Name: a simple method to identify kinases that regulate embryonic stem cell pluripotency by high-throughput inhibitor screening
Uploaded: 2017-05-12T12:30:00
Duration: 7 min 18 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Simple Method to Identify Kinases That Regulate Embryonic Stem Cell Pluripotency by High-throughput Inhibitor Screening at JoVE.com

CACW bir Tıbbi Araştırma Konseyi doktora öğrencisi tarafından desteklenmektedir. GMF kısmen Tıbbi Araştırma Konseyi Yeni Araştırmacı Ödülü (MR / N000609 / 1) ve Tenovus İskoçya araştırma ödeneği tarafından desteklenmektedir.

1. Küçük Molekül Kinaz İnhibitör Kütüphanelerinin Harmanlanması <ol><li> Herkes tarafından erişilebilen kinaz inhibitör koleksiyonlarından elde edilen harmanlama inhibitörü kütüphaneleri, örneğin 228 güçlü ve seçici kinaz inhibitörlerinden (http://lincs.hms.harvard.edu) oluşan bir koleksiyon olan Harvard Medical School&#39;tan Entegre Ağa Dayalı Hücresel İmzalar Kütüphanesi (LINCS) Ve endüstriyel araştırmacılar tarafından bir araya getirilen 376 bileşik koleksiyonu olan Protein Kinaz İnhibitör Seti (PKIS) (https://www.ebi.ac.uk/chembldb/extra/PKIS) 13 bulunmaktadır. Alternatif olarak, ticari olarak temin edilebilen bileşiklerden bir ısmarlama kinaz önleyici koleksiyonu monte edin. NOT: Laboratuarımızda, hepsi ticari kaynaklardan temin edilebilen 51 primer hedef kinazı kapsayan 72 güçlü ve seçici takım kinaz inhibitörü topluluğunu bir araya getirdik. </li><li> Birden fazla konsantrasyonda optimum yüksek verimli işleme için kinaz inhibitörlerini 96 oyuklu plakalar halinde bir araya getirin (kullanım 1, 0.1 aNd 0.01 mM). Her bir plakaya sırasıyla saf DMSO içeren referans plakaları ve sırasıyla naif ve primer pluripotent durumu teşvik ettiği bilinen referans kontrol inhibitörleri PD173074 (FGFRi) ve Ruxolitinib&#39;i (JAKi) ekleyin. Elektronik tablo veya benzeri bir yazılımda açıklama yapın. </li></ol> 2. MESC Kültür Hazırlama Şartları ve Prosedürleri <ol><li> 10 cm tabaklara% 0.1 (w / v) jelatin 5 ml ekleyerek% 0.1 jelatin kaplı 10 cm yemekleri hazırlayın ve oda sıcaklığında 5 dakika inkübe edin. Jelatı alın ve 2 dakika boyunca tabağı kurumaya bırakın. </li><li> 100 ng / mL GST-LIF,% 10 Fetal Buzağı Serum ve% 5 Nakavt Serumu içeren standart mESC ortamında (bkz. Malzeme Tablosu )% 0.1 jelatin kaplı 10 cm bulaşıkların 37 ° C&#39;lik% 5 CO 2&#39;de herhangi bir standart mESC hattını kültürleyin Değiştirme. Her geçen gün medyayı değiştirin ve her iki günde bir% 80 konfluenasyondaki MESC&#39;leri 1: 5-1: 10&#39;luk bir seyreltme ile geçirin. </li><li> MESC&#39;leri geçmek için, ortamı aspire edin ve 5 mL o ile yıkayın.F fosfat tamponlu salin (PBS) ile yıkanır. </li><li> MESC plakası başına 1 mL tripsin-EDTA (% 0.05 0.05 tripsin,% 0.02 EDTA) ekleyin ve 10 dakika boyunca 37 ° C&#39;de inkübe edin. </li><li> 4 mL&#39;lik mESC medyumunda tripsinize edilmiş hücreleri tekrar süspansiyon haline getirin ve 5 dakika süreyle 1,200 rpm&#39;de santrifüjleyin. </li><li> Tek bir hücre süspansiyonu üretmek için yukarı ve aşağı pipetleme, 5 mL&#39;lik mESC ortamı içinde hücre topağını iyice süspanse edin. </li><li> 10 mcL hücre süspansiyonu ve 10 mcL Trypan Mavisi (% 0.4) birleştirerek hücreleri sayın. Bir hücre sayma odasına yerleştirin veya bir hemositometre ve ışık mikroskopu kullanın. </li><li> Çok kanallı bir pipet kullanarak% 0.1 jelatin kaplı 96 gözlü plakalara, son hacimde 100 uL medyaya 3 x 10 3 mESC tohumlayın. </li><li> Bir çok kanallı pipet kullanarak kinaz inhibitörlerini 1: 100 seyreltmede (1 uL inhibitör 100 uL medyaya ilave edilir) uygulayın. İnhibitör ve hücre süspansiyonunu karıştırmak için hafifçe pipetle sıkıştırın, daha sonra eşit dağılımı sağlamak için 1 saat boyunca hücrelerin bir doku kültürü kapağına yerleşmesine izin verin.Kaplama yüzeyi. Medyayı değiştirmeden 48 saat boyunca kültür hücreleri. NOT: 1 / 0.1 / 0.01 mM stok plakaları, sırasıyla 10/1 / 0.1 μM son bir inhibitör konsantrasyonu verecektir. Hedef dışı etkileri en aza indirirken birincil hedef kinazların etkin bir şekilde inhibe edilmesini sağlamak için, ekranı 1 μM son konsantrasyonda başlatmanızı öneririz. </li></ol> 3. Kinaz İnhibitör Tarama Analizi <ol><li> Çok kanallı aspiratör ve pipetleri kullanarak 200 mcL PBS&#39;de 96 oyuklu mESC plakalarını yıkayın. </li><li> 150 μL liziz tamponu (20 mM Tris pH 7.4, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA,% 1 NP-40 (v / v),% 0.5 sodyum deoksikolat (w / v), 10 mM β-gliserofosfat , 10 mM sodyum pirofosfat, 1 mM NaF, 2 mM Na3V04, Komple Proteaz İnhibitörü Kokteyl Tabletleri). </li><li> Özleri, V-tabanlı 96 oyuklu plakalarda 30 dakika 1,500 xg&#39;de santrifüjle açıklayın. </li><li> Bir nitrol üzerine 100 μL süpernatantları hareketsiz hale getirinLüloz membran kullanılarak 96 oyuklu vakum nokta leke manifoldu kullanıldı. </li><li> Membranı kurutun ve tutarlı transferi sağlamak için 40 mL Ponceau S ile leke uygulayın. </li><li> Membranı TBST ile yıkayın ve TBST /% 3 (ağırlık / hacim) sütte bloke edin. </li><li> Nanog ve Dnmt3b antikorlarında TBST /% 3 (ağırlık / hacim) süt tozu içinde gece boyunca 1: 1000 (v / v) seyreltme ile inkübe edin. </li><li> Membranları TBST içinde 3 x 10 dakika yıkayın ve TBST /% 3 (ağırlık / hacim) sütte 1: 10,000 (v / v) seyreltilmiş 30 mL ikincil antikor içerisinde inkübe edin. </li><li> Dijital immünobotlama görüntüleme sistemi kullanarak geliştirin. NOT: Mümkünse, Nanog ve Dnmt3b&#39;yi tespit etmek için kantitatif floresans immünoblotlama kullanın. Bununla birlikte, floresans immünoblotlama ile Dnmt3b için arka plan sinyali çok yüksektir. Bu nedenle, 800 nm floresans anti-tavşan (Nanog) ve anti-fare-HRP (Dnmt3b) sekonder antikorlar kullanılır. </li></ol> 4. Ekran Verilerinin Analizi ve Bona Fide Pluripens Regülatörleri Olarak İnhibitörlerin Validasyonu <p class="jove_content"&gt; NOT: Bu sadece iyi niyetli pluripotens modülatörlerinin tanımlanmasını sağlamak için kritik bir adımdır. Hem Nanog: Dnmt3b oranına, hem de genel sinyal temelli inhibitörlerin, mESC sağkalımını olumsuz yönde etkileyen kinaz inhibitörlerinin daha ileri analiz için seçilmemesini sağlamak için ayrılması zorunludur. <ol><li> İmmünoblot analizi yazılımı kullanarak Nanog ve Dnmt3b sinyalini nicelleştirin ve değerleri bir elektronik tabloya veya benzer bir yazılıma aktarın. DMSO kontrolü ile karşılaştırıldığında tüm numuneler için Nanog: Dnmt3b oranını hesaplayın. Ayrıca, kinaz inhibitörlerinin, mESC canlılığını değiştirerek Nanog: Dnmt3b oranını etkilemediğinden emin olmak için toplam Nanog ve Dnmt3b sinyalini belirleyin. </li><li> Saf bulleşikliği (Nanog: Kontrolten daha yüksek olan Dnmt3b oranı) ve başlatılmış pluripotansı (Nanog: Dnmt3b oranı kontrolden düşük) teşvik eden inhibitörleri tanımlamak için sıralı Nanog: Dnmt3b oranlarını kullanın. Kontrol değerlerinden 2x sapma değerinde kesme değerini ayarlayın ve toplam Nanog + Dnmt3b sinyali üreten kinaz inhibitörlerini filtreleyinNaif (yüksek Nanog: Dnmt3b oranı) ve astarlanmış (düşük Nanog: Dnmt3b oranı) pluripotent durumları stabilize eden kinaz inhibitörlerinin yüksek bir güven listesinin üretilmesi için DMSO kontrol değerinin% 50&#39;si. </li><li> 2 mL&#39;lik ortamda 6 kuyucukta 2 x 105 hücreye mESC&#39;leri ekleyerek kinaz inhibitörlerini doğrulayın ve ortam değiştirmeden 48 saat boyunca 1 uM&#39;de kinaz inhibitörleri ekleyin. </li><li> MESC&#39;leri liziz tamponunda Lyse edin ve geleneksel SDS-PAGE imünoblotlama ile Nanog ve Dnmt3b ekspresyonunu analiz edin. </li><li> Çabukluğun, 48 saatlik inhibitör tedavisinin ardından muhafaza edildiğinden emin olmak için, Naif pluripotik belirteçler Klf2 ve Klf4 ve Oct4&#39;ün SDS-PAGE immünoblotlaması ile isabetlerini doğrulayın. </li></ol>

<ol>
	<li>Evans, M. J., Kaufman, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+in+culture+of+pluripotential+cells+from+mouse+embryos.">Establishment in culture of pluripotential cells from mouse embryos.</a> Nature. 292 (5819), 154-156 (1981).</li><li>Nichols, J., Smith, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Naive+and+primed+pluripotent+states.">Naive and primed pluripotent states.</a> Cell Stem Cell. 4 (6), 487-492 (2009).</li><li>Boroviak, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lineage-Specific+Profiling+Delineates+the+Emergence+and+Progression+of+Naive+Pluripotency+in+Mammalian+Embryogenesis.">Lineage-Specific Profiling Delineates the Emergence and Progression of Naive Pluripotency in Mammalian Embryogenesis.</a> Developmental Cell. 35 (3), 366-382 (2015).</li><li>Tesar, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+cell+lines+from+mouse+epiblast+share+defining+features+with+human+embryonic+stem+cells.">New cell lines from mouse epiblast share defining features with human embryonic stem cells.</a> Nature. 448 (7150), 196-199 (2007).</li><li>Brons, I. G. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Derivation+of+pluripotent+epiblast+stem+cells+from+mammalian+embryos.">Derivation of pluripotent epiblast stem cells from mammalian embryos.</a> Nature. 448 (7150), 191-195 (2007).</li><li>Festuccia, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Esrrb+is+a+direct+Nanog+target+gene+that+can+substitute+for+Nanog+function+in+pluripotent+cells.">Esrrb is a direct Nanog target gene that can substitute for Nanog function in pluripotent cells.</a> Cell Stem Cell. 11 (4), 477-490 (2012).</li><li>Ficz, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FGF+signaling+inhibition+in+ESCs+drives+rapid+genome-wide+demethylation+to+the+epigenetic+ground+state+of+pluripotency.">FGF signaling inhibition in ESCs drives rapid genome-wide demethylation to the epigenetic ground state of pluripotency.</a> Cell Stem Cell. 13 (3), 351-359 (2013).</li><li>Guo, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Klf4+reverts+developmentally+programmed+restriction+of+ground+state+pluripotency.">Klf4 reverts developmentally programmed restriction of ground state pluripotency.</a> Development. 136 (7), 1063-1069 (2009).</li><li>Chambers, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanog+safeguards+pluripotency+and+mediates+germline+development.">Nanog safeguards pluripotency and mediates germline development.</a> Nature. 450 (7173), 1230-1234 (2007).</li><li>Findlay, G. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interaction+domains+of+Sos1/Grb2+are+finely+tuned+for+cooperative+control+of+embryonic+stem+cell+fate.">Interaction domains of Sos1/Grb2 are finely tuned for cooperative control of embryonic stem cell fate.</a> Cell. 152 (5), 1008-1020 (2013).</li><li>Niwa, H., Burdon, T., Chambers, I., Smith, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-renewal+of+pluripotent+embryonic+stem+cells+is+mediated+via+activation+of+STAT3.">Self-renewal of pluripotent embryonic stem cells is mediated via activation of STAT3.</a> Genes Dev. 12 (13), 2048-2060 (1998).</li><li>Kunath, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FGF+stimulation+of+the+Erk1/2+signalling+cascade+triggers+transition+of+pluripotent+embryonic+stem+cells+from+self-renewal+to+lineage+commitment.">FGF stimulation of the Erk1/2 signalling cascade triggers transition of pluripotent embryonic stem cells from self-renewal to lineage commitment.</a> Development. 134 (16), 2895-2902 (2007).</li><li>Elkins, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+characterization+of+the+Published+Kinase+Inhibitor+Set.">Comprehensive characterization of the Published Kinase Inhibitor Set.</a> Nature Biotechnology. 34 (1), 95-103 (2016).</li><li>Williams, C. A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Erk5+Is+a+Key+Regulator+of+Naive-Primed+Transition+and+Embryonic+Stem+Cell+Identity.">Erk5 Is a Key Regulator of Naive-Primed Transition and Embryonic Stem Cell Identity.</a> Cell Reports. 16 (7), 1820-1828 (2016).</li><li>Cao, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conversion+of+human+fibroblasts+into+functional+cardiomyocytes+by+small+molecules.">Conversion of human fibroblasts into functional cardiomyocytes by small molecules.</a> Science. 352 (6290), (2016).</li><li>Zhang, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pharmacological+reprogramming+of+fibroblasts+into+neural+stem+cells+by+signaling-directed+transcriptional+activation.">Pharmacological reprogramming of fibroblasts into neural stem cells by signaling-directed transcriptional activation.</a> Cell Stem Cell. 18 (5), 653-667 (2016).</li></ol>

Yazarlar bu çalışmadan doğan herhangi bir çıkar çatışması olmadığını beyan ettiler.

Burada, naif başlangıçlı pluripotent geçişin düzenlenmesinde kinaz sinyal yollarının rolünü araştırmak için yaygın olarak erişilebilen bir metodolojiyi göstermektedir. Bu ESC alanında önemli bir soruyu ele alıyor. Yüksek verimli genomik ve transkriptomik yaklaşımlar, naif ve başlangıçlı pluripotent durumların anahtar transkripsiyonel regülatörlerini tanımlamak için rutin olarak kullanılır, ancak pluripotens sinyal şebekelerini aydınlatmanın zor olduğu kanıtlanmıştır. Şimdi, mESC&#39;lerde naif başlangıçlı pluripotent geçişini kontrol eden kinazları tanımlamak için kimyasal inhibitörleri kullanan esnek bir strateji sunuyoruz. Bu, hücrenin sinyal verme ve ESC biyolojisi üzerine çalışan çoğu laboratuarda bulunan basit ekipman, reaktifler ve malzemeler üzerine kuruludur. Bu platformun başarısı için kritik olan, naif ve başlatılmış pluripotent durumlar arasındaki geçişin nicelleştirilmesi için sağlam bir analiz geliştirmemizdir. Bu tahlilin oluşturulması, hücre platinde önemli iteratif değişiklikler gerektirdiYoğunluk, inhibitör inkubasyon zamanı ve immunoblotlama koşulları. Küçük molekül yaklaşımları, terapötik ESC uygulamalarında rasyonel kullanım için çekiş kazanmaktadır 15 , 16 . Küçük molekül taramalarının önemli bir gücü, araç bileşimlerinin etkin hücre alımı için tasarlanmış ve / veya modifiye edilmiş olmasıdır. Transfeksiyon etkinliği sınırlayıcı değildir ve lentivirüs gibi tehlikeli iletim sistemlerinin kullanılması gerekli değildir. Ayrıca, inhibitörler sıklıkla bir kinaz ailesi ( örn. , Fgfr1-4, Jak1-3) içindeki birden fazla izoformu inhibe eder ve RNAi ve CRISPR / Cas9 gibi genetik / genetik girişim tekniklerini engelleyen fonksiyonel fazlalığın üstesinden gelir. Hem akademik hem de farmasötik ilaç keşfi programlarından daha güçlü ve seçici araç bileşikleri elde edildiğinde, az öğrenilen ve iyi anlaşılmayan kinazlar ESC araştırmasının ön planına itilecektir. Bu nedenle, bu yüksekKaba yeme tarama yaklaşımı, temel ESC düzenleyici ağlarına yeni araştırma yolları açacaktır. Bu teknolojinin küçük bir kısıtlaması, en güçlü ve seçici küçük molekül inhibitörleri bile in vivo çoklu ilgisiz kinazlarla etkileşime girip engellemektir. Bununla birlikte, gittikçe genişleyen kinaz inhibitörü profil verisi, kinaz inhibitörlerinin işlevsel hedeflerinin kolayca tanımlanmasına izin verir (http://lincs.hms.harvard.edu/kinomescan; http://www.kinase-screen.mrc.ac.uk/kinase -inhibitors). Son olarak, prensip olarak, platformumuz, yüksek kaliteli immünoblot antikorlarının bulunduğu herhangi bir küçük molekül toplama ve / veya hücresel tahlilin sorgulanması için uygulanabilir. Bu, pluripotens regülasyonunda çoklu düzenleyici sistemlerin incelenmesine ve çeşitli hücresel prosesleri değiştiren küçük molekül inhibitörlerinin tanımlanmasını kolaylaştıracaktır. Özellikle, epijen gibi ortaya çıkan küçük molekül koleksiyonlarınınYapısal Genomik Konsorsiyumu (http://www.thesgc.org/chemical-probes/epigenetics) tarafından geliştirilen tik problar, pluripotent geçişlerin daha yeni regülatörlerini ortaya çıkarma potansiyeline sahiptir.

Embriyonik kök hücreler (ESC&#39;ler), pluripotens 1 olarak bilinen bir fenomen olan yetişkin vücuttaki herhangi bir hücre türüne kendi kendine yenilenme veya ayırma kapasitesine sahiptir. Yeni kanıtlar, &quot;naif&quot; ve &quot;astarlanmış&quot; pluripotency olarak adlandırılan, gelişimsel olarak farklı pluripotent durumların var olduğunu ortaya koymaktadır. Naif ESCler, preimplantasyon embriyo 3&#39;dekine benzer bir gelişim halini temsil eder. Buna karşın, başlatılmış pluripotent ESC&#39;ler pluripotency&#39;den çıkmak ve özelleştirilmiş embriyonik soylara ayırmak için hazırlanırlar 4 , 5 . Naive ve primer pluripotent devletler ayrı gen düzenleyici ağlarla işaretlenir. Naif pluripotik, Nanog, Krueppel benzeri transkripsiyon faktörleri (Klfs), Rex1 2 ve Esrrb gibi anahtar pluripotens transkripsiyon faktörlerinin ekspresyonuyla karakterizedir <supClass = &quot;xref&quot;&gt; 6. Fare ESC&#39;lerde (mESC&#39;ler), başlangıçtaki pluripotens, naif belirteçlerin azaltılmış ifadesi ve de novo DNA metil transferaz Dnmt3b&#39;yi içeren spesifik bir gen ekspresyon imza ile karakterize edilir 7 . In vivo , primer pluripotent implant sonrası epiblast kök hücreleri (EpiSCs) 4 , 5 ek olarak Epiblast markörü Fgf5&#39;i ve Brachyury 8 gibi soy primingin belirteçlerini ifade eder. MESC&#39;ler , in vitro saf ön provizyonlu pluripotent geçişleri kontrol eden prob mekanizmalarına uygulanabilir bir model sağlar. Lösemi inhibitör faktör (LIF) ve fetal sığır serumu (FBS) ile kültürlendiğinde, mESC&#39;ler saf ve başlangıçlı pluripotent durumlar arasında dinamik geçiş yapar 9 , 10 . Naif bir gen düzenleyici ağı teşvik etmek için LIF-Jak-Stat3 sinyalizasyon işlevleri 11 </Fibroblast büyüme faktörü 4 (Fgf4) Erk1 / 2 yolak yoluyla otokrin sinyalizasyon, astar hal 12&#39;ye geçişi sağlar. Bununla birlikte, protein kinazların farklı pluripotent durumların belirlenmesindeki rolünü sistematik olarak değerlendirmek de bir meydan okuma olmaya devam etmektedir. Burada, saf ön hazırlıklı pluripotent geçiş kinaz regülatörleri için hedeflenmiş küçük moleküler elekleri gerçekleştirmek için nicel ve ölçeklenebilir bir platform açıklanmaktadır. Basit parazit mukavemeti stabilize etme yeteneği ile kinaz inhibitörlerini ortaya çıkarmak ve doğrulamak için basit mESC kültür koşullarını ve standart reaktifleri, malzemeleri ve ekipmanları kullanırız. Ayrıca, epigenetik düzenleyicileri hedef alan gelişmekte olan inhibitör kütüphaneleri gibi diğer küçük molekül koleksiyonlarının taranması da dahil olmak üzere, bu teknoloji için potansiyel genişletilmiş uygulamaları tartışıyoruz.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="573">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">mESC media</td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">CCE mESCs</td>
			<td style="width:71px;">ATCC</td>
			<td style="width:119px;">ATCC&#160;SCRC-1023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">DMEM Media</td>
			<td style="width:71px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">11965092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">L-Glutamine</td>
			<td style="width:71px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">25030081</td>
			<td>Final: 2mM</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Penicillin/Streptomycin</td>
			<td style="width:71px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">15140122</td>
			<td>Final: 50U/ml</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">2-mercaptoethanol</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">M6250</td>
			<td>Final: 0.1mM</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:216px;">Leukemia Inhibitory Factor (GST fusion)</td>
			<td style="width:71px;">MRC-PPU reagents and services</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Final: 100ng/ml</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Leukemia Inhibitory Factor</td>
			<td style="width:71px;">Thermo</td>
			<td style="width:119px;">PMC9484</td>
			<td>Final: 100ng/ml</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Non-Essential Amino Acids</td>
			<td style="width:71px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">11140050</td>
			<td>Final: 0.1mM</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Sodium Pyruvate</td>
			<td style="width:71px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">11360070</td>
			<td>Final: 1mM</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">KnockOut Serum Replacement</td>
			<td style="width:71px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">10828-028</td>
			<td>Final: 5%</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Defined Fetal Bovine Serum</td>
			<td style="width:71px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">10703464</td>
			<td>Final: 10%</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Name</td>
			<td style="width:71px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">TC materials</td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red</td>
			<td style="width:71px;">Thermo</td>
			<td style="width:119px;">25300054&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Gelatin from porcine skin</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">1890</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Nunc MicroWell 96-Well Microplates</td>
			<td style="width:71px;">Thermo</td>
			<td style="width:119px;">156545</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">DPBS, no calcium, no magnesium</td>
			<td style="width:71px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">14190136</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">V-bottom 96 well plates</td>
			<td style="width:71px;">Greiner Bio-one</td>
			<td style="width:119px;">651261</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Name</td>
			<td style="width:71px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Lysis Buffer</td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Tris buffer</td>
			<td style="width:71px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">103157P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Sodium Chloride</td>
			<td style="width:71px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">97061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">EDTA</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">E4884</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">1% NP-40</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">9016-45-9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Sodium Deoxycholate</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">D6750-100g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">&#946;-glycerophosphate</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">G9422</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Sodium Pyrophosphate</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">13472-36-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Sodium Fluoride</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">450022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Sodium Orthovanadate</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">450243</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Roche Complete Protease Inhibitor Cocktail Tablets</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">CO-RO</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Name</td>
			<td style="width:71px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Chemicals</td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Tween</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">P1379-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Milk Powder</td>
			<td style="width:71px;">Marvel</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Name</td>
			<td style="width:71px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Western Blotting</td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Protran BA 85 Nitrocellulose 0.45uM&#160; Pore size (20 X 20cm Sheets) (25 Sheet)</td>
			<td style="width:71px;">GE</td>
			<td style="width:119px;">10401191</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Ponceau S</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">P7170-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Name</td>
			<td style="width:71px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Laboratory Equipment</td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Minifold I System</td>
			<td style="width:71px;">GE</td>
			<td style="width:119px;">10447850</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">ChemiDoc imager</td>
			<td style="width:71px;">BioRad</td>
			<td style="width:119px;">1708280&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">LiCor Odyssey Imager</td>
			<td style="width:71px;">LiCor</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Name</td>
			<td style="width:71px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Antibodies</td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Anti-mouse Nanog</td>
			<td style="width:71px;">Reprocell</td>
			<td style="width:119px;">RCAB001P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Anti-Dnmt3b</td>
			<td>Imgenex</td>
			<td>IMG-184A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">IRDye 800CW Donkey anti-Rabbit</td>
			<td style="width:71px;">Licor</td>
			<td style="width:119px;">926-32213</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:216px;">Anti-mouse-HRP</td>
			<td style="width:71px;">Cell Signalling Technology</td>
			<td>7076S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Anti-Klf2</td>
			<td style="width:71px;">Millipore</td>
			<td style="width:119px;">09-820</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Anti-Klf4</td>
			<td style="width:71px;">R&#38;D Systems</td>
			<td style="width:119px;">AF3158</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Anti-Oct4</td>
			<td style="width:71px;">Santa Cruz</td>
			<td style="width:119px;">sc-5279</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a simple method to identify kinases that regulate embryonic stem cell pluripotency by high-throughput inhibitor screening

Embriyonik kök hücreler (ESC&#39;ler), kendi kendini yenileyebilir veya pluripotency olarak bilinen bir fenomen olan tüm hücre tiplerine farklılaşabilir. Belirgin pluripotent durumlar &quot;naif&quot; ve &quot;astarlanmış&quot; pluripotency olarak adlandırılmıştır. Saf önlemli geçişi kontrol altına alan mekanizmalar tam olarak anlaşılamamıştır. Özellikle, kinetik fonksiyonu araştırmak için yüksek kaliteli alet bileşiklerinin mevcudiyetinin artmasına rağmen, naif ve başlangıçlı pluripotent durumları belirten protein kinazlar hakkında kötü bilgi sahibiyiz. Burada, fare ESC&#39;lerindeki naif başlatılmış pluripotent geçişin kinaz düzenleyicileri için hedeflenmiş küçük moleküler ekranlar gerçekleştirmek için ölçeklenebilir bir platform açıklanmaktadır. Bu yaklaşım, basit hücre kültürü koşullarını ve standart reaktifleri, materyalleri ve ekipmanı kullanarak, pluripotens üzerine şimdiye dek değinilmemiş etkileri olan kinaz inhibitörlerini açığa çıkarır ve onaylar. Bu teknolojinin potansiyel uygulamalarını tartışıyoruz, diğer küçük moleküllerin taranması da dahilGiderek sofistike kinaz inhibitörleri ve ortaya çıkan epigenetik araç bileşiklerinin kütüphaneleri gibi koleksiyonlar.

Burada sunulan prosedürü kullanarak ( Şekil 1 ), 228 güçlü ve seçici kinaz inhibitörünün LINCS kütüphanesini tarayarak mESC pluripotensini modüle edenleri belirledik. Kütüphane, 1: 100 seyreltme için 0.1 mM konsantrasyonda ve mESC&#39;lerde 1 uM son tarama konsantrasyonunda hazırlanır. 48 saat sonra, mESC&#39;ler parçalandı ve Nanog ve Dnmt3b ifadesinin kantitatif nokta leke analizi için ekstraktlar hazırlandı ( Şekil 2 , üstte). Diğer tarama konsantrasyonlarından elde edilen sonuçlar burada kısalık olarak gösterilmez. Nanog: Dnmt3b oranı her kinaz inhibitörü ve bileşenler için sıralanır ve 2x kesme uygulanır ( Şekil 2 , alt). Kontrolle ilgili toplam Nanog ve Dnmt3b sinyali, inhibitör sıralamasına bindirilir ve önemli mESC toksisitesini gösteren inhibitörlerin triazasyonuna izin vermek için 0.5x kesime tabi tutulur. Safevatı stabilize eden kinaz inhibitörlerini seçinGeleneksel Nanog / Dnmt3b immünoblotlama ( Şekil 3 ) kullanılarak doğrulanır. Bu inhibitörlerin primer kinaz hedefleri Tablo 1&#39;de sunulmuştur. Bu ekranın, astarlanmış hali stabilize eden inhibitörleri tanımlamak için uygulanabilirliğini de göstermekteyiz 14 . <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/55515/55515fig1.jpg" /> Şekil 1: Saf başlangıçlı geçiş modüle eden kinaz inhibitörlerinin taranması için iş akışı. MESC, 1 uM&#39;lik nihai konsantrasyonda bir 228 bileşik kinaz inhibitör kütüphanesi ile muamele edildi. Lizatlar hazırlandı ve immüno nokta-leke analizi için nitroselüloz membranlara aktarıldı ve Nanog ve Dnmt3b seviyeleri belirlendi (Şekil 14 , Williams ve diğerleri 14&#39;den adapte edildi). <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55515/55515fig1large.jpg" target="_blank">Görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a><html> Bu rakamın daha yükseği yok. <img alt="şekil 2" src="/files/ftp_upload/55515/55515fig2.jpg" /> Şekil 2: Naive ile hazırlanmış pluripotens ekran analizi ve inhibitör tanımlama. (Üstteki) Temsilci Nanog ve Dnmt3b immüno nokta-lekeli görüntüler. (Alt) Her kinaz inhibitörü için Nanog ve Dnm3b değerleri DMSO kontrolüne göre belirlendi ve Nanog: Dnmt3b oranları ve toplam nispi Nanog + Dnmt3b sinyali belirlendi ve inhibitörler DMSO kontrolüne kıyasla sıralandı. Nanog: Dnmt3b oranını, DMSO kontrolünün üstünde veya altındaki 2 misli eşiğin ötesinde değiştirenlerin, naif veya başlatılmış pluripotensin sürücüleri olduğu tespit edildi. DMSO kontrolünün 2x altında bir eşik değeri, mESC sağkalımını tehdit eden inhibitörlerin triaj edilmesi için ayarlandı. Daha ileri doğrulama için seçilen inhibitörler vurgulanır. (Şekil, Williams ve diğerleri 14&#39;den uyarlanmıştır ).S / ftp_upload / 55515 / 55515fig2large.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; Bu rakamın daha büyük sürümünü görmek için lütfen tıklayınız. <img alt="Şekil 3" src="/files/ftp_upload/55515/55515fig3.jpg" /> Şekil 3: Belirlenen seçilmiş isabet bileşiklerinin doğrulanması. MESC&#39;ler ya 1 uM AZD4547 (seçici bir FGFR önleyicisi) ya da Şekil 2&#39;deki ekrandan belirlenen belirtilen inhibitörler ile muamele edildi. Nanog: Dnmt3b seviyeleri standart SDS-PAGE ve immünoblot analizi ile belirlendi. Göreceli Nanog: Dnmt3b ve Nanog + Dnmt3b&#39;nin sayısal değerleri aşağıdaki tabloda gösterilmiştir ve naif pluripotent durumu stabilize eden inhibitörler yeşil renkte vurgulanmıştır. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55515/55515fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.</a> <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> bileşik </td><td colspan="2"> Birincil Hedefler </td><td> Diğer Hedefler </td></tr><tr><td> AV-951 </td><td colspan="2"> VEGFR </td><td></td></tr><tr><td> HG-6-64-01 </td><td colspan="2"> ABL, BRAF, RET, CSF1R, EGFR, EPHA8, FGFR, FLT3, KIT, LOK, MAP4K1, p38b, MUSK, PDGFR, TAOK3, TNNI3K </td><td></td></tr><tr><td> WH-4-023 </td><td colspan="2"> Lck </td><td> src </td></tr><tr><td> R406 </td><td colspan="2"> Syk </td><td></td></tr><tr><td> GW-572016 </td><td colspan="2"> HER2 </td><td> EGFR </td></tr><tr><td> KIN001-244 </td><td colspan="2"> PDK1 </td><td></td></tr><tr><td> WZ-4-145 </td><td colspan="2"> CSF1R, DDR1, EGFR, TIE1, PDGFR2 </td><td></td></tr><tr><td> WZ-7043 </td><td colspan="2"> CSF1R, DDR1, FGFR ve TAO1 </td><td></td></tr><tr><td> GW786034 </td><td colspan="2"> VEGFR1&#39;inin </td><td> VEGFR2, VEGFR3 &amp;# 160; </td></tr><tr><td> AZD-1480 </td><td colspan="2"> JAK2&#39;dir </td><td></td></tr></tbody></table> Tablo 1: Seçilen isabet bileşikleri ve bunların primer kinaz hedefleri.

Watch this Scientific Journal Video about A Simple Method to Identify Kinases That Regulate Embryonic Stem Cell Pluripotency by High-throughput Inhibitor Screening at JoVE.com

A Simple Method to Identify Kinases That Regulate Embryonic Stem Cell Pluripotency by High-throughput Inhibitor Screening

Burada, saf ön hazırlıklı pluripotent geçiş kinaz regülatörleri için hedeflenmiş küçük molekül ekranları gerçekleştirmek için nicel ve ölçeklenebilir bir protokol sunuyoruz.

Embriyonik Kök Hücre Pluripotansını Yüksek Verimli İnhibitör Taramayla Düzenleyen Kinazları Tanımlamak İçin Basit Bir Yöntem

Embryonic stem cells (ESCs) can self-renew or differentiate into all cell types, a phenomenon known as pluripotency. Distinct pluripotent states have been ...

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Forward Genetic Approach to Uncover Stress Resistance Genes in Mice &#8212; A High-throughput Screen in ES Cells

Forward Genetic Approach to Uncover Stress Resistance Genes in Mice ÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã¢â‚¬Â A High-throughput Screen in ES Cells

İleri Genetik Yaklaşım Farelerde Stres Direnci Genler ortaya çıkarmak için - ES Hücrelerde bir Yüksek verim Ekranı

Phenotype-driven genetic screens in mice is a powerful technique to uncover gene functions, but are often hampered by extremely high costs, which severely ...

Generation of Aggregates of Mouse Embryonic Stem Cells that Show Symmetry Breaking, Polarization and Emergent Collective Behaviour In Vitro

Generation of Aggregates of Mouse Embryonic Stem Cells that Show Symmetry Breaking, Polarization and Emergent Collective Behaviour In Vitro

Fare Embriyonik Kök Hücre Agregaların Üretimi Simetri Kırma, Polarizasyon ve Acil Toplu Davranış göster o<em&gt; İn Vitro</em

We have developed a protocol improving current Embryoid Body (EB) culture which allows the study of self-organization, symmetry breaking, axial elongation ...

Generating CRISPR/Cas9 Mediated Monoallelic Deletions to Study Enhancer Function in Mouse Embryonic Stem Cells

Yaratma CRISPR / Cas9 aracılığı monoallelik Delesyonlar Fare Embriyonik Kök Hücreleri Artırıcı Fonksiyonu Eğitim için

Enhancers control cell identity by regulating tissue-specific gene expression in a position and orientation independent manner. These enhancers are often ...

Epigenetic Conversion as a Safe and Simple Method to Obtain Insulin-secreting Cells from Adult Skin Fibroblasts

Yetişkin Cilt Fibroblastları gelen İnsülin salgılayan hücreler elde edilir Güvenli ve Basit Yöntem olarak epigenetik Dönüşüm

Regenerative medicine requires new, fully functional cells that are delivered to patients in order to repair degenerated or damaged tissues. When such ...

Reprogramming Mouse Embryonic Fibroblasts with Transcription Factors to Induce a Hemogenic Program

Transkripsiyon Faktörleri ile fare embriyonik fibroblastlar yeniden programlama bir Hemogenic Programı tetikleyebilecek

This protocol details the induction of a hemogenic program in mouse embryonic fibroblasts (MEFs) via overexpression of transcription factors (TFs). We ...

A Versatile Mounting Method for Long Term Imaging of Zebrafish Development

Zebra balığı Kalkınma Uzun Süreli Görüntüleme için A yönlü Montaj Yöntemi

Zebrafish embryos offer an ideal experimental system to study complex morphogenetic processes due to their ease of accessibility and optical transparency. ...

Rapid, Directed Differentiation of Retinal Pigment Epithelial Cells from Human Embryonic or Induced Pluripotent Stem Cells

Hızlı, yönlendirilmiş farklılaşma insan embriyonik veya İndüklenmiş Pluripotent kök hücrelerinden retina Pigment epitel hücrelerinin

We describe a robust method to direct the differentiation of pluripotent stem cells into retinal pigment epithelial cells (RPE). The purpose of providing ...

CARIP-Seq and ChIP-Seq: Methods to Identify Chromatin-Associated RNAs and Protein-DNA Interactions in Embryonic Stem Cells

CARIP-Seq ve ChIP-Seq: kromatin ilişkili RNA ve Protein-DNA etkileşimleri embriyonik kök hücreleri tanımlamak için yöntemleri

Embryonic stem (ES) cell self-renewal&#160;and differentiation is governed by extrinsic signals and intrinsic networks of transcription factors, ...

Organotypic Culture Method to Study the Development Of Embryonic Chicken Tissues

Embriyonik tavuk doku gelişimi çalışmaya Organotypic kültür yöntemi

The embryonic chicken is commonly used as a reliable model organism for vertebrate development. Its accessibility and short incubation period makes it ...

A Direct and Simple Method to Assess Drosophila melanogaster's Viability from Embryo to Adult

A Direct and Simple Method to Assess Drosophila melanogaster's Viability from Embryo to Adult

Drosophila Melanogaster'In Embriyodan Yetişkine Canlılığını Değerlendirmek Için Doğrudan ve Basit Bir Yöntem

In Drosophila melanogaster, viability assays are used to determine the fitness of certain genetic backgrounds. Allelic variations can result in partial or ...