Name: a simple method to identify kinases that regulate embryonic stem cell pluripotency by high-throughput inhibitor screening
Uploaded: 2017-05-12T12:30:00
Duration: 7 min 18 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Simple Method to Identify Kinases That Regulate Embryonic Stem Cell Pluripotency by High-throughput Inhibitor Screening at JoVE.com

CACW støttes av et doktorgradsstudium for medisinsk forskningsråd. GMF støttes delvis av en ny forskningsinstitutt for medisinsk forskningsråd (MR / N000609 / 1) og et Tenovus Scotland-stipendium.

1. Kollasjon av småmolekylinaseinhibitorbiblioteker <ol><li> Samle inhibitorbiblioteker fra offentlig tilgjengelige kinaseinhibitorer, f.eks . Bibliotek av integrerte nettverksbaserte cellulære signaturer (LINCS) fra Harvard Medical School, en målrettet samling av 228 potente og selektive kinasehemmere (http://lincs.hms.harvard.edu) , Og Protein Kinase Inhibitor Set (PKIS), en 376 sammensetning samling samlet av industrielle forskere (https://www.ebi.ac.uk/chembldb/extra/PKIS) 13 . Alternativt kan du samle en skreddersydd kinaseinhibitorinnsamling fra kommersielt tilgjengelige forbindelser. MERK: I vårt laboratorium har vi samlet en samling av 72 kraftige og selektive verktøykinasehemmere som dekker 51 primære målkinaser, som alle er tilgjengelige fra kommersielle kilder. </li><li> Kombinere kinasehemmere i 96-brønnsplater for optimal høyytelsesbehandling ved flere konsentrasjoner (bruk 1, 0,1 aNd 0,01 mM). Inkluder i hver plate kontroll brønner som inneholder kun DMSO og referanse kontroll inhibitorer PD173074 (FGFRi) og Ruxolitinib (JAKi), som er kjent for å fremme henholdsvis naive og primed pluripotent tilstander. Noter i et regneark eller lignende programvare. </li></ol> 2. MESC-kulturbetingelser og fremgangsmåter for fremstilling av skjerm <ol><li> Tilbered 0,1% gelatin-belagte 10 cm-retter ved å tilsette 5 ml 0,1% (w / v) gelatin til 10 cm plater og inkuber ved romtemperatur i 5 minutter. Aspirer gelatin og la platen tørke i 2 minutter. </li><li> Kultur hvilken som helst standard mESC linje ved 37 ° C 5% CO2 på 0,1% gelatin-belagte 10 cm-retter i standard mESC media (se Material Table ) inneholdende 100 ng / mL GST-LIF, 10% føtalt kalvserum og 5% Knockout Serum Erstatning. Bytt media hver dag og passerer mESCs med rundt 80% konfluens hver andre dag i en fortynning på 1: 5-1: 10. </li><li> Til å passere mESCs, aspirere medier og vask med 5 ml oF fosfatbuffert saltvann (PBS) per plate. </li><li> Tilsett 1 ml trypsin-EDTA (0,05% trypsin, 0,02% EDTA) per plate mESC og inkuber ved 37 ° C i 10 minutter. </li><li> Resuspender trypsiniserte celler i 4 ml mESC media og sentrifuger ved 1200 rpm i 5 min. </li><li> Resuspender cellepellet grundig i 5 ml mESC media, pipettering opp og ned for å generere en enkeltcellesuspensjon. </li><li> Telle celler ved å kombinere en 10 μl cellesuspensjon og 10 μl Trypan Blue (0,4%). Plasser inn i et celle tellekammer eller bruk et hemocytometer og lysmikroskop. </li><li> Seed 3 x 10 3 mESCs i 0,1% gelatin-belagte 96-brønnplater, sluttvolum 100 μl media, ved bruk av en flerkanalspipett. </li><li> Påfør kinasehemmere ved 1: 100 fortynning (1 μL inhibitor tilsatt til 100 μL media) ved hjelp av en flerkanalspipett. Forsiktig pipette medier for å blande inhibitor og celle suspensjon, deretter la celler til å bosette seg i en vev kultur hette i 1 time for å sikre lik distribusjon acroSs plating overflaten. Kulturceller i 48 timer uten å bytte media. MERK: Lagerplater på 1 / 0,1 / 0,01 mM vil gi en sluttinhibitorkonsentrasjon på henholdsvis 10/1 / 0,1 μM. Vi anbefaler at du starter skjermen ved en sluttkonsentrasjon på 1 μM for å sikre effektiv inhibering av primære målkinaser mens du minimerer off-target-effekter. </li></ol> 3. Kinase Inhibitor Screening Analysis <ol><li> Vask 96 brønn mESC-plater i 200 μl PBS ved bruk av flerkanals aspirator og pipetter. </li><li> Lag celleekstrakter i 150 μl lysisbuffer (20 mM Tris pH 7,4, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1% NP-40 (volum / volum), 0,5% natriumdeokoksolat (vekt / volum), 10 mM β-glycerofosfat , 10 mM natriumpyrofosfat, 1 mM NaF, 2 mM Na3VO4, komplett proteaseinhibitor-cocktail-tabletter). </li><li> Klargjør ekstrakter ved sentrifugering ved 1500 xg i 30 minutter i V-bunnplater med 96 brønner. </li><li> Immobiliser 100 ul supernatanter på en nitrocellLulose membran ved bruk av en 96-brønns vakuumdot-blend-manifold. </li><li> Tørk membranen og flekk med 40 ml Ponceau S for å sikre konsistent overføring. </li><li> Vask membran med TBST og blokk i TBST / 3% (w / v) melk. </li><li> Inkuber i Nanog og Dnmt3b antistoffer ved en fortynning på 1: 1000 (v / v) i TBST / 3% (w / v) melkpulver over natten. </li><li> Vask membranene i 3 x 10 minutter i TBST og inkuber i 30 ml sekundære antistoffer ved en fortynning på 1: 10 000 (volum / volum) i TBST / 3% (vekt / volum) melk. </li><li> Utvikle ved hjelp av et digitalt immunoblottende bildesystem. MERK: Bruk evt. Kvantitativ fluorescens immunoblotting for å oppdage Nanog og Dnmt3b. Bakgrunnssignalet for Dnmt3b ved fluorescensimmunoblotting er imidlertid for høyt. Derfor brukes 800 nm fluorescens anti-kanin (Nanog) og anti-mus-HRP (Dnmt3b) sekundære antistoffer. </li></ol> 4. Analyse av skjermdata og validering av inhibitorer som Bona Fide Pluripotency Regulators <p class="jove_content"&gt; MERK: Dette er et kritisk skritt for å sikre at bare bona fide pluripotencymodulatorer blir identifisert. Det er viktig å triagere hemmere basert på både Nanog: Dnmt3b-forholdet og det generelle signalet, for å sikre at kinasehemmere som påvirker mESC-overlevelsen negativt, ikke er valgt for videre analyse. <ol><li> Kvantifiser Nanog og Dnmt3b signal ved hjelp av immunoblotting analyse programvare, og importer verdier til et regneark eller lignende programvare. Beregn Nanog: Dnmt3b-forholdet for alle prøver sammenlignet med DMSO-kontroll. Bestem også totalt Nanog og Dnmt3b signal for å sikre at kinasehemmere ikke påvirker Nanog: Dnmt3b-forholdet ved å endre mESC-levedyktighet. </li><li> Bruk rangerte Nanog: Dnmt3b-forhold for å identifisere hemmere som fremmer naiv pluripotency (Nanog: Dnmt3b-forhold høyere enn kontroll) og primet pluripotency (Nanog: Dnmt3b-forhold lavere enn kontroll). Angi cut-off ved 2x avvik fra kontrollverdier, og filtrer ut kinasehemmere som produserer et totalt Nanog + Dnmt3b-signal med mindre det50% av DMSO-kontrollverdien for å generere en høy konfidensliste over kinaseinhibitorer som stabiliserer naivt (høyt Nanog: Dnmt3b-forhold) og grunnet (lavt Nanog: Dnmt3b-forhold) pluripotent-tilstand. </li><li> Valider kinaseinhibitorer ved å såle mESCs ved 2 x 10 5 celler per 6 brønner i 2 mL media, og legg kinaseinhibitorer ved 1 μM i 48 timer uten å bytte media. </li><li> Lyse mESCs i lysisbuffer og analysere Nanog og Dnmt3b-ekspresjon ved konvensjonell SDS-PAGE immunoblotting. </li><li> Videre validere treff ved SDS-PAGE immunoblotting for naive pluripotensmarkører Klf2 og Klf4 og Oct4 for å sikre at pluripoten blir opprettholdt etter 48 h inhibitorbehandling. </li></ol>

<ol>
	<li>Evans, M. J., Kaufman, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+in+culture+of+pluripotential+cells+from+mouse+embryos.">Establishment in culture of pluripotential cells from mouse embryos.</a> Nature. 292 (5819), 154-156 (1981).</li><li>Nichols, J., Smith, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Naive+and+primed+pluripotent+states.">Naive and primed pluripotent states.</a> Cell Stem Cell. 4 (6), 487-492 (2009).</li><li>Boroviak, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lineage-Specific+Profiling+Delineates+the+Emergence+and+Progression+of+Naive+Pluripotency+in+Mammalian+Embryogenesis.">Lineage-Specific Profiling Delineates the Emergence and Progression of Naive Pluripotency in Mammalian Embryogenesis.</a> Developmental Cell. 35 (3), 366-382 (2015).</li><li>Tesar, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+cell+lines+from+mouse+epiblast+share+defining+features+with+human+embryonic+stem+cells.">New cell lines from mouse epiblast share defining features with human embryonic stem cells.</a> Nature. 448 (7150), 196-199 (2007).</li><li>Brons, I. G. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Derivation+of+pluripotent+epiblast+stem+cells+from+mammalian+embryos.">Derivation of pluripotent epiblast stem cells from mammalian embryos.</a> Nature. 448 (7150), 191-195 (2007).</li><li>Festuccia, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Esrrb+is+a+direct+Nanog+target+gene+that+can+substitute+for+Nanog+function+in+pluripotent+cells.">Esrrb is a direct Nanog target gene that can substitute for Nanog function in pluripotent cells.</a> Cell Stem Cell. 11 (4), 477-490 (2012).</li><li>Ficz, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FGF+signaling+inhibition+in+ESCs+drives+rapid+genome-wide+demethylation+to+the+epigenetic+ground+state+of+pluripotency.">FGF signaling inhibition in ESCs drives rapid genome-wide demethylation to the epigenetic ground state of pluripotency.</a> Cell Stem Cell. 13 (3), 351-359 (2013).</li><li>Guo, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Klf4+reverts+developmentally+programmed+restriction+of+ground+state+pluripotency.">Klf4 reverts developmentally programmed restriction of ground state pluripotency.</a> Development. 136 (7), 1063-1069 (2009).</li><li>Chambers, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanog+safeguards+pluripotency+and+mediates+germline+development.">Nanog safeguards pluripotency and mediates germline development.</a> Nature. 450 (7173), 1230-1234 (2007).</li><li>Findlay, G. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interaction+domains+of+Sos1/Grb2+are+finely+tuned+for+cooperative+control+of+embryonic+stem+cell+fate.">Interaction domains of Sos1/Grb2 are finely tuned for cooperative control of embryonic stem cell fate.</a> Cell. 152 (5), 1008-1020 (2013).</li><li>Niwa, H., Burdon, T., Chambers, I., Smith, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-renewal+of+pluripotent+embryonic+stem+cells+is+mediated+via+activation+of+STAT3.">Self-renewal of pluripotent embryonic stem cells is mediated via activation of STAT3.</a> Genes Dev. 12 (13), 2048-2060 (1998).</li><li>Kunath, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FGF+stimulation+of+the+Erk1/2+signalling+cascade+triggers+transition+of+pluripotent+embryonic+stem+cells+from+self-renewal+to+lineage+commitment.">FGF stimulation of the Erk1/2 signalling cascade triggers transition of pluripotent embryonic stem cells from self-renewal to lineage commitment.</a> Development. 134 (16), 2895-2902 (2007).</li><li>Elkins, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+characterization+of+the+Published+Kinase+Inhibitor+Set.">Comprehensive characterization of the Published Kinase Inhibitor Set.</a> Nature Biotechnology. 34 (1), 95-103 (2016).</li><li>Williams, C. A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Erk5+Is+a+Key+Regulator+of+Naive-Primed+Transition+and+Embryonic+Stem+Cell+Identity.">Erk5 Is a Key Regulator of Naive-Primed Transition and Embryonic Stem Cell Identity.</a> Cell Reports. 16 (7), 1820-1828 (2016).</li><li>Cao, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conversion+of+human+fibroblasts+into+functional+cardiomyocytes+by+small+molecules.">Conversion of human fibroblasts into functional cardiomyocytes by small molecules.</a> Science. 352 (6290), (2016).</li><li>Zhang, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pharmacological+reprogramming+of+fibroblasts+into+neural+stem+cells+by+signaling-directed+transcriptional+activation.">Pharmacological reprogramming of fibroblasts into neural stem cells by signaling-directed transcriptional activation.</a> Cell Stem Cell. 18 (5), 653-667 (2016).</li></ol>

Forfatterne erklærer ingen interessekonflikter som følge av denne studien.

Her viser vi en allment tilgjengelig metode for å undersøke rollen som kinasignaliseringsbaner i regulering av naiv-grunnet pluripotent overgang. Dette adresserer et nøkkelspørsmål i ESC-feltet. Selv om gjennomgående genomik og transcriptomics tilnærminger rutinemessig brukes til å identifisere viktige transkripsjonsregulatorer av naive og primede pluripotente stater, har det vist seg å være utfordrende å illustrere pluripotenssignalnett. Vi gir nå en fleksibel strategi som benytter kjemiske hemmere til å identifisere kinaser som kontrollerer naiv-grunnet pluripotent overgang i mESCs. Dette er avhengig av enkelt utstyr, reagenser og materialer som er tilgjengelige for de fleste laboratorier som studerer cellesignal og ESC-biologi. Kritisk til suksessen til denne plattformen er vår utvikling av et robust assay for å kvantifisere overgangen mellom naive og primed pluripotent-stater. Etablering av denne analysen krevde signifikante iterative modifikasjoner på celleplatenInntetningstetthet, tidspunkt for inhibitorinkubasjon og immunoblottende betingelser. Små molekyletilnærminger oppnår trekkraft for rasjonell bruk i terapeutiske ESC-applikasjoner 15 , 16 . En stor styrke ved screening av små molekyler er at verktøyforbindelsene er designet og / eller modifisert for effektiv opptak av cellene. Transfeksjonseffektivitet er ikke begrenset, og bruk av farlige forsendelsessystemer som lentivirus er ikke nødvendig. Videre hemmer inhibitorer ofte flere isoformer i en kinasefamilie ( f.eks. Fgfr1-4, Jak1-3), som overvinter funksjonell redundans som hindrer genetisk / genomisk interferens teknikker som RNAi og CRISPR / Cas9. Etter hvert som mer kraftige og selektive verktøyforbindelser blir tilgjengelige fra både faglige og farmasøytiske legemiddeloppdagingsprogrammer, vil understudied og dårlig forstått kinaser bli presset til forkant av ESC-forskning. Vi foreslår derfor at denne høyesteRoughput screening tilnærming vil åpne opp nye veier for forskning i sentrale ESC regulatoriske nettverk. En liten begrensning av denne teknologien er at selv de mest potente og selektive småmolekylhemmere engasjerer og hemmer flere urelaterte kinaser in vivo . Imidlertid gir stadig mer omfattende kinasehemmerprofileringsdata funksjonelle mål for kinasehemmere lett å identifisere (http://lincs.hms.harvard.edu/kinomescan; http://www.kinase-screen.mrc.ac.uk/kinase -inhibitors). Til slutt, kan vår plattform i prinsippet brukes til å forhøre alle små molekyler og / eller cellulære analyser som er av høy kvalitet immunoblottende antistoffer. Dette vil tillate studier av flere reguleringssystemer i pluripoten-regulering og lette identifisering av små molekylhemmere som modifiserer forskjellige cellulære prosesser. Spesielt ser vi på at anvendelsen av nye småmolekylsamlinger som epigenetTic probes utviklet av Structural Genomics Consortium (http://www.thesgc.org/chemical-probes/epigenetics) har potensial til å avdekke ytterligere nye regulatorer av pluripotente overganger.

Embryonale stamceller (ESCer) har evne til selvfornyelse eller differensiering i hvilken som helst celletype i den voksne kroppen, et fenomen kjent som pluripotency 1 . Nylige bevis indikerer at utviklingsmessige forskjellige pluripotente stater eksisterer, betegnet &quot;naiv&quot; og &quot;primet&quot; pluripotency 2 . Naive ESC representerer en tilstand av utvikling som ligner den som finnes i preimplantasjonsembryoen 3 . I motsetning til dette er primed pluripotent ESCer klar til å avslutte pluripotency og differensiere til spesialiserte embryonale linjer 4 , 5 . Naive og primed pluripotent stater er preget av forskjellige genet regulatoriske nettverk. Naiv pluripoten er preget av ekspresjon av viktige pluripotens transkripsjonsfaktorer som Nanog, Krueppel-lignende transkripsjonsfaktorer (Klfs), Rex1 2 og Esrrb <supClass = &quot;xref&quot;&gt; 6. I mus-ESC-er (mESCs) preges den primære pluripotency av redusert ekspression av naive markører og en spesifikk genekspressions signatur som inkluderer de novo DNA-metyltransferasen Dnmt3b 7 . In vivo uttrykker pripede pluripotente postimplantasjon epiblaststamceller (EpiSCs) 4 , 5 i tillegg Epiblast-markøren Fgf5 og markører av linjeprimning, slik som Brachyury 8 . MESCer gir en trakettmodell for å undersøke mekanismer som styrer naive-primerte pluripotente overganger in vitro . Når de dyrkes i leukemiinhiberende faktor (LIF) og føtalt bovinserum (FBS), gjennomgår mESCs dynamisk overgang mellom naive og primede pluripotente tilstander 9 , 10 . LIF-Jak-Stat3 signalfunksjoner for å fremme et naivt genreguleringsnettverk 11 </Sup&gt;, mens autokrin signalering via fibroblastvekstfaktor 4 (Fgf4) Erk1 / 2-bane kjører overgang til grunnstatus 12 . Imidlertid er det fortsatt en utfordring å systematisk evaluere rollen av proteinkinaser ved spesifisering av forskjellige pluripotente tilstander. Her beskriver vi en kvantitativ og skalerbar plattform for å utføre målrettede små molekylskjermbilder for kinase-regulatorer av den naive-primede pluripotente overgangen. Vi bruker enkle mESC-kulturbetingelser og standardreagenser, materialer og utstyr for å avdekke og validere kinasehemmere med hittil ikke-verdsatt evne til å stabilisere naiv pluripotens. Videre drøfter vi potensielle utvidede bruksområder for denne teknologien, blant annet for screening av andre små molekylsamlinger som nye hemmerbiblioteker rettet mot epigenetiske regulatorer.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="573">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">mESC media</td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">CCE mESCs</td>
			<td style="width:71px;">ATCC</td>
			<td style="width:119px;">ATCC&#160;SCRC-1023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">DMEM Media</td>
			<td style="width:71px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">11965092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">L-Glutamine</td>
			<td style="width:71px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">25030081</td>
			<td>Final: 2mM</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Penicillin/Streptomycin</td>
			<td style="width:71px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">15140122</td>
			<td>Final: 50U/ml</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">2-mercaptoethanol</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">M6250</td>
			<td>Final: 0.1mM</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:216px;">Leukemia Inhibitory Factor (GST fusion)</td>
			<td style="width:71px;">MRC-PPU reagents and services</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Final: 100ng/ml</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Leukemia Inhibitory Factor</td>
			<td style="width:71px;">Thermo</td>
			<td style="width:119px;">PMC9484</td>
			<td>Final: 100ng/ml</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Non-Essential Amino Acids</td>
			<td style="width:71px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">11140050</td>
			<td>Final: 0.1mM</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Sodium Pyruvate</td>
			<td style="width:71px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">11360070</td>
			<td>Final: 1mM</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">KnockOut Serum Replacement</td>
			<td style="width:71px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">10828-028</td>
			<td>Final: 5%</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Defined Fetal Bovine Serum</td>
			<td style="width:71px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">10703464</td>
			<td>Final: 10%</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Name</td>
			<td style="width:71px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">TC materials</td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red</td>
			<td style="width:71px;">Thermo</td>
			<td style="width:119px;">25300054&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Gelatin from porcine skin</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">1890</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Nunc MicroWell 96-Well Microplates</td>
			<td style="width:71px;">Thermo</td>
			<td style="width:119px;">156545</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">DPBS, no calcium, no magnesium</td>
			<td style="width:71px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">14190136</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">V-bottom 96 well plates</td>
			<td style="width:71px;">Greiner Bio-one</td>
			<td style="width:119px;">651261</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Name</td>
			<td style="width:71px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Lysis Buffer</td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Tris buffer</td>
			<td style="width:71px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">103157P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Sodium Chloride</td>
			<td style="width:71px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">97061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">EDTA</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">E4884</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">1% NP-40</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">9016-45-9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Sodium Deoxycholate</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">D6750-100g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">&#946;-glycerophosphate</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">G9422</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Sodium Pyrophosphate</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">13472-36-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Sodium Fluoride</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">450022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Sodium Orthovanadate</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">450243</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Roche Complete Protease Inhibitor Cocktail Tablets</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">CO-RO</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Name</td>
			<td style="width:71px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Chemicals</td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Tween</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">P1379-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Milk Powder</td>
			<td style="width:71px;">Marvel</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Name</td>
			<td style="width:71px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Western Blotting</td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Protran BA 85 Nitrocellulose 0.45uM&#160; Pore size (20 X 20cm Sheets) (25 Sheet)</td>
			<td style="width:71px;">GE</td>
			<td style="width:119px;">10401191</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Ponceau S</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">P7170-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Name</td>
			<td style="width:71px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Laboratory Equipment</td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Minifold I System</td>
			<td style="width:71px;">GE</td>
			<td style="width:119px;">10447850</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">ChemiDoc imager</td>
			<td style="width:71px;">BioRad</td>
			<td style="width:119px;">1708280&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">LiCor Odyssey Imager</td>
			<td style="width:71px;">LiCor</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Name</td>
			<td style="width:71px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Antibodies</td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Anti-mouse Nanog</td>
			<td style="width:71px;">Reprocell</td>
			<td style="width:119px;">RCAB001P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Anti-Dnmt3b</td>
			<td>Imgenex</td>
			<td>IMG-184A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">IRDye 800CW Donkey anti-Rabbit</td>
			<td style="width:71px;">Licor</td>
			<td style="width:119px;">926-32213</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:216px;">Anti-mouse-HRP</td>
			<td style="width:71px;">Cell Signalling Technology</td>
			<td>7076S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Anti-Klf2</td>
			<td style="width:71px;">Millipore</td>
			<td style="width:119px;">09-820</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Anti-Klf4</td>
			<td style="width:71px;">R&#38;D Systems</td>
			<td style="width:119px;">AF3158</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Anti-Oct4</td>
			<td style="width:71px;">Santa Cruz</td>
			<td style="width:119px;">sc-5279</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a simple method to identify kinases that regulate embryonic stem cell pluripotency by high-throughput inhibitor screening

Embryonale stamceller (ESC) kan selvforny eller differensiere til alle celletyper, et fenomen kjent som pluripotency. Distinkte pluripotente stater er blitt beskrevet, betegnet &quot;naiv&quot; og &quot;primet&quot; pluripotency. Mekanismene som styrer naiv-grunnet overgang er dårlig forstått. Spesielt forblir vi dårlig informert om proteinkinaser som spesifiserer naive og primed pluripotent-stater, til tross for økt tilgjengelighet av høyverdige verktøyforbindelser for å probere kinasefunksjon. Her beskriver vi en skalerbar plattform for å utføre målrettede små molekylskjermbilder for kinase-regulatorer av den naive-primede pluripotente overgangen i mus-ESC-er. Denne tilnærmingen benytter enkle cellekulturbetingelser og standardreagenser, materialer og utstyr for å avdekke og validere kinaseinhibitorer med hittil ikke-verdsettede effekter på pluripotency. Vi diskuterer potensielle applikasjoner for denne teknologien, inkludert screening av andre små molekylerSamlinger som stadig mer sofistikerte kinasehemmere og nye biblioteker av epigenetiske verktøyforbindelser.

Ved å bruke prosedyren presentert her ( figur 1 ), skjermer vi LINCS-biblioteket med 228 potente og selektive kinasehemmere for å identifisere de som modulerer mESC-pluripotens. Biblioteket fremstilles ved en konsentrasjon på 0,1 mM for en 1: 100 fortynning og slutt screeningskonsentrasjon på 1 μM i mESCs. 48 timer senere ble mESCs lysert og ekstrakter fremstilt for kvantitativ dot-blot-analyse av Nanog- og Dnmt3b-ekspresjon ( figur 2 , topp). Resultater fra andre screeningskonsentrasjoner er ikke representert her for korthet. Nanog: Dnmt3b-forholdet bestemmes for hver kinaseinhibitor og forbindelser rangeres og en 2x avskjæring påføres ( figur 2 , bunn). Totalt Nanog- og Dnmt3b-signal i forhold til kontroll overlegges på inhibitorrangeringen og underkastes en 0,5x cut-off for å tillate triaging av inhibitorer som viser signifikant mESC-toksisitet. Velg kinaseinhibitorer som stabiliserer den naive stabilitetenTe er validert ved bruk av konvensjonell Nanog / Dnmt3b immunoblotting ( Figur 3 ). De primære kinase målene for disse inhibitorene er presentert i tabell 1 . Vi demonstrerer også bruken av dette skjermbildet for å identifisere inhibitorer som stabiliserer primed tilstanden 14 . <img alt="Figur 1" src="/files/ftp_upload/55515/55515fig1.jpg" /> Figur 1: Arbeidsflyt for screening av kinaseinhibitorer som modulerer naiv-grunnet overgang. MESC ble behandlet med et 228-forbindelseskinaseinhibitor-bibliotek ved en sluttkonsentrasjon på 1 uM. Lysater ble fremstilt og overført til nitrocellulosemembraner for immundot-blot-analyse, og nanog- og Dnmt3b-nivåer bestemt (Figur tilpasset fra Williams et al. 14 ). <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55515/55515fig1large.jpg" target="_blank">Vennligst klikk her for å se al</a><html> Arger versjon av denne figuren. <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/55515/55515fig2.jpg" /> Figur 2: Naiv-primet pluripotency-skjermanalyse og inhibitoridentifikasjon. (Top) Representative Nanog og Dnmt3b immuno dot-blot bilder. (Bunn) Nanog- og Dnmt3b-verdier for hver kinaseinhibitor ble bestemt i forhold til DMSO-kontrollen, og nanog: Dnmt3b-forhold og totalt relativt Nanog + Dnmt3b-signal bestemt og inhibitorer rangert i sammenligning med DMSO-kontroll. Inhibitorer som ble funnet å endre Nanog: Dnmt3b forholdet utover en 2-ganger terskel over eller under DMSO kontroll ble identifisert som drivere av naiv eller primet pluripotency. En terskel på 2x under DMSO-kontroll ble satt til triagehemmere som kompromitterer mESC-overlevelse. Inhibitorer valgt for videre validering er uthevet. (Figur tilpasset fra Williams et al. 14 ).S / ftp_upload / 55515 / 55515fig2large.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren. <img alt="Figur 3" src="/files/ftp_upload/55515/55515fig3.jpg" /> Figur 3: Validering av utvalgte hitforbindelser identifisert. MESC ble behandlet med enten 1 uM AZD4547 (en selektiv FGFR-inhibitor) eller de angitte inhibitorer identifisert fra skjermen i figur 2. Nanog: Dnmt3b nivåer bestemt ved standard SDS-PAGE og immunoblot analyse. Numeriske verdier av relative Nanog: Dnmt3b og Nanog + Dnmt3b er angitt i tabellen nedenfor, og inhibitorer som stabiliserer den naive pluripotente tilstanden fremhevet i grønt. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55515/55515fig3large.jpg" target="_blank">Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a> <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> forbindelse </td><td colspan="2"> Primærmål </td><td> Andre mål </td></tr><tr><td> AV-951 </td><td colspan="2"> VEGFR </td><td></td></tr><tr><td> HG-6-64-01 </td><td colspan="2"> ABL, BRAF, RET, CSF1R, EGFR, EPHA8, FGFR, FLT3, KIT, LOK, MAP4K1, p38b, MUSK, PDGFR, TAOK3, TNNI3K </td><td></td></tr><tr><td> WH-4-023 </td><td colspan="2"> Lek </td><td> src </td></tr><tr><td> R406 </td><td colspan="2"> Syk </td><td></td></tr><tr><td> GW-572016 </td><td colspan="2"> HER2 </td><td> EGFR </td></tr><tr><td> KIN001-244 </td><td colspan="2"> PDK1 </td><td></td></tr><tr><td> WZ-4-145 </td><td colspan="2"> CSF1R, DDR1, EGFR, TIE1, PDGFR2 </td><td></td></tr><tr><td> WZ-7043 </td><td colspan="2"> CSF1R, DDR1, FGFR og TAO1 </td><td></td></tr><tr><td> GW786034 </td><td colspan="2"> VEGFR1 </td><td> VEGFR2, VEGFR3 &amp;# 160; </td></tr><tr><td> AZD-1480 </td><td colspan="2"> JAK2 </td><td></td></tr></tbody></table> Tabell 1: Utvalgte hitforbindelser og deres primære kinase mål (er).

Watch this Scientific Journal Video about A Simple Method to Identify Kinases That Regulate Embryonic Stem Cell Pluripotency by High-throughput Inhibitor Screening at JoVE.com

A Simple Method to Identify Kinases That Regulate Embryonic Stem Cell Pluripotency by High-throughput Inhibitor Screening

Her presenterer vi en kvantitativ og skalerbar protokoll for å utføre målrettede små molekylskjermbilder for kinase-regulatorer av den naive-primede pluripotente overgangen.

En enkel metode for å identifisere kinaser som regulerer embryonisk stamcellepluripotens ved høy gjennomstrømningsinhibitor screening

Embryonic stem cells (ESCs) can self-renew or differentiate into all cell types, a phenomenon known as pluripotency. Distinct pluripotent states have been ...

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Forward Genetic Approach to Uncover Stress Resistance Genes in Mice &#8212; A High-throughput Screen in ES Cells

Forward Genetic Approach to Uncover Stress Resistance Genes in Mice ÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã¢â‚¬Â A High-throughput Screen in ES Cells

Forward Genetisk tilnærming til Avdekke Stress resistensgener i Mus - En High-throughput Screen i ES-celler

Phenotype-driven genetic screens in mice is a powerful technique to uncover gene functions, but are often hampered by extremely high costs, which severely ...

Generation of Aggregates of Mouse Embryonic Stem Cells that Show Symmetry Breaking, Polarization and Emergent Collective Behaviour In Vitro

Generation of Aggregates of Mouse Embryonic Stem Cells that Show Symmetry Breaking, Polarization and Emergent Collective Behaviour In Vitro

Generering av Aggregater av mus embryonale stamceller som Vis Symmetry Breaking, Polarisering og Emergent Collective Behaviour<em&gt; In Vitro</em

We have developed a protocol improving current Embryoid Body (EB) culture which allows the study of self-organization, symmetry breaking, axial elongation ...

Generating CRISPR/Cas9 Mediated Monoallelic Deletions to Study Enhancer Function in Mouse Embryonic Stem Cells

Generering CRISPR / Cas9 mediert Monoallelic Slett å studere Enhancer funksjon i mus embryonale stamceller

Enhancers control cell identity by regulating tissue-specific gene expression in a position and orientation independent manner. These enhancers are often ...

Epigenetic Conversion as a Safe and Simple Method to Obtain Insulin-secreting Cells from Adult Skin Fibroblasts

Epigenetisk konvertering som en trygg og enkel metode for å skaffe insulin-sekresjon celler fra voksne hudfibroblaster

Regenerative medicine requires new, fully functional cells that are delivered to patients in order to repair degenerated or damaged tissues. When such ...

Reprogramming Mouse Embryonic Fibroblasts with Transcription Factors to Induce a Hemogenic Program

Omprogrammering mus embryonale Fibroblaster med transkripsjonsfaktorer for å indusere en Hemogenic Program

This protocol details the induction of a hemogenic program in mouse embryonic fibroblasts (MEFs) via overexpression of transcription factors (TFs). We ...

A Versatile Mounting Method for Long Term Imaging of Zebrafish Development

En allsidig monteringsmetode for Long Term Imaging av Sebrafisk Development

Zebrafish embryos offer an ideal experimental system to study complex morphogenetic processes due to their ease of accessibility and optical transparency. ...

Rapid, Directed Differentiation of Retinal Pigment Epithelial Cells from Human Embryonic or Induced Pluripotent Stem Cells

Rask, rettet differensiering av netthinnens Pigment epitelceller fra menneskelige embryonale eller indusert Pluripotent stamceller

We describe a robust method to direct the differentiation of pluripotent stem cells into retinal pigment epithelial cells (RPE). The purpose of providing ...

CARIP-Seq and ChIP-Seq: Methods to Identify Chromatin-Associated RNAs and Protein-DNA Interactions in Embryonic Stem Cells

CARIP-Seq og ChIP-Seq: metoder for å identifisere Chromatin-assosiert RNAs og Protein-DNA interaksjoner i embryonale stamceller

Embryonic stem (ES) cell self-renewal&#160;and differentiation is governed by extrinsic signals and intrinsic networks of transcription factors, ...

Organotypic Culture Method to Study the Development Of Embryonic Chicken Tissues

Organotypic kultur metoden å studere utviklingen av embryonale kylling vev

The embryonic chicken is commonly used as a reliable model organism for vertebrate development. Its accessibility and short incubation period makes it ...

A Direct and Simple Method to Assess Drosophila melanogaster's Viability from Embryo to Adult

A Direct and Simple Method to Assess Drosophila melanogaster's Viability from Embryo to Adult

En direkte og enkel metode for å vurdere Drosophila melanogaster' s levedyktighet fra embryo til Adult

In Drosophila melanogaster, viability assays are used to determine the fitness of certain genetic backgrounds. Allelic variations can result in partial or ...