Name: a simple method to identify kinases that regulate embryonic stem cell pluripotency by high-throughput inhibitor screening
Uploaded: 2017-05-12T12:30:00
Duration: 7 min 18 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Simple Method to Identify Kinases That Regulate Embryonic Stem Cell Pluripotency by High-throughput Inhibitor Screening at JoVE.com

O CACW é apoiado por uma bolsa de doutorado do Conselho de Pesquisa Médica. A GMF é apoiada em parte por um Prêmio de Investigador do Novo Conselho de Investigação Médica (MR / N000609 / 1) e uma bolsa de investigação Tenovus Scotland.

1. Colocação de Bibliotecas de Inibidores de Quinase de Pequenas Moléculas <ol><li> Agrupar as bibliotecas de inibidores de colecções de inibidores de quinase publicamente acessíveis, por exemplo , a Biblioteca de Assinaturas Celulares Baseadas em Redes Integradas (LINCS) da Harvard Medical School, uma colecção selectiva de 228 inibidores de cinase potentes e selectivos (http://lincs.hms.harvard.edu) , E o Protein Kinase Inhibitor Set (PKIS), uma colecção de compostos 376 reunida por investigadores industriais (https://www.ebi.ac.uk/chembldb/extra/PKIS) 13 . Alternativamente, montar uma colecção de inibidor de cinase sob medida a partir de compostos comercialmente disponíveis. NOTA: Em nosso laboratório, reunimos uma coleção de 72 potentes e seletivos inibidores de quinase de ferramenta cobrindo 51 cinases-alvo primárias, todas as quais estão disponíveis a partir de fontes comerciais. </li><li> Reunir inibidores de cinase em placas de 96 poços para processamento ótimo de alto rendimento em concentrações múltiplas (use 1, 0,1 aNd 0,01 mM). Incluir em cada placa os poços de controlo contendo apenas DMSO e os inibidores de controlo de referência PD173074 (FGFRi) e Ruxolitinib (JAKi), que são conhecidos por promoverem estados pluripotentes inocentes e iniciados respectivamente. Anotar em uma planilha ou software similar. </li></ol> 2. Condições e Procedimentos de Cultura do MESC para a Preparação da Tela <ol><li> Preparar placas de 10 cm revestidas com gelatina a 0,1% por adição de 5 mL de gelatina a 0,1% (p / v) a placas de 10 cm e incubar à temperatura ambiente durante 5 min. Aspirar a gelatina e deixar a placa secar durante 2 min. </li><li> Cultivar qualquer linha mESC padrão a 37 ° C 5% CO 2 em placas de 10 cm revestidas com gelatina a 0,1% em meio mESC padrão (ver Tabela de Materiais) contendo 100 ng / mL de GST-LIF, 10% de Soro Fetal de Bezerro e 5% de Soro Knockout Substituição. Substituir mídia todos os dias e passagem mESCs em cerca de 80% de confluência a cada segundo dia em uma diluição de 1: 5-1: 10. </li><li> Para a passagem de mESCs, aspirar o meio e lavar com 5 mL deF de solução salina tamponada com fosfato (PBS) por placa. </li><li> Adicionar 1 mL de tripsina-EDTA (tripsina a 0,05%, EDTA a 0,02%) por placa de mESCs e incubar a 37 ° C durante 10 min. </li><li> Ressuspender as células tripsinizadas em 4 mL de meio mESC e centrifugar a 1200 rpm durante 5 min. </li><li> Ressuspender completamente o sedimento celular em 5 ml de meio mESC, pipetando para cima e para baixo para gerar uma única suspensão celular. </li><li> Contar células por combinação de 10 μL de suspensão celular e 10 μL de azul de tripano (0,4%). Colocar em uma câmara de contagem de células ou usar um hemocitômetro e microscópio de luz. </li><li> Semear 3 x 10 3 mESCs em placas de 96 poï¿½s revestidas com gelatina a 0,1%, volume final 100 ï¿½ de meio, utilizando uma pipeta multicanal. </li><li> Aplique os inibidores de cinase a uma diluição de 1: 100 (1 μl de inibidor adicionado a 100 μL de meio) utilizando uma pipeta multicanal. Pipetar suavemente a mídia para misturar inibidor e suspensão celular, em seguida, permitir que as células para resolver em uma capa de cultura de tecidos por 1 h para garantir a distribuição igual acroSs a superfície do chapeamento. Células de cultura durante 48 h sem alterar a mídia. NOTA: Placas de reserva de 1 / 0,1 / 0,01 mM darão uma concentração final de inibidor de 10/1 / 0,1 μM, respectivamente. Recomenda-se iniciar o ecrï¿½ numa concentraï¿½o final de 1 ï¿½ para assegurar a inibiï¿½o efectiva das cinases alvo primï¿½ias enquanto se minimizam os efeitos fora do alvo. </li></ol> 3. Análise de Rastreio de Inibidores de Quinase <ol><li> Lavar 96 placas de mESC bem em 200 μL de PBS usando um aspirador multicanal e pipetas. </li><li> Preparar extractos celulares em 150 μL de tampão de lise (Tris 20 mM, pH 7,4, NaCl 150 mM, EDTA 1 mM, NP-40 1% (v / v), desoxicolato de sódio a 0,5% (p / v), p-glicerofosfato 10 mM , Pirofosfato de sódio 10 mM, NaF 1 mM, Na3VO4 2 mM, Comprimidos Completos de Cocktail de Inibidor de Protease). </li><li> Clarificar os extractos por centrifugação a 1.500 xg durante 30 min em placas de 96 poços de fundo em V. </li><li> Imobilizar 100 μL de sobrenadantes num nitrocelMembrana de celulose utilizando um colector de manchas ponto de vácuo de 96 poços. </li><li> Secar a membrana e colorir com 40 mL de Ponceau S para assegurar uma transferência consistente. </li><li> Lavar a membrana com TBST e bloquear em TBST / 3% (p / v) de leite. </li><li> Incubar em anticorpos Nanog e Dnmt3b a uma diluição de 1: 1.000 (v / v) em TBST / 3% (p / v) de leite em pó durante a noite. </li><li> Lavar as membranas em 3 x 10 min em TBST e incubar em 30 mL de anticorpos secundários a uma diluição de 1: 10.000 (v / v) em TBST / 3% (p / v) de leite. </li><li> Desenvolver usando um sistema de imagem digital imunoblotting. NOTA: Se possível, use fluorescência quantitativa immunoblotting para detectar Nanog e Dnmt3b. No entanto, o sinal de fundo para Dnmt3b por imunoblotting de fluorescência é demasiado elevado. Por conseguinte, são utilizados anticorpos secundários de fluorescência anti-coelho (Nanog) e anti-HRP de ratinho (Dnmt3b) de 800 nm. </li></ol> 4. Análise de Dados de Tela e Validação de Inibidores como Reguladores de Pluripotência Bona Fide <p class="jove_content"&gt; NOTA: Esta é uma etapa crítica para garantir que somente os moduladores de pluripotência de boa-fé sejam identificados. É essencial para os inibidores de triagem com base tanto na relação Nanog: Dnmt3b como no sinal global, para garantir que os inibidores de cinase que afectam adversamente a sobrevivência do mESC não são seleccionados para análise posterior. <ol><li> Quantificar o sinal de Nanog e Dnmt3b usando o software de análise de imunotransferência e importar valores para uma planilha ou software similar. Calcular a relação Nanog: Dnmt3b para todas as amostras em comparação com o controlo do DMSO. Determinar também o sinal de Nanog e Dnmt3b total para assegurar que os inibidores de quinase não afectam a relação Nanog: Dnmt3b alterando a viabilidade do mESC. </li><li> Utilizar relações classificadas de Nanog: Dnmt3b para identificar inibidores que promovam a pluripotência naïve (razão Nanog: Dnmt3b superior ao controlo) e pluripotência iniciada (razão Nanog: Dnmt3b inferior ao controlo). Defina o corte em 2x desvio dos valores de controle e filtre os inibidores de quinase que produzem um sinal Nanog + Dnmt3b total menor que50% do valor de controlo de DMSO para gerar uma lista de confiança elevada de inibidores de cinase que estabilizam os estados pluripotentes naïve (razão Nanog: Dnmt3b elevada) e iniciada (razão Nanog: Dnmt3b baixa). </li><li> Validar inibidores de quinase semeando mESCs a 2 x 10 5 células por 6 poços em 2 mL de meio, e adicionar inibidores de cinase a 1 μM durante 48 h, sem alterar a mídia. </li><li> Lyse mESCs em lise buffer e analisar Nanog e Dnmt3b expressão convencional SDS-PAGE immunoblotting. </li><li> Validam ainda mais os resultados por imunotransferência de SDS-PAGE para marcadores de pluripotência níve Klf2 e Klf4 e Oct4 para assegurar que a pluripotência é mantida após 48 h de tratamento com inibidor. </li></ol>

<ol>
	<li>Evans, M. J., Kaufman, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+in+culture+of+pluripotential+cells+from+mouse+embryos.">Establishment in culture of pluripotential cells from mouse embryos.</a> Nature. 292 (5819), 154-156 (1981).</li><li>Nichols, J., Smith, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Naive+and+primed+pluripotent+states.">Naive and primed pluripotent states.</a> Cell Stem Cell. 4 (6), 487-492 (2009).</li><li>Boroviak, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lineage-Specific+Profiling+Delineates+the+Emergence+and+Progression+of+Naive+Pluripotency+in+Mammalian+Embryogenesis.">Lineage-Specific Profiling Delineates the Emergence and Progression of Naive Pluripotency in Mammalian Embryogenesis.</a> Developmental Cell. 35 (3), 366-382 (2015).</li><li>Tesar, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+cell+lines+from+mouse+epiblast+share+defining+features+with+human+embryonic+stem+cells.">New cell lines from mouse epiblast share defining features with human embryonic stem cells.</a> Nature. 448 (7150), 196-199 (2007).</li><li>Brons, I. G. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Derivation+of+pluripotent+epiblast+stem+cells+from+mammalian+embryos.">Derivation of pluripotent epiblast stem cells from mammalian embryos.</a> Nature. 448 (7150), 191-195 (2007).</li><li>Festuccia, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Esrrb+is+a+direct+Nanog+target+gene+that+can+substitute+for+Nanog+function+in+pluripotent+cells.">Esrrb is a direct Nanog target gene that can substitute for Nanog function in pluripotent cells.</a> Cell Stem Cell. 11 (4), 477-490 (2012).</li><li>Ficz, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FGF+signaling+inhibition+in+ESCs+drives+rapid+genome-wide+demethylation+to+the+epigenetic+ground+state+of+pluripotency.">FGF signaling inhibition in ESCs drives rapid genome-wide demethylation to the epigenetic ground state of pluripotency.</a> Cell Stem Cell. 13 (3), 351-359 (2013).</li><li>Guo, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Klf4+reverts+developmentally+programmed+restriction+of+ground+state+pluripotency.">Klf4 reverts developmentally programmed restriction of ground state pluripotency.</a> Development. 136 (7), 1063-1069 (2009).</li><li>Chambers, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanog+safeguards+pluripotency+and+mediates+germline+development.">Nanog safeguards pluripotency and mediates germline development.</a> Nature. 450 (7173), 1230-1234 (2007).</li><li>Findlay, G. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interaction+domains+of+Sos1/Grb2+are+finely+tuned+for+cooperative+control+of+embryonic+stem+cell+fate.">Interaction domains of Sos1/Grb2 are finely tuned for cooperative control of embryonic stem cell fate.</a> Cell. 152 (5), 1008-1020 (2013).</li><li>Niwa, H., Burdon, T., Chambers, I., Smith, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-renewal+of+pluripotent+embryonic+stem+cells+is+mediated+via+activation+of+STAT3.">Self-renewal of pluripotent embryonic stem cells is mediated via activation of STAT3.</a> Genes Dev. 12 (13), 2048-2060 (1998).</li><li>Kunath, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FGF+stimulation+of+the+Erk1/2+signalling+cascade+triggers+transition+of+pluripotent+embryonic+stem+cells+from+self-renewal+to+lineage+commitment.">FGF stimulation of the Erk1/2 signalling cascade triggers transition of pluripotent embryonic stem cells from self-renewal to lineage commitment.</a> Development. 134 (16), 2895-2902 (2007).</li><li>Elkins, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+characterization+of+the+Published+Kinase+Inhibitor+Set.">Comprehensive characterization of the Published Kinase Inhibitor Set.</a> Nature Biotechnology. 34 (1), 95-103 (2016).</li><li>Williams, C. A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Erk5+Is+a+Key+Regulator+of+Naive-Primed+Transition+and+Embryonic+Stem+Cell+Identity.">Erk5 Is a Key Regulator of Naive-Primed Transition and Embryonic Stem Cell Identity.</a> Cell Reports. 16 (7), 1820-1828 (2016).</li><li>Cao, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conversion+of+human+fibroblasts+into+functional+cardiomyocytes+by+small+molecules.">Conversion of human fibroblasts into functional cardiomyocytes by small molecules.</a> Science. 352 (6290), (2016).</li><li>Zhang, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pharmacological+reprogramming+of+fibroblasts+into+neural+stem+cells+by+signaling-directed+transcriptional+activation.">Pharmacological reprogramming of fibroblasts into neural stem cells by signaling-directed transcriptional activation.</a> Cell Stem Cell. 18 (5), 653-667 (2016).</li></ol>

Os autores declaram não haver conflitos de interesse decorrentes deste estudo.

Aqui nós demonstramos uma metodologia amplamente acessível para sondar o papel das vias de sinalização de quinase na regulação da transição pluripotente iniciada na primitiva. Isso aborda uma questão chave no campo ESC. Embora as abordagens genômicas e transcriptômicas de alto rendimento sejam rotineiramente usadas para identificar reguladores transcripcionais chave de estados pluripotentes ingênuos e iniciados, a elucidação de redes de sinalização de pluripotência provou ser um desafio. Nós agora fornecemos uma estratégia flexível empregando inibidores químicos para identificar quinases que controlam a transição pluripotente iniciada na primitiva em mESCs. Isso depende de equipamentos simples, reagentes e materiais que estão disponíveis para a maioria dos laboratórios que estudam sinalização celular e ESC biologia. Crítico para o sucesso desta plataforma é o nosso desenvolvimento de um robusto ensaio para quantificar a transição entre naif e primado pluripotente estados. O estabelecimento deste ensaio exigiu modificações iterativas significativasDensidade, tempo de incubação do inibidor e condições de immunoblotting. Abordagens de pequenas moléculas estão ganhando força para uso racional em aplicações terapêuticas ESC 15 , 16 . Uma grande vantagem da triagem de moléculas pequenas é que os compostos de ferramenta são concebidos e / ou modificados para uma absorção celular eficiente. A eficiência de transfecção não é limitante e não é necessário o uso de sistemas de distribuição perigosos, tais como o lentivírus. Além disso, inibidores freqüentemente inibem múltiplas isoformas dentro de uma família de quinase ( eg Fgfr1-4, Jak1-3), que supera a redundância funcional que dificulta técnicas de interferência genética / genômica como RNAi e CRISPR / Cas9. À medida que os compostos de ferramentas mais potentes e selectivos tornam-se disponíveis a partir de programas de descoberta de fármacos académicos e farmacêuticos, as quinases pouco estudadas e mal compreendidas serão empurradas para a vanguarda da investigação do ESC. Propomos, portanto, que esteA abordagem de rastreio de &quot;roughput&quot; abrangerá novas vias de investigação em redes reguladoras do CES. Uma limitação menor desta tecnologia é que mesmo os mais potentes e selectivos inibidores de moléculas pequenas envolvem e inibem múltiplas cinases não relacionadas in vivo . Contudo, os dados de perfilamento de inibidores de quinase, cada vez mais abrangentes, permitem que alvos funcionais de inibidores de quinase sejam facilmente identificados (http://lincs.hms.harvard.edu/kinomescan; http://www.kinase-screen.mrc.ac.uk/kinase -inibidores). Finalmente, em princípio, a nossa plataforma pode ser aplicada para interrogar qualquer recolha de moléculas pequenas e / ou ensaio celular para o qual estão disponíveis anticorpos de imunotransferência de alta qualidade. Isto permitirá o estudo de múltiplos sistemas reguladores na regulação da pluripotência e facilitará a identificação de pequenos inibidores de moléculas que modificam diversos processos celulares. Especificamente, prevê-se que a aplicação de pequenas colecções de moléculas emergentes, tais como o epigeneTic sondas desenvolvidas pelo Structural Genomics Consortium (http://www.thesgc.org/chemical-probes/epigenetics) tem o potencial de descobrir mais novos reguladores de transições pluripotentes.

As células estaminais embrionárias têm a capacidade de se auto-renovar ou se diferenciar em qualquer tipo celular no corpo adulto, fenômeno conhecido como pluripotência 1 . Evidências recentes indicam que existem estados pluripotentes distintos do desenvolvimento, denominados pluripotência &quot;naïve&quot; e &quot;iniciada&quot; 2 . Naïve CES representam um estado de desenvolvimento semelhante ao encontrado no embrião pré-implantação 3 . Em contraste, os CEP pluripotentes primários estão preparados para sair da pluripotência e se diferenciar em linhagens embrionárias especializadas 4 , 5 . Os estados pluripotentes ingênuos e iniciados são marcados por redes reguladoras genéticas distintas. A pluripotência naive é caracterizada pela expressão de factores de transcrição de pluripotência chave tais como Nanog, factores de transcrição tipo Krueppel (Klfs), Rex1 2 e Esrrb <supClass = &quot;xref&quot;&gt; 6. Em ESCs de ratinho (mESCs), a pluripotência iniciada é caracterizada pela expressão reduzida de marcadores ingênuos e uma assinatura de expressão genética específica que inclui a ADN metiltransferase de novo Dnmt3b 7 . In vivo , células pluripotentes primitivas pós-implantação de epiblasto (EpiSCs) 4 , 5 expressam adicionalmente o marcador de Epiblast Fgf5 e marcadores de iniciação de linhagem, tais como Brachyury 8 . Os mESCs fornecem um modelo tratável para sondar os mecanismos que controlam as transições pluripotentes primitivas iniciadas in vitro . Quando cultivados em fator inibidor de leucemia (LIF) e soro fetal bovino (FBS), os mESCs passam por transição dinâmica entre estados pluripotentes ingênuos e iniciados 9,10 . Funções de sinalização LIF-Jak-Stat3 para promover uma rede de regulação de genes naif 11 </Sup&gt;, enquanto a sinalização autocrina através da via Erk1 / 2 do factor de crescimento de fibroblastos 4 (Fgf4) conduz a transição para o estado iniciado 12 . Contudo, continua a ser um desafio avaliar sistematicamente o papel das proteínas quinases na especificação de estados pluripotentes distintos. Aqui, descrevemos uma plataforma quantitativa e escalonável para a realização de telas de moléculas pequenas direcionadas para os reguladores de quinase da transição pluripotente iniciada na primitiva. Utilizamos condições de cultura mESC simples e reagentes padrão, materiais e equipamentos para descobrir e validar inibidores de quinase com capacidade até então não apreciada para estabilizar a pluripotência naïve. Além disso, discutem-se potenciais aplicações alargadas para esta tecnologia, incluindo o rastreio de outras colecções de moléculas pequenas, tais como bibliotecas de inibidores emergentes que visam reguladores epigenéticos.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="573">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">mESC media</td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">CCE mESCs</td>
			<td style="width:71px;">ATCC</td>
			<td style="width:119px;">ATCC&#160;SCRC-1023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">DMEM Media</td>
			<td style="width:71px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">11965092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">L-Glutamine</td>
			<td style="width:71px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">25030081</td>
			<td>Final: 2mM</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Penicillin/Streptomycin</td>
			<td style="width:71px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">15140122</td>
			<td>Final: 50U/ml</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">2-mercaptoethanol</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">M6250</td>
			<td>Final: 0.1mM</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:216px;">Leukemia Inhibitory Factor (GST fusion)</td>
			<td style="width:71px;">MRC-PPU reagents and services</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Final: 100ng/ml</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Leukemia Inhibitory Factor</td>
			<td style="width:71px;">Thermo</td>
			<td style="width:119px;">PMC9484</td>
			<td>Final: 100ng/ml</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Non-Essential Amino Acids</td>
			<td style="width:71px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">11140050</td>
			<td>Final: 0.1mM</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Sodium Pyruvate</td>
			<td style="width:71px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">11360070</td>
			<td>Final: 1mM</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">KnockOut Serum Replacement</td>
			<td style="width:71px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">10828-028</td>
			<td>Final: 5%</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Defined Fetal Bovine Serum</td>
			<td style="width:71px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">10703464</td>
			<td>Final: 10%</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Name</td>
			<td style="width:71px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">TC materials</td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red</td>
			<td style="width:71px;">Thermo</td>
			<td style="width:119px;">25300054&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Gelatin from porcine skin</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">1890</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Nunc MicroWell 96-Well Microplates</td>
			<td style="width:71px;">Thermo</td>
			<td style="width:119px;">156545</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">DPBS, no calcium, no magnesium</td>
			<td style="width:71px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">14190136</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">V-bottom 96 well plates</td>
			<td style="width:71px;">Greiner Bio-one</td>
			<td style="width:119px;">651261</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Name</td>
			<td style="width:71px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Lysis Buffer</td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Tris buffer</td>
			<td style="width:71px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">103157P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Sodium Chloride</td>
			<td style="width:71px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">97061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">EDTA</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">E4884</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">1% NP-40</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">9016-45-9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Sodium Deoxycholate</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">D6750-100g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">&#946;-glycerophosphate</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">G9422</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Sodium Pyrophosphate</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">13472-36-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Sodium Fluoride</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">450022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Sodium Orthovanadate</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">450243</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Roche Complete Protease Inhibitor Cocktail Tablets</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">CO-RO</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Name</td>
			<td style="width:71px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Chemicals</td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Tween</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">P1379-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Milk Powder</td>
			<td style="width:71px;">Marvel</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Name</td>
			<td style="width:71px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Western Blotting</td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Protran BA 85 Nitrocellulose 0.45uM&#160; Pore size (20 X 20cm Sheets) (25 Sheet)</td>
			<td style="width:71px;">GE</td>
			<td style="width:119px;">10401191</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Ponceau S</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">P7170-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Name</td>
			<td style="width:71px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Laboratory Equipment</td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Minifold I System</td>
			<td style="width:71px;">GE</td>
			<td style="width:119px;">10447850</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">ChemiDoc imager</td>
			<td style="width:71px;">BioRad</td>
			<td style="width:119px;">1708280&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">LiCor Odyssey Imager</td>
			<td style="width:71px;">LiCor</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Name</td>
			<td style="width:71px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Antibodies</td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Anti-mouse Nanog</td>
			<td style="width:71px;">Reprocell</td>
			<td style="width:119px;">RCAB001P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Anti-Dnmt3b</td>
			<td>Imgenex</td>
			<td>IMG-184A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">IRDye 800CW Donkey anti-Rabbit</td>
			<td style="width:71px;">Licor</td>
			<td style="width:119px;">926-32213</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:216px;">Anti-mouse-HRP</td>
			<td style="width:71px;">Cell Signalling Technology</td>
			<td>7076S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Anti-Klf2</td>
			<td style="width:71px;">Millipore</td>
			<td style="width:119px;">09-820</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Anti-Klf4</td>
			<td style="width:71px;">R&#38;D Systems</td>
			<td style="width:119px;">AF3158</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Anti-Oct4</td>
			<td style="width:71px;">Santa Cruz</td>
			<td style="width:119px;">sc-5279</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a simple method to identify kinases that regulate embryonic stem cell pluripotency by high-throughput inhibitor screening

As células estaminais embrionárias (CES) podem auto-renovar ou diferenciar-se em todos os tipos de células, um fenômeno conhecido como pluripotência. Distintos estados pluripotentes foram descritos, denominados pluripotência &quot;ingênua&quot; e &quot;preparada&quot;. Os mecanismos que controlam a transição na primitiva são mal compreendidos. Em particular, permanecemos mal informados sobre proteínas quinases que especificam naïve e primado pluripotentes estados, apesar de aumentar a disponibilidade de alta qualidade ferramenta de compostos para sonda kinase função. Aqui, descrevemos uma plataforma escalável para executar telas de moléculas pequenas direcionadas para reguladores de cinase da transição pluripotente iniciada na primitiva em ESCs de mouse. Esta abordagem utiliza condições simples de cultura de células e reagentes padrão, materiais e equipamentos para descobrir e validar inibidores de cinase com efeitos até agora não apreciados na pluripotência. Discutimos possíveis aplicações para esta tecnologia, incluindo a triagem de outras moléculas pequenasColecções tais como inibidores de cinase cada vez mais sofisticados e bibliotecas emergentes de compostos de ferramentas epigenéticos.

Utilizando o procedimento aqui apresentado ( Figura 1 ), seleccionamos a biblioteca LINCS de 228 inibidores de cinase potentes e selectivos para identificar aqueles que modulam a pluripotência mESC. A biblioteca é preparada a uma concentração de 0,1 mM para uma diluição 1: 100 e concentração final de rastreio de 1 μM em mESCs. 48 h mais tarde, mESCs foram lisadas e extratos preparados para análise quantitativa dot blot de Nanog e Dnmt3b expressão ( Figura 2 , topo). Os resultados de outras concentrações de rastreio não são aqui representados por brevidade. A proporção de Nanog: Dnmt3b é determinada para cada inibidor de cinase e compostos classificados e um corte 2x aplicado ( Figura 2 , parte inferior). O sinal de Nanog e Dnmt3b total em relação ao controlo é sobreposto à classificação de inibidor e sujeito a um corte de 0,5x, para permitir a triagem de inibidores que mostram toxicidade mESC significativa. Os inibidores de cinase seleccionados que estabilizam aTe são validadas utilizando a imunotransferência convencional Nanog / Dnmt3b ( Figura 3 ). As metas de cinase primária destes inibidores são apresentadas na Tabela 1 . Também demonstramos a aplicabilidade desta tela para identificar inibidores que estabilizam o estado iniciado 14 . <img alt="figura 1" src="/files/ftp_upload/55515/55515fig1.jpg" /> Figura 1: Fluxo de trabalho para a triagem de inibidores de cinase que modulam a transição iniciada por ingestão. MESC foram tratados com uma biblioteca de inibidor de cinase de composto 228 a uma concentração final de 1 μM. Os lisados ​​foram preparados e transferidos para membranas de nitrocelulose para análise de imunotransferência, e determinaram-se os níveis de Nanog e Dnmt3b (Figura adaptada de Williams et al., 14 ). <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55515/55515fig1large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver al</a><html> Versão arger desta figura. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/55515/55515fig2.jpg" /> Figura 2: Análise de tela de pluripotência iniciada por Naïve e identificação de inibidor. (Top) Imagens de imunotransferência de imagens Nanog e Dnmt3b representativas. (Inferior) Determinaram-se os valores de Nanog e Dnmt3b para cada inibidor de quinase em relação ao controlo de DMSO e determinaram-se as proporções de Nanog: Dnmt3b e o sinal relativo total de Nanog + Dnmt3b e os inibidores foram classificados em comparação com o controlo de DMSO. Identificaram-se inibidores que alteram a proporção de Nanog: Dnmt3b para além de um limite de 2 vezes acima ou abaixo do controlo de DMSO como condutores de pluripotência inocente ou iniciada. Um limiar de 2x abaixo do controlo de DMSO foi ajustado para inibidores de triagem que comprometem a sobrevivência de mESC. Os inibidores seleccionados para validação adicional são realçados. (Figura adaptada de Williams et al., 14 ).S / ftp_upload / 55515 / 55515fig2large.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; Clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/55515/55515fig3.jpg" /> Figura 3: Validação de compostos seleccionados identificados. MESCs foram tratados quer com 1 μM de AZD4547 (um inibidor de FGFR selectivo) quer com os inibidores indicados identificados a partir do ecrã da Figura 2. Nanog: Níveis de Dnmt3b determinados por SDS-PAGE e análise de imunotransferência padrão. Os valores numéricos de Nanog relativo: Dnmt3b e Nanog + Dnmt3b são indicados na tabela abaixo, e os inibidores que estabilizam o estado pluripotente naïve realçado em verde. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55515/55515fig3large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> Composto </td><td colspan="2"> Alvos Principais </td><td> Outros alvos </td></tr><tr><td> AV-951 </td><td colspan="2"> VEGFR </td><td></td></tr><tr><td> HG-6-64-01 </td><td colspan="2"> ABL, BRAF, RET, CSF1R, EGFR, EPHA8, FGFR, FLT3, KIT, LOK, MAP4K1, p38b, MUSK, PDGFR, TAOK3, TNNI3K </td><td></td></tr><tr><td> WH-4-023 </td><td colspan="2"> Lck </td><td> Src </td></tr><tr><td> R406 </td><td colspan="2"> Syk </td><td></td></tr><tr><td> GW-572016 </td><td colspan="2"> HER2 </td><td> EGFR </td></tr><tr><td> KIN001-244 </td><td colspan="2"> PDK1 </td><td></td></tr><tr><td> WZ-4-145 </td><td colspan="2"> CSF1R, DDR1, EGFR, TIE1, PDGFR2 </td><td></td></tr><tr><td> WZ-7043 </td><td colspan="2"> CSF1R, DDR1, FGFR e TAO1 </td><td></td></tr><tr><td> GW786034 </td><td colspan="2"> VEGFR1 </td><td> VEGFR2, VEGFR3 &amp;# 160; </td></tr><tr><td> AZD-1480 </td><td colspan="2"> JAK2 </td><td></td></tr></tbody></table> Tabela 1: Compostos acertados selecionados e seu (s) alvo (s) cinase primário (s).

Watch this Scientific Journal Video about A Simple Method to Identify Kinases That Regulate Embryonic Stem Cell Pluripotency by High-throughput Inhibitor Screening at JoVE.com

A Simple Method to Identify Kinases That Regulate Embryonic Stem Cell Pluripotency by High-throughput Inhibitor Screening

Aqui, apresentamos um protocolo quantitativo e escalável para realizar telas de moléculas pequenas direcionadas para os reguladores de cinase da transição pluripotente iniciada na primitiva.

Um método simples para identificar quinases que regulam a pluripotência de células estaminais embrionárias por meio de triagem de inibidores de alto rendimento

Embryonic stem cells (ESCs) can self-renew or differentiate into all cell types, a phenomenon known as pluripotency. Distinct pluripotent states have been ...

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Forward Genetic Approach to Uncover Stress Resistance Genes in Mice &#8212; A High-throughput Screen in ES Cells

Forward Genetic Approach to Uncover Stress Resistance Genes in Mice ÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã¢â‚¬Â A High-throughput Screen in ES Cells

Abordagem genética para a frente para descobrir genes de resistência a estresse em ratos - Uma tela de alta capacidade em células ES

Phenotype-driven genetic screens in mice is a powerful technique to uncover gene functions, but are often hampered by extremely high costs, which severely ...

Biologia do Desenvolvimento

Generation of Aggregates of Mouse Embryonic Stem Cells that Show Symmetry Breaking, Polarization and Emergent Collective Behaviour In Vitro

Generation of Aggregates of Mouse Embryonic Stem Cells that Show Symmetry Breaking, Polarization and Emergent Collective Behaviour In Vitro

Geração de Agregados of Mouse Células-Tronco Embrionárias que mostram quebra de simetria, Polarização e Comportamento Coletivo Emergent<em&gt; In Vitro</em

We have developed a protocol improving current Embryoid Body (EB) culture which allows the study of self-organization, symmetry breaking, axial elongation ...

Generating CRISPR/Cas9 Mediated Monoallelic Deletions to Study Enhancer Function in Mouse Embryonic Stem Cells

Gerando CRISPR / Cas9 Mediated monoalélicos Eliminações para estudar a função Enhancer em células-tronco embrionárias de camundongos

Enhancers control cell identity by regulating tissue-specific gene expression in a position and orientation independent manner. These enhancers are often ...

Epigenetic Conversion as a Safe and Simple Method to Obtain Insulin-secreting Cells from Adult Skin Fibroblasts

Conversão epigenética como um método seguro e simples para obter células secretoras de insulina a partir de fibroblastos da pele de adultos

Regenerative medicine requires new, fully functional cells that are delivered to patients in order to repair degenerated or damaged tissues. When such ...

Reprogramming Mouse Embryonic Fibroblasts with Transcription Factors to Induce a Hemogenic Program

Reprogramação do rato embrionárias fibroblastos com Fatores de transcrição para induzir um Programa hegemônicos

This protocol details the induction of a hemogenic program in mouse embryonic fibroblasts (MEFs) via overexpression of transcription factors (TFs). We ...

A Versatile Mounting Method for Long Term Imaging of Zebrafish Development

Um método de montagem versátil para Long Term Imagens de Desenvolvimento Zebrafish

Zebrafish embryos offer an ideal experimental system to study complex morphogenetic processes due to their ease of accessibility and optical transparency. ...

Rapid, Directed Differentiation of Retinal Pigment Epithelial Cells from Human Embryonic or Induced Pluripotent Stem Cells

Rápida, dirigida a diferenciação de células epiteliais de pigmento Retinal de células-tronco humanas embrionárias ou induzida de Pluripotent

We describe a robust method to direct the differentiation of pluripotent stem cells into retinal pigment epithelial cells (RPE). The purpose of providing ...

CARIP-Seq and ChIP-Seq: Methods to Identify Chromatin-Associated RNAs and Protein-DNA Interactions in Embryonic Stem Cells

CARIP-Seq e ChIP-Seq: métodos para identificar a cromatina associada RNAs e interações da proteína-ADN em células-tronco embrionárias

Embryonic stem (ES) cell self-renewal&#160;and differentiation is governed by extrinsic signals and intrinsic networks of transcription factors, ...

Organotypic Culture Method to Study the Development Of Embryonic Chicken Tissues

Cultura de organotypic método para estudar o desenvolvimento de tecidos embrionários de galinha

The embryonic chicken is commonly used as a reliable model organism for vertebrate development. Its accessibility and short incubation period makes it ...

A Direct and Simple Method to Assess Drosophila melanogaster's Viability from Embryo to Adult

A Direct and Simple Method to Assess Drosophila melanogaster's Viability from Embryo to Adult

Um método direto e simples para avaliar a viabilidade da Drosophila melanogasterdo embrião ao adulto

In Drosophila melanogaster, viability assays are used to determine the fitness of certain genetic backgrounds. Allelic variations can result in partial or ...