmt3b ( איור 2 , למעלה). תוצאות מריכוזי הקרנה אחרים אינם מיוצגים כאן לקיצור. ננוג: יחס Dnmt3b נקבעת עבור כל מעכב קינאז ותרכובות מדורגות חתך 2x להחיל ( איור 2 , התחתון). סך הכל Nanog ו- Dnmt3b האות ביחס לשליטה הוא עלים על דירוג מעכבים ונתונה חתך 0.5x, כדי לאפשר triaging של מעכבים אשר מראים משמעותי mESC רעילות. בחר מעכבי קינאז אשר לייצב את sta נאיביTe מאומתים באמצעות immunoblotting רגיל Nanog / Dnmt3b ( איור 3 ). היעדים העיקריים של קינאז של מעכבים אלה מוצגים בטבלה 1 . כמו כן, אנו מדגימים את הישימות של המסך הזה כדי לזהות מעכבים אשר מייצבים את המדינה מכווצת 14 . <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/55515/55515fig1.jpg" /> איור 1: זרימת עבודה להקרנת מעכבי קינאז המווסתים מעבר נאיבי. MESC טופלו עם ספריית מעכב Kinase 228 תרכובת בריכוז סופי של 1 מיקרומטר. Lysates הוכנו הועברו על קרומי ניטרוצלולוז עבור ניתוח כתם נקודות החיסונית, ואת רמות Nanog ו Dnmt3b נקבע (איור מותאם וויליאמס ואח &#39;14 ). <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55515/55515fig1large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג את אל</a><html> גרסת האפר של דמות זו. <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/55515/55515fig2.jpg" /> איור מס &#39;2: נייף- primed pluripotency מסך ניתוח זיהוי מעכבי. (למעלה) נציג Nanog ו Dnmt3b אימונו כתם נקודות כתם. (תחתית) ערכי Nanog ו- Dnmt3b עבור כל מעכב קינאז נקבעו ביחס לבקרת DMSO, וננוג: יחסי Dnmt3b וסיגנל Nanog + Dnmt3b היחסי שנקבע והמעכבים מדורגים בהשוואה לשליטה ב- DMSO. מעכבים מצאו לשנות Nanog: יחס Dnmt3b מעבר סף פי 2 מעל או מתחת לשליטה DMSO זוהו כנהגים של pluripotency נאיבי או מתוחכם. סף של 2x מתחת DMSO שליטה נקבע מעכבי triage אשר להתפשר mES הישרדות. מעכבים שנבחרו לאימות נוסף מודגשים. (איור מותאם וויליאמס ואח &#39;14 ).S / ftp_upload / 55515 / 55515fig2large.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו. <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/55515/55515fig3.jpg" /> איור 3: אימות תרכובות התאמה שנבחרו מזוהות. MESCs טופלו גם עם 1 מיקרומטר AZD4547 (מעכב FGFR סלקטיבית) או מעכבי המצוין מזוהה מהמסך באיור 2. Nanog: רמות Dnmt3b שנקבעו על ידי תקן SDS-PAGE וניתוח immunoblot. ערכים נומריים של ננוג יחסית: Dnmt3b ו Nanog + Dnmt3b מצוינים בטבלה שלהלן, ומעכבים המייצבים את המצב המצויר המוטבע בירוק. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55515/55515fig3large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> מתחם </td><td colspan="2"> יעדים עיקריים </td><td> מטרות אחרות </td></tr><tr><td> AV-951 </td><td colspan="2"> VEGFR </td><td></td></tr><tr><td> HG-6-64-01 </td><td colspan="2"> ABL, BRAF, RET, CSF1R, EGFR, EPHA8, FGFR, FLT3, ערכת, LOK, MAP4K1, p38b, MUSK, PDGFR, TAOK3, TNNI3K </td><td></td></tr><tr><td> WH-4-023 </td><td colspan="2"> Lck </td><td> Src </td></tr><tr><td> R406 </td><td colspan="2"> סיק </td><td></td></tr><tr><td> GW-572016 </td><td colspan="2"> HER2 </td><td> EGFR </td></tr><tr><td> KIN001-244 </td><td colspan="2"> PDK1 </td><td></td></tr><tr><td> WZ-4-145 </td><td colspan="2"> CSF1R, DDR1, EGFR, TIE1, PDGFR2 </td><td></td></tr><tr><td> WZ-7043 </td><td colspan="2"> CSF1R, DDR1, FGFR ו TAO1 </td><td></td></tr><tr><td> GW786034 </td><td colspan="2"> VEGFR1 </td><td> VEGFR2, VEGFR3 &amp;# 160; </td></tr><tr><td> AZD-1480 </td><td colspan="2"> JAK2 </td><td></td></tr></tbody></table> טבלה 1: תרכובות פגיעה נבחרות ויעדי קינאז ראשוניים.

Watch this Scientific Journal Video about A Simple Method to Identify Kinases That Regulate Embryonic Stem Cell Pluripotency by High-throughput Inhibitor Screening at JoVE.com

A Simple Method to Identify Kinases That Regulate Embryonic Stem Cell Pluripotency by High-throughput Inhibitor Screening

כאן, אנו מציגים פרוטוקול כמותי וניתן להרחבה לבצע מסכי מולקולה קטנים ממוקד עבור הרגולטורים קינאז של המעבר pluripotent נאיבי מתוחכם.

שיטה פשוטה לזהות קינאזות כי לווסת עובריים גזע עובריים גזע על ידי תפוקה גבוהה מעכב הקרנה

Embryonic stem cells (ESCs) can self-renew or differentiate into all cell types, a phenomenon known as pluripotency. Distinct pluripotent states have been ...

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Forward Genetic Approach to Uncover Stress Resistance Genes in Mice &#8212; A High-throughput Screen in ES Cells

Forward Genetic Approach to Uncover Stress Resistance Genes in Mice ÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã¢â‚¬Â A High-throughput Screen in ES Cells

גישה גנטית קדימה ללחשוף גני התנגדות מתח בעכברים - מסך תפוקה גבוהה בתאי גזע עובריים

Phenotype-driven genetic screens in mice is a powerful technique to uncover gene functions, but are often hampered by extremely high costs, which severely ...

Generation of Aggregates of Mouse Embryonic Stem Cells that Show Symmetry Breaking, Polarization and Emergent Collective Behaviour In Vitro

Generation of Aggregates of Mouse Embryonic Stem Cells that Show Symmetry Breaking, Polarization and Emergent Collective Behaviour In Vitro

דור של אגרגטים של תאי עכבר גזע עובריים שצג שבירת סימטריה, קיטוב והתנהגות קולקטיבית מתהווה<em&gt; במבחנה</em

We have developed a protocol improving current Embryoid Body (EB) culture which allows the study of self-organization, symmetry breaking, axial elongation ...

Generating CRISPR/Cas9 Mediated Monoallelic Deletions to Study Enhancer Function in Mouse Embryonic Stem Cells

יצירת CRISPR / Cas9 מתווכת Monoallelic מחיקות ללמוד לתפקד Enhancer בתאי עכבר גזע עובריים

Enhancers control cell identity by regulating tissue-specific gene expression in a position and orientation independent manner. These enhancers are often ...

Epigenetic Conversion as a Safe and Simple Method to Obtain Insulin-secreting Cells from Adult Skin Fibroblasts

מרת אפיגנטיים כאמצעי בטוח ופשוט להשיג תאי מפרישי אינסולין פיברובלסטים עור בוגרים

Regenerative medicine requires new, fully functional cells that are delivered to patients in order to repair degenerated or damaged tissues. When such ...

Reprogramming Mouse Embryonic Fibroblasts with Transcription Factors to Induce a Hemogenic Program

תכנות מחדש עכבר עוברי פיברובלסטים עם גורמי שעתוק כדי לגרום תכנית Hemogenic

This protocol details the induction of a hemogenic program in mouse embryonic fibroblasts (MEFs) via overexpression of transcription factors (TFs). We ...

A Versatile Mounting Method for Long Term Imaging of Zebrafish Development

שיטת הרכבה צדדית עבור Long Term הדמיה של פיתוח דג זברה

Zebrafish embryos offer an ideal experimental system to study complex morphogenetic processes due to their ease of accessibility and optical transparency. ...

Rapid, Directed Differentiation of Retinal Pigment Epithelial Cells from Human Embryonic or Induced Pluripotent Stem Cells

הבידול מהירה, מכוונת של תאים אפיתל הפיגמנט ברשתית מתאי גזע Pluripotent האנושי עובריים או מושרה

We describe a robust method to direct the differentiation of pluripotent stem cells into retinal pigment epithelial cells (RPE). The purpose of providing ...

CARIP-Seq and ChIP-Seq: Methods to Identify Chromatin-Associated RNAs and Protein-DNA Interactions in Embryonic Stem Cells

CARIP-Seq ו שבב-Seq: שיטות לזיהוי RNAs הקשורים כרומטין והן אינטראקציות חלבון-DNA בתאי גזע עובריים

Embryonic stem (ES) cell self-renewal&#160;and differentiation is governed by extrinsic signals and intrinsic networks of transcription factors, ...

Organotypic Culture Method to Study the Development Of Embryonic Chicken Tissues

שיטת Organotypic תרבות ללמוד על התפתחות עובריים עוף רקמות

The embryonic chicken is commonly used as a reliable model organism for vertebrate development. Its accessibility and short incubation period makes it ...

A Direct and Simple Method to Assess Drosophila melanogaster's Viability from Embryo to Adult

A Direct and Simple Method to Assess Drosophila melanogaster's Viability from Embryo to Adult

שיטה ישירה ופשוטה להערכת דרוזופילה מלאנוגסטרהכדאיות מעובר למבוגר

In Drosophila melanogaster, viability assays are used to determine the fitness of certain genetic backgrounds. Allelic variations can result in partial or ...