Name: a simple method to identify kinases that regulate embryonic stem cell pluripotency by high-throughput inhibitor screening
Uploaded: 2017-05-12T12:30:00
Duration: 7 min 18 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Simple Method to Identify Kinases That Regulate Embryonic Stem Cell Pluripotency by High-throughput Inhibitor Screening at JoVE.com

CACW stöds av ett doktorandforskning för medicinska forskningsrådet. GMF stöds delvis av ett nytt forskningsinstitut för medicinskt forskningsråd (MR / N000609 / 1) och ett Tenovus Skottlands forskningsbidrag.

1. Sammanställning av biblioteken med små molekyler med Kinase-inhibitorer <ol><li> Samla in inhibitorbibliotek från offentligt tillgängliga kinashämmarkollektioner, t.ex. Bibliotek av integrerade nätverksbaserade cellulära signaturer (LINCS) från Harvard Medical School, en riktade samling av 228 potenta och selektiva kinashämmare (http://lincs.hms.harvard.edu) , Och Protein Kinase Inhibitor Set (PKIS), en samling 376 sammansatt av industriforskare (https://www.ebi.ac.uk/chembldb/extra/PKIS) 13 . Alternativt, montera en skräddarsydd kinashämmareuppsamling från kommersiellt tillgängliga föreningar. OBS! I vårt laboratorium har vi samlat en samling av 72 potenta och selektiva verktygskinashämmare som täcker 51 primära målkinaser, vilka alla är tillgängliga från kommersiella källor. </li><li> Montera kinashämmare i plattor med 96 brunnar för optimal hög genomströmning vid flera koncentrationer (använd 1, 0,1 aNd 0,01 mM). Inkludera i varje platta kontrollbrunnar innehållande endast DMSO och referenskontrollhämmare PD173074 (FGFRi) och Ruxolitinib (JAKi), vilka är kända för att främja naiva respektive primerade pluripotenta tillstånd. Anteckna i ett kalkylblad eller liknande programvara. </li></ol> 2. MESC-kulturbetingelser och förfaranden för screenframställning <ol><li> Förbered 0,1% gelatinbehandlade 10 cm rätter genom att tillsätta 5 ml 0,1% (vikt / vol) gelatin till 10 cm plattor och inkubera vid rumstemperatur i 5 min. Aspirera gelatin och låt plattan torka i 2 minuter. </li><li> Kultur vilken standard mESC-linje vid 37 ° C 5% CO2 på 0,1% gelatinbehandlade 10 cm rätter i standardmESC-media (se materialtabell ) innehållande 100 ng / ml GST-LIF, 10% fetalt kalvserum och 5% Knockout Serum Ersättning. Byt media varje dag och passera mESC: er vid 80% konfluens varannan dag med en utspädning av 1: 5-1: 10. </li><li> För att passera mESC, aspirera media och tvätta med 5 ml oF fosfatbuffrad saltlösning (PBS) per platta. </li><li> Tillsätt 1 ml trypsin-EDTA (0,05% trypsin, 0,02% EDTA) per platta mESC och inkubera vid 37 ° C i 10 min. </li><li> Resuspendera trypsiniserade celler i 4 ml mESC media och centrifugera vid 1200 rpm i 5 min. </li><li> Resuspendera cellpelleten noggrant i 5 ml mESC-media, pipettera upp och ner för att generera en enda cellsuspension. </li><li> Räkna celler genom att kombinera en 10 | il cell suspension och 10 | il Trypan Blue (0.4%). Placera i en cellräkningskammare eller använd en hemocytometer och ljusmikroskop. </li><li> Frö 3 x 10 3 mESC i 0,1% gelatinbelagda 96-brunnsplattor, slutvolym 100 | il medier, med användning av en flerkanalspipett. </li><li> Applicera kinashämmare vid 1: 100 spädning (1 μl hämmare tillsatt till 100 μl media) med en flerkanalspipett. Försiktigt pipettera media för att blanda hämmare och cellsuspension, sedan låta cellerna sätta sig i en vävnadsodlingshuva i 1 h för att säkerställa lika fördelning acroSs pläteringsytan. Kulturceller i 48 h utan att byta media. OBS: Lagerplattor med 1 / 0,1 / 0,01 mM ger en slutlig hämmarkoncentration av 10/1 / 0,1 μM respektive. Vi rekommenderar att du startar skärmen vid en slutlig koncentration av 1 μM för att säkerställa effektiv inhibering av primära målkinaser samtidigt som off-target-effekter minimeras. </li></ol> 3. Kinasinhibitor Screening Analysis <ol><li> Tvätta 96-brunns mESC-plattor i 200 pl PBS med användning av flerkanaligt aspirator och pipetter. </li><li> Gör cellextrakt i 150 μl lysisbuffert (20 mM Tris pH 7,4, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1% NP-40 (volym / volym), 0,5% natriumdeoxikolat (vikt / volym), 10 mM p-glycerofosfat , 10 mM natriumpyrofosfat, 1 mM NaF, 2 mM Na3VO4, komplett proteashämmare-cocktailtabletter). </li><li> Förtydliga extrakt genom centrifugering vid 1 500 xg i 30 min i V-bottenplattor med 96 brunnar. </li><li> Immobilisera 100 μl supernatanter på ett nitrocellLulosmembran med användning av en 96-brunns vakuumdot-blottförgrening. </li><li> Torka membranet och fläck med 40 ml Ponceau S för att säkerställa överensstämmande överföring. </li><li> Tvätta membran med TBST och blockera i TBST / 3% (vikt / volym) mjölk. </li><li> Inkubera i Nanog och Dnmt3b antikroppar vid en utspädning av 1: 1000 (v / v) i TBST / 3% (vikt / volym) mjölkpulver över natten. </li><li> Tvätta membran på 3 x 10 min i TBST och inkubera i 30 ml sekundära antikroppar vid en spädning av 1: 10 000 (volym / volym) i TBST / 3% (vikt / volym) mjölk. </li><li> Utveckla med hjälp av ett digitalt immunoblottande bildsystem. OBS! Om möjligt, använd immunoblottning med kvantitativ fluorescens för att detektera Nanog och Dnmt3b. Bakgrundssignalen för Dnmt3b genom fluorescensimmunoblottning är dock för hög. Därför används 800 nm fluorescens anti-kanin (Nanog) och anti-mus-HRP (Dnmt3b) sekundära antikroppar. </li></ol> 4. Analys av skärmdata och validering av inhibitorer som Bona Fide Pluripotency Regulators <p class="jove_content"&gt; OBS! Detta är ett kritiskt steg för att säkerställa att endast bona fide pluripotensmodulatorer identifieras. Det är viktigt att triagehämmare baseras på både Nanog: Dnmt3b-förhållandet och den övergripande signalen, för att säkerställa att kinashämmare som negativt påverkar mESC-överlevnad inte väljs för ytterligare analys. <ol><li> Kvantifiera Nanog- och Dnmt3b-signalen med hjälp av immunoblottningsanalysprogram och importera värden till ett kalkylblad eller liknande programvara. Beräkna Nanog: Dnmt3b-förhållandet för alla prover jämfört med DMSO-kontroll. Bestäm också den totala nanog- och dnmt3b-signalen för att säkerställa att kinashämmare inte påverkar nanog: dnmt3b-förhållandet genom att ändra mESC-livskraften. </li><li> Använd rangerade Nanog: Dnmt3b-förhållanden för att identifiera hämmare som främjar naiv pluripoten (Nanog: Dnmt3b-förhållande högre än kontroll) och primed pluripotency (Nanog: Dnmt3b-förhållande lägre än kontroll). Ställ avgränsning vid 2x avvikelse från kontrollvärden och filtrera ut kinashämmare som producerar en total Nanog + Dnmt3b-signal med mindre det50% av DMSO-kontrollvärdet för att generera en högtillitslista över kinashämmare som stabiliserar naivt (högt Nanog: Dnmt3b-förhållande) och grundade (låga Nanog: Dnmt3b-förhållande) pluripotenta tillstånd. </li><li> Validera kinashämmare genom att mäta mESC vid 2 x 10 5 celler per 6 brunn i 2 ml media och tillsätt kinashämmare vid 1 μM i 48 h, utan att byta media. </li><li> Lyse mESC i lysbuffert och analysera Nanog och Dnmt3b-uttryck genom konventionell SDS-PAGE immunoblottning. </li><li> Vidare validera träffar genom SDS-PAGE immunoblotting för naiva pluripotensmarkörer Klf2 och Klf4 och Oct4 för att säkerställa att pluripoten bibehålls efter 48h-hämmarebehandling. </li></ol>

<ol>
	<li>Evans, M. J., Kaufman, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+in+culture+of+pluripotential+cells+from+mouse+embryos.">Establishment in culture of pluripotential cells from mouse embryos.</a> Nature. 292 (5819), 154-156 (1981).</li><li>Nichols, J., Smith, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Naive+and+primed+pluripotent+states.">Naive and primed pluripotent states.</a> Cell Stem Cell. 4 (6), 487-492 (2009).</li><li>Boroviak, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lineage-Specific+Profiling+Delineates+the+Emergence+and+Progression+of+Naive+Pluripotency+in+Mammalian+Embryogenesis.">Lineage-Specific Profiling Delineates the Emergence and Progression of Naive Pluripotency in Mammalian Embryogenesis.</a> Developmental Cell. 35 (3), 366-382 (2015).</li><li>Tesar, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+cell+lines+from+mouse+epiblast+share+defining+features+with+human+embryonic+stem+cells.">New cell lines from mouse epiblast share defining features with human embryonic stem cells.</a> Nature. 448 (7150), 196-199 (2007).</li><li>Brons, I. G. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Derivation+of+pluripotent+epiblast+stem+cells+from+mammalian+embryos.">Derivation of pluripotent epiblast stem cells from mammalian embryos.</a> Nature. 448 (7150), 191-195 (2007).</li><li>Festuccia, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Esrrb+is+a+direct+Nanog+target+gene+that+can+substitute+for+Nanog+function+in+pluripotent+cells.">Esrrb is a direct Nanog target gene that can substitute for Nanog function in pluripotent cells.</a> Cell Stem Cell. 11 (4), 477-490 (2012).</li><li>Ficz, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FGF+signaling+inhibition+in+ESCs+drives+rapid+genome-wide+demethylation+to+the+epigenetic+ground+state+of+pluripotency.">FGF signaling inhibition in ESCs drives rapid genome-wide demethylation to the epigenetic ground state of pluripotency.</a> Cell Stem Cell. 13 (3), 351-359 (2013).</li><li>Guo, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Klf4+reverts+developmentally+programmed+restriction+of+ground+state+pluripotency.">Klf4 reverts developmentally programmed restriction of ground state pluripotency.</a> Development. 136 (7), 1063-1069 (2009).</li><li>Chambers, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanog+safeguards+pluripotency+and+mediates+germline+development.">Nanog safeguards pluripotency and mediates germline development.</a> Nature. 450 (7173), 1230-1234 (2007).</li><li>Findlay, G. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interaction+domains+of+Sos1/Grb2+are+finely+tuned+for+cooperative+control+of+embryonic+stem+cell+fate.">Interaction domains of Sos1/Grb2 are finely tuned for cooperative control of embryonic stem cell fate.</a> Cell. 152 (5), 1008-1020 (2013).</li><li>Niwa, H., Burdon, T., Chambers, I., Smith, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-renewal+of+pluripotent+embryonic+stem+cells+is+mediated+via+activation+of+STAT3.">Self-renewal of pluripotent embryonic stem cells is mediated via activation of STAT3.</a> Genes Dev. 12 (13), 2048-2060 (1998).</li><li>Kunath, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FGF+stimulation+of+the+Erk1/2+signalling+cascade+triggers+transition+of+pluripotent+embryonic+stem+cells+from+self-renewal+to+lineage+commitment.">FGF stimulation of the Erk1/2 signalling cascade triggers transition of pluripotent embryonic stem cells from self-renewal to lineage commitment.</a> Development. 134 (16), 2895-2902 (2007).</li><li>Elkins, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+characterization+of+the+Published+Kinase+Inhibitor+Set.">Comprehensive characterization of the Published Kinase Inhibitor Set.</a> Nature Biotechnology. 34 (1), 95-103 (2016).</li><li>Williams, C. A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Erk5+Is+a+Key+Regulator+of+Naive-Primed+Transition+and+Embryonic+Stem+Cell+Identity.">Erk5 Is a Key Regulator of Naive-Primed Transition and Embryonic Stem Cell Identity.</a> Cell Reports. 16 (7), 1820-1828 (2016).</li><li>Cao, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conversion+of+human+fibroblasts+into+functional+cardiomyocytes+by+small+molecules.">Conversion of human fibroblasts into functional cardiomyocytes by small molecules.</a> Science. 352 (6290), (2016).</li><li>Zhang, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pharmacological+reprogramming+of+fibroblasts+into+neural+stem+cells+by+signaling-directed+transcriptional+activation.">Pharmacological reprogramming of fibroblasts into neural stem cells by signaling-directed transcriptional activation.</a> Cell Stem Cell. 18 (5), 653-667 (2016).</li></ol>

Författarna förklarar inga intressekonflikter som härrör från denna studie.

Här visar vi en allmänt tillgänglig metod för att undersöka rollen för kinasignalvägar vid reglering av naiv-grundad pluripotent övergång. Detta tar upp en nyckelfråga i ESC-fältet. Även om genomströmning genomics och transcriptomics-metoder används rutinmässigt för att identifiera viktiga transkriptionsregulatorer av naiva och primpade pluripotenta tillstånd, har belysande pluripotenssignaleringsnät visat sig vara utmanande. Vi tillhandahåller nu en flexibel strategi som använder kemiska hämmare för att identifiera kinaser som kontrollerar naiv-grundad pluripotent övergång i mESC. Detta bygger på enkel utrustning, reagenser och material som är tillgängliga för de flesta laboratorier som studerar cellsignalering och ESC-biologi. Kritiskt för framgången med denna plattform är vår utveckling av en robust analys för att kvantifiera övergången mellan naiva och primpade pluripotenta stater. Etablering av denna analys krävde signifikanta iterativa modifieringar av cellplattorIng-densitet, inkubationstiden för inkubation och immunoblottningsbetingelser. Småmolekylära tillvägagångssätt erhåller dragkraft för rationell användning i terapeutiska ESC-applikationer 15 , 16 . En stor styrka vid screening av små molekyler är att verktygsföreningarna är konstruerade och / eller modifierade för effektiv cellupptagning. Transfektionseffektivitet är inte begränsande, och användning av farliga leveranssystem som lentivirus är inte nödvändigt. Vidare hämmar inhibitorerna ofta flera isoformer inom en kinasfamilj ( t.ex. Fgfr1-4, Jak1-3), vilken övervinner funktionell redundans som hindrar genetisk / genomisk interferenssteknik, såsom RNAi och CRISPR / Cas9. Eftersom mer potenta och selektiva verktygsföreningar blir tillgängliga från både akademiska och farmaceutiska läkemedelsforskningsprogram, kommer underdrivna och dåligt förstådda kinaser att drivas fram i framkant av ESC-forskning. Vi föreslår därför att detta högtGrov screening-tillvägagångssätt kommer att öppna upp nya vägar för forskning i centrala ESC-regleringsnät. En mindre begränsning av denna teknik är att även de mest potenta och selektiva småmolekylhämmarna engagerar och hämmar flera orelaterade kinaser in vivo . Emellertid möjliggör alltmer omfattande profileringsdata för kinashämmare att funktionella mål för kinashämmare lätt identifieras (http://lincs.hms.harvard.edu/kinomescan; http://www.kinase-screen.mrc.ac.uk/kinase -inhibitors). Slutligen kan vår plattform i princip appliceras för att förhöra vilken som helst liten molekyluppsamling och / eller cellanalys för vilken högkvalitativa immunoblottande antikroppar är tillgängliga. Detta kommer att möjliggöra studier av flera regleringssystem i pluripotensreglering och underlätta identifiering av småmolekylhämmare som modifierar olika cellulära processer. Specifikt avser vi att applicera nya småmolekylsamlingar, såsom epigenenTic sonder som utvecklas av Structural Genomics Consortium (http://www.thesgc.org/chemical-probes/epigenetics) har potential att avslöja ytterligare nya regulatorer av pluripotenta övergångar.

Embryonala stamceller (ESC) har kapacitet att självförnya eller differentiera till vilken celltyp som helst i den vuxna kroppen, ett fenomen som kallas pluripotency 1 . Nya bevis tyder på att utvecklingsstarka pluripotenta tillstånd existerar, termen &quot;naiv&quot; och &quot;primed&quot; pluripotency 2 . Naiva ESC representerar ett utvecklingsläge som liknar det som finns i preimplantationsembryonet 3 . I motsats till detta är primed pluripotenta ESCs redo att lämna pluripoten och differentiera till specialiserade embryonala linjer 4 , 5 . Naiva och primpade pluripotenta stater är markerade med olika genregleringskretsar. Naiv pluripotens karakteriseras av uttryck av viktiga pluripotens transkriptionsfaktorer såsom Nanog, Krueppel-liknande transkriptionsfaktorer (Klfs), Rex1 2 och Esrrb <supClass = &quot;xref&quot;&gt; 6. I mus-ESC (mESC) karakteriseras primerad pluripotens av reducerat uttryck av naiva markörer och en specifik genuttrycks signatur som innefattar de novo DNA-metyltransferas Dnmt3b 7 . In vivo uttrycker primpade pluripotenta postimplanteringsepiblaststamceller (EpiSCs) 4 , 5 dessutom epiblastmarkören Fgf5 och markörer av linjepriming, såsom Brachyury 8 . MESCs ger en dragbar modell för att sondra mekanismer som kontrollerar naiva grundade pluripotenta övergångar in vitro . När de odlas i leukemiinhiberande faktor (LIF) och fetalt bovinserum (FBS) genomgår mESCs dynamisk övergång mellan naiva och primpade pluripotenta tillstånd 9 , 10 . LIF-Jak-Stat3-signaleringsfunktioner för att främja ett naivt genregleringsnätverk 11 </Sup&gt;, medan autokrin signalering via fibroblasttillväxtfaktor 4 (Fgf4) Erk1 / 2-vägen driver övergång till det primära tillståndet 12 . Det är emellertid fortfarande en utmaning att systematiskt utvärdera rollen av proteinkinaser vid specificering av distinkta pluripotenta tillstånd. Här beskriver vi en kvantitativ och skalbar plattform för att utföra riktade små molekylskärmar för kinasregulatorer av den naiva grundade pluripotenta övergången. Vi använder enkla mESC-odlingsförhållanden och standardreagenser, material och utrustning för att upptäcka och validera kinashämmare med hittills oförskriven förmåga att stabilisera naiv pluripotens. Vidare diskuterar vi potentiella utökade applikationer för denna teknik, bland annat för screening av andra små molekylsamlingar, såsom nya hämmarbibliotek som riktar sig mot epigenetiska regulatorer.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="573">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">mESC media</td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">CCE mESCs</td>
			<td style="width:71px;">ATCC</td>
			<td style="width:119px;">ATCC&#160;SCRC-1023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">DMEM Media</td>
			<td style="width:71px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">11965092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">L-Glutamine</td>
			<td style="width:71px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">25030081</td>
			<td>Final: 2mM</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Penicillin/Streptomycin</td>
			<td style="width:71px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">15140122</td>
			<td>Final: 50U/ml</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">2-mercaptoethanol</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">M6250</td>
			<td>Final: 0.1mM</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:216px;">Leukemia Inhibitory Factor (GST fusion)</td>
			<td style="width:71px;">MRC-PPU reagents and services</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Final: 100ng/ml</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Leukemia Inhibitory Factor</td>
			<td style="width:71px;">Thermo</td>
			<td style="width:119px;">PMC9484</td>
			<td>Final: 100ng/ml</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Non-Essential Amino Acids</td>
			<td style="width:71px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">11140050</td>
			<td>Final: 0.1mM</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Sodium Pyruvate</td>
			<td style="width:71px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">11360070</td>
			<td>Final: 1mM</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">KnockOut Serum Replacement</td>
			<td style="width:71px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">10828-028</td>
			<td>Final: 5%</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Defined Fetal Bovine Serum</td>
			<td style="width:71px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">10703464</td>
			<td>Final: 10%</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Name</td>
			<td style="width:71px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">TC materials</td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red</td>
			<td style="width:71px;">Thermo</td>
			<td style="width:119px;">25300054&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Gelatin from porcine skin</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">1890</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Nunc MicroWell 96-Well Microplates</td>
			<td style="width:71px;">Thermo</td>
			<td style="width:119px;">156545</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">DPBS, no calcium, no magnesium</td>
			<td style="width:71px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">14190136</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">V-bottom 96 well plates</td>
			<td style="width:71px;">Greiner Bio-one</td>
			<td style="width:119px;">651261</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Name</td>
			<td style="width:71px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Lysis Buffer</td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Tris buffer</td>
			<td style="width:71px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">103157P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Sodium Chloride</td>
			<td style="width:71px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">97061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">EDTA</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">E4884</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">1% NP-40</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">9016-45-9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Sodium Deoxycholate</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">D6750-100g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">&#946;-glycerophosphate</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">G9422</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Sodium Pyrophosphate</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">13472-36-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Sodium Fluoride</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">450022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Sodium Orthovanadate</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">450243</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Roche Complete Protease Inhibitor Cocktail Tablets</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">CO-RO</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Name</td>
			<td style="width:71px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Chemicals</td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Tween</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">P1379-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Milk Powder</td>
			<td style="width:71px;">Marvel</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Name</td>
			<td style="width:71px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Western Blotting</td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Protran BA 85 Nitrocellulose 0.45uM&#160; Pore size (20 X 20cm Sheets) (25 Sheet)</td>
			<td style="width:71px;">GE</td>
			<td style="width:119px;">10401191</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Ponceau S</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">P7170-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Name</td>
			<td style="width:71px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Laboratory Equipment</td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Minifold I System</td>
			<td style="width:71px;">GE</td>
			<td style="width:119px;">10447850</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">ChemiDoc imager</td>
			<td style="width:71px;">BioRad</td>
			<td style="width:119px;">1708280&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">LiCor Odyssey Imager</td>
			<td style="width:71px;">LiCor</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Name</td>
			<td style="width:71px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Antibodies</td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Anti-mouse Nanog</td>
			<td style="width:71px;">Reprocell</td>
			<td style="width:119px;">RCAB001P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Anti-Dnmt3b</td>
			<td>Imgenex</td>
			<td>IMG-184A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">IRDye 800CW Donkey anti-Rabbit</td>
			<td style="width:71px;">Licor</td>
			<td style="width:119px;">926-32213</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:216px;">Anti-mouse-HRP</td>
			<td style="width:71px;">Cell Signalling Technology</td>
			<td>7076S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Anti-Klf2</td>
			<td style="width:71px;">Millipore</td>
			<td style="width:119px;">09-820</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Anti-Klf4</td>
			<td style="width:71px;">R&#38;D Systems</td>
			<td style="width:119px;">AF3158</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Anti-Oct4</td>
			<td style="width:71px;">Santa Cruz</td>
			<td style="width:119px;">sc-5279</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a simple method to identify kinases that regulate embryonic stem cell pluripotency by high-throughput inhibitor screening

Embryonala stamceller (ESC) kan självförnya eller differentiera i alla celltyper, ett fenomen som kallas pluripotens. Distinkta pluripotenta tillstånd har beskrivits, betecknad &quot;naiv&quot; och &quot;primed&quot; pluripotency. De mekanismer som kontrollerar naiv-grundad övergång är dåligt förstådda. I synnerhet förblir vi dåligt informerade om proteinkinaser som specificerar naiva och primpade pluripotenta tillstånd, trots ökad tillgänglighet av högkvalitativa verktygsföreningar för att söka kinasfunktion. Här beskriver vi en skalbar plattform för att utföra riktade små molekylskärmar för kinasregulatorer av den naiva grundade pluripotenta övergången i mus-ESC. Denna metod utnyttjar enkla cellodlingsförhållanden och standardreagenser, material och utrustning för att avtäcka och validera kinashämmare med hittills oförskattade effekter på pluripotens. Vi diskuterar potentiella tillämpningar för denna teknik, inklusive screening av annan liten molekylSamlingar som alltmer sofistikerade kinashämmare och framväxande bibliotek av epigenetiska verktygsföreningar.

Med hjälp av proceduren som presenteras här ( Figur 1 ), skärmar vi LINCS-biblioteket med 228 potenta och selektiva kinashämmare för att identifiera de som modulerar mESC-pluripotens. Biblioteket framställes i en koncentration av 0,1 mM för en 1: 100 utspädning och slutlig screeningskoncentration av 1 | im i mESC. 48 h senare lyserades mESC och extrakt framställdes för kvantitativ dot-blotanalys av Nanog- och Dnmt3b-uttryck ( Figur 2 , topp). Resultat från andra screeningskoncentrationer är inte representerade här för korthet. Nanog: Dnmt3b-förhållandet bestäms för varje kinashämmare och föreningarna rankas och en 2x-avskärning appliceras ( Figur 2 , botten). Total nanog- och Dnmt3b-signal i förhållande till kontroll överlagras på hämmare ranking och utsätts för en 0,5x cut-off för att möjliggöra triaging av inhibitorer som visar signifikant mESC-toxicitet. Välj kinashämmare som stabiliserar den naiva stabilitetenTe valideras med användning av konventionell Nanog / Dnmt3b immunoblotting ( Figur 3 ). De primära kinasmålen för dessa inhibitorer presenteras i tabell 1 . Vi visar också appliceringen av denna skärm för att identifiera inhibitorer som stabiliserar primed tillståndet 14 . <img alt="Figur 1" src="/files/ftp_upload/55515/55515fig1.jpg" /> Figur 1: Arbetsflöde för screening av kinashämmare som modulerar naiv-primerad övergång. MESC behandlades med ett 228-föreningskinashämmarmaterial vid en slutlig koncentration av 1 | im. Lysater framställdes och överfördes till nitrocellulosemembran för immundot-blot-analys, och nanog- och Dnmt3b-nivåer bestämdes (Figur anpassad från Williams et al. 14 ). <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55515/55515fig1large.jpg" target="_blank">Vänligen klicka här för att se al</a><html> Arger version av denna figur. <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/55515/55515fig2.jpg" /> Figur 2: Naiv-primerad pluripotensskärmanalys och inhibitoridentifikation. (Top) Representativa Nanog- och Dnmt3b-immundot-blot-bilder. (Botten) Nanog- och Dnmt3b-värden för varje kinashämmare bestämdes i förhållande till DMSO-kontrollen och nanog: Dnmt3b-förhållandena och den totala relativa nanog + Dnmt3b-signalen bestämdes och hämmare rankades i jämförelse med DMSO-kontroll. Inhibitorer som visat sig förändra nanog: Dnmt3b-förhållandet utöver en 2-faldig tröskel över eller under DMSO-kontroll identifierades som förare av naiv eller primpad pluripotens. Ett tröskelvärde på 2x under DMSO-kontrollen sattes till triagehämmare som äventyrar mESC-överlevnad. Inhibitorer som valts för ytterligare validering markeras. (Figur anpassad från Williams et al. 14 ).S / ftp_upload / 55515 / 55515fig2large.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur. <img alt="Figur 3" src="/files/ftp_upload/55515/55515fig3.jpg" /> Figur 3: Validering av utvalda träffföreningar identifierade. MESCs behandlades med antingen 1 ^ M AZD4547 (en selektiv FGFR-inhibitor) eller de angivna inhibitorerna identifierade från skärmen i Figur 2. Nanog: Dnmt3b-nivåer bestämda genom standard SDS-PAGE och immunoblotanalys. Numeriska värden av relativ Nanog: Dnmt3b och Nanog + Dnmt3b anges i tabellen nedan och inhibitorer som stabiliserar det naiva pluripotenta tillståndet markerat i grönt. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55515/55515fig3large.jpg" target="_blank">Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.</a> <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> Förening </td><td colspan="2"> Primärt mål </td><td> Andra mål </td></tr><tr><td> AV-951 </td><td colspan="2"> VEGFR </td><td></td></tr><tr><td> HG-6-64-01 </td><td colspan="2"> ABL, BRAF, RET, CSF1R, EGFR, EPHA8, FGFR, FLT3, KIT, LOK, MAP4K1, p38b, MUSK, PDGFR, TAOK3, TNNI3K </td><td></td></tr><tr><td> WH-4-023 </td><td colspan="2"> Lck </td><td> src </td></tr><tr><td> R406 </td><td colspan="2"> Syk </td><td></td></tr><tr><td> GW-572.016 </td><td colspan="2"> HER2 </td><td> EGFR </td></tr><tr><td> KIN001-244 </td><td colspan="2"> PDK1 </td><td></td></tr><tr><td> WZ-4-145 </td><td colspan="2"> CSF1R, DDR1, EGFR, TIE1, PDGFR2 </td><td></td></tr><tr><td> WZ-7043 </td><td colspan="2"> CSF1R, DDR1, FGFR och TAOl </td><td></td></tr><tr><td> GW786034 </td><td colspan="2"> VEGFR1 </td><td> VEGFR2, VEGFR3 &amp;# 160; </td></tr><tr><td> AZD-1480 </td><td colspan="2"> JAK2 </td><td></td></tr></tbody></table> Tabell 1: Utvalda träffföreningar och deras primära kinasmål (er).

Watch this Scientific Journal Video about A Simple Method to Identify Kinases That Regulate Embryonic Stem Cell Pluripotency by High-throughput Inhibitor Screening at JoVE.com

A Simple Method to Identify Kinases That Regulate Embryonic Stem Cell Pluripotency by High-throughput Inhibitor Screening

Här presenterar vi ett kvantitativt och skalbart protokoll för att utföra riktade små molekylskärmar för kinasregulatorer av den naiva grundade pluripotenta övergången.

En enkel metod för att identifiera kinaser som reglerar embryonisk stamcellspluripotens genom genomströmningshämmande screening

Embryonic stem cells (ESCs) can self-renew or differentiate into all cell types, a phenomenon known as pluripotency. Distinct pluripotent states have been ...

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Forward Genetic Approach to Uncover Stress Resistance Genes in Mice &#8212; A High-throughput Screen in ES Cells

Forward Genetic Approach to Uncover Stress Resistance Genes in Mice ÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã¢â‚¬Â A High-throughput Screen in ES Cells

Framåt Genetisk strategi för Avslöja Stress resistensgener i möss - En hög kapacitet skärm i ES-celler

Phenotype-driven genetic screens in mice is a powerful technique to uncover gene functions, but are often hampered by extremely high costs, which severely ...

Generation of Aggregates of Mouse Embryonic Stem Cells that Show Symmetry Breaking, Polarization and Emergent Collective Behaviour In Vitro

Generation of Aggregates of Mouse Embryonic Stem Cells that Show Symmetry Breaking, Polarization and Emergent Collective Behaviour In Vitro

Generation av aggregat av Mouse embryonala stamceller som Visa Symmetry Breaking, Polarisering och Emergent Collective Behaviour<em&gt; In Vitro</em

We have developed a protocol improving current Embryoid Body (EB) culture which allows the study of self-organization, symmetry breaking, axial elongation ...

Generating CRISPR/Cas9 Mediated Monoallelic Deletions to Study Enhancer Function in Mouse Embryonic Stem Cells

Generera crispr / Cas9 medierad monoallel Strykningar att studera Enhancer Funktion i mus embryonala stamceller

Enhancers control cell identity by regulating tissue-specific gene expression in a position and orientation independent manner. These enhancers are often ...

Epigenetic Conversion as a Safe and Simple Method to Obtain Insulin-secreting Cells from Adult Skin Fibroblasts

Epigenetiska Konvertering som en säker och enkel metod för att få insulinfrisättande cellerna från sex hudfibroblaster

Regenerative medicine requires new, fully functional cells that are delivered to patients in order to repair degenerated or damaged tissues. When such ...

Reprogramming Mouse Embryonic Fibroblasts with Transcription Factors to Induce a Hemogenic Program

Omprogrammering Mouse Embryonala fibroblasts med transkriptionsfaktorer att inducera en Hemogenic Program

This protocol details the induction of a hemogenic program in mouse embryonic fibroblasts (MEFs) via overexpression of transcription factors (TFs). We ...

A Versatile Mounting Method for Long Term Imaging of Zebrafish Development

En mångsidig Monteringsmetod för Long Term avbildning av zebrafisk utveckling

Zebrafish embryos offer an ideal experimental system to study complex morphogenetic processes due to their ease of accessibility and optical transparency. ...

Rapid, Directed Differentiation of Retinal Pigment Epithelial Cells from Human Embryonic or Induced Pluripotent Stem Cells

Snabb, regisserad differentiering av Retinal Pigment epitelial celler från mänskliga embryonala eller inducerade pluripotenta stamceller

We describe a robust method to direct the differentiation of pluripotent stem cells into retinal pigment epithelial cells (RPE). The purpose of providing ...

CARIP-Seq and ChIP-Seq: Methods to Identify Chromatin-Associated RNAs and Protein-DNA Interactions in Embryonic Stem Cells

CARIP-Seq och ChIP-Seq: metoder för att identifiera kromatin-associerade RNAs och Protein-DNA interaktioner i embryonala stamceller

Embryonic stem (ES) cell self-renewal&#160;and differentiation is governed by extrinsic signals and intrinsic networks of transcription factors, ...

Organotypic Culture Method to Study the Development Of Embryonic Chicken Tissues

Organotypic kultur metod att studera utvecklingen av embryonala kyckling vävnader

The embryonic chicken is commonly used as a reliable model organism for vertebrate development. Its accessibility and short incubation period makes it ...

A Direct and Simple Method to Assess Drosophila melanogaster's Viability from Embryo to Adult

A Direct and Simple Method to Assess Drosophila melanogaster's Viability from Embryo to Adult

En direkt och enkel metod för att bedöma Drosophila melanogasterlönsamhet från embryo till vuxen

In Drosophila melanogaster, viability assays are used to determine the fitness of certain genetic backgrounds. Allelic variations can result in partial or ...