Name: turbidimetry on human washed platelets: the effect of the pannexin1-inhibitor brilliant blue fcf on collagen-induced aggregation
Uploaded: 2017-04-06T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Turbidimetry on Human Washed Platelets: The Effect of the Pannexin1-inhibitor Brilliant Blue FCF on Collagen-induced Aggregation at JoVE.com

Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni dal Fondo nazionale svizzero (310030_162579 / 1 a Brenda Renata Kwak e 320030_144150 Pierre Fontana), così come da una sovvenzione della Fondazione svizzera Cuore.

Cinque volontari sani non imparentati sono stati reclutati per il prelievo di sangue per le prove di isolamento e l&#39;aggregazione piastrinica. consenso informato scritto è stato ottenuto e il protocollo è stato approvato dal Comitato Etico Centrale delle ospedali universitari ginevrini. Tutti i volontari certificati per essere sani e di non hanno preso tutte le droghe piastrine-interferire durante almeno i 10 giorni precedenti esperimenti. 1. Buffer Preparazione per la Raccolta Sangue uma...

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	<li>Patel, S. R., Hartwig, J. H., Italiano, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+biogenesis+of+platelets+from+megakaryocyte+proplatelets.">The biogenesis of platelets from megakaryocyte proplatelets.</a> J Clin Invest. 115 (12), 3348-3354 (2005).</li><li>Andrews, R. K., Berndt, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Platelet+physiology+and+thrombosis.">Platelet physiology and thrombosis.</a> Thromb Res. 114 (5-6), 447-453 (2004).</li><li>Go, A. 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D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Connexin+hemichannel+and+pannexin+channel+electrophysiology:+how+do+they+differ?.">Connexin hemichannel and pannexin channel electrophysiology: how do they differ?.</a> FEBS Lett. 588 (8), 1372-1378 (2014).</li><li>European Food Safety Authority. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scientific+Opinion+on+the+re-evaluation+of+Brilliant+Blue+FCF+(E+133)+as+a+food+additive.">Scientific Opinion on the re-evaluation of Brilliant Blue FCF (E 133) as a food additive.</a> EFSA Journal. 8 (11), 1853-1889 (2010).</li><li>Lages, B., Scrutton, M. 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C&#39;è un grande interesse nella ricerca di nuovi farmaci in grado di modulare la funzione delle piastrine al fine di prevenire la trombosi senza aumentare il rischio di sanguinamento. A tale scopo, in vitro test di laboratorio che possono monitorare affidabile e riproducibile risposte di aggregazione di piastrine umane sono assolutamente necessarie. aggregometria turbidimetrico è una tecnica facile da eseguire. Tuttavia, alcune precauzioni devono essere tenuti in considerazione. Le misurazioni devono essere...

Le piastrine sono componenti cruciali del sangue e la loro funzione, insieme a fattori di coagulazione-è quello di fermare l&#39;emorragia dopo la lesione dei vasi sanguigni. Le piastrine sono piccoli frammenti (2-3 micron) anuclear derivate da megacariociti del midollo osseo 1. Piastrine circolano in stato non attivato, durante i quali appaiono come strutture lenticolari. Su interruzione della endotelio, piastrine si riuniscono per il sito di lesione dei vasi sanguigni per tappare il buco, un processo chiamato emostasi primaria. Inizialmente, piastrine attaccano alle molecole sub-endoteliale, quali il collagene e fattore di von Willebrand, che sono esposti a seguito della fase di lesione aderenza 2. Poi, cambiano forma e secernono passo messaggeri-attivazione chimica. Infine, si collegano tra loro da colmare passo recettori-aggregazione. dell&#39;emostasi primaria è seguita da un processo secondario che coinvolge l&#39;attivazione della cascata coagulativa con deposizione di fibrina, che stabilizzanos trombo iniziale 2. Eventi ischemici acuti quali infarto miocardico 3 spesso il risultato di trombi che si formano a causa di interruzione fisica (rottura) di una placca aterosclerotica. farmaci anti-piastrinici attuali sono la pietra angolare del trattamento di questa malattia molto diffusa, ma il loro beneficio clinico è limitato da un aumentato rischio di sanguinamento. I farmaci più prescritti in pazienti cardiovascolare, composti aspirina e anti-P2Y12, indirizzare il trombossano A2 e le vie ADP 4, rispettivamente, che sono le principali vie che portano all&#39;attivazione piastrinica. Tuttavia, la ricerca innovativa verso nuovi obiettivi che in modo ottimale bilanciare gli effetti antitrombotici e il rischio emorragico è ancora necessario. Dal 1960 ad oggi 5, aggregometria turbidimetrico ha svolto un ruolo cruciale nella ricerca, migliorare la nostra conoscenza della reattività piastrinica ed ion per il monitoraggio della potenza di reagenti anti-trombotici nell&#39;uomo. Turbidimetria stata inizialmente applicata a PRP estratto da campioni di sangue. Infatti, la raccolta del sangue eseguita in provette contenenti citrato permette una produzione rapida e grande di PRP senza avere alcun effetto sulla integrità e la funzionalità piastrinica. Tuttavia, la stabilità a breve termine (circa 3 h) PRP e le restanti enzimi plasmatici, quali trombina, e la bassa concentrazione di calcio associato con un profilo di aggregazione potenzialmente artefattuali sono di gravi inconvenienti per l&#39;uso di PRP. Un importante passo avanti è stato lo sviluppo di un metodo per l&#39;isolamento delle piastrine con centrifugazione e lavaggio passi 6 supplementare. In breve, PRP è isolato dal sangue intero raccolto in acido citrato destrosio (ACD) e le piastrine sono isolati dopo le fasi di centrifugazione seriale prima di essere risospese in un tampone iso-osmotica fosfato (tampone di Tyrode) contenente glucosio, albumina di siero umano e bivalente cni (Ca 2+ e Mg 2+). Per evitare variazioni di reattività piastrinica, il pH del tampone di Tyrode è attentamente mantenuta a 7,35-7,4. Inoltre, l&#39;attivazione indesiderata di piastrine è impedito aggiungendo prostaciclina (PGI 2) prima di alcune fasi di centrifugazione. Infine, l&#39;aggiunta di apyrase impedisce piastrine lavate di diventare resistente contro l&#39;azione di ATP / ADP. La sospensione di piastrine risultante manca di fattori coagulanti e la stabilità delle piastrine è aumentata di almeno due volte rispetto alle soluzioni PRP. Inoltre, il fatto che le piastrine sono mandati inattive ma intatti riproducibilità delle misurazioni turbidimetriche e fornisce la possibilità di studiare l&#39;azione di agonisti o antagonisti di aggregazione piastrinica in modo ottimale. Usando questo metodo, abbiamo dimostrato in un recente studio che inibendo la formazione di canali Panx1 da un approccio genetico (knock-out topi) o diminuendo canale attività Panx1 da farmacologicaapprocci ridotta aggregazione piastrinica indotta da collagene 7. Panx1 forma canali ATP-rilascio, che sono ubiquitariamente espressi in molti tipi di cellule inclusi piastrine umane 7, 8. Infatti, abbiamo dimostrato mediante turbidimetria su umano lavato piastrine che un 7 min preincubazione con un pannello di bloccanti più o meno specifici chimici (probenecid, meflochina e 10 peptidi Panx1) prima della aggiunta di vari agonisti, inibito specificamente collagene-indotta aggregazione piastrinica mentre le risposte alle piastrine AA e ADP non sono stati influenzati. Abbiamo dimostrato che l&#39;ATP rilascio attraverso canali Panx1 interferisce in modo specifico nella via di segnalazione che porta alla GPVI aggregazione indotta da collagene. È interessante notare che, più composti FDA ha approvato con applicazioni in altre malattie (probenecid, meflochina) influenzano l&#39;attività dei canali Panx1 in piastrine. Da un lato, questo apre nuove prospettive terapeutiche per selezionaretivamente modificare reattività piastrinica. D&#39;altra parte, si dovrebbe prendere in considerazione i potenziali effetti secondari di questi composti. In questo contesto, il colorante alimentare sicuro Blu Brillante FCF utilizzato in più caramelle e bevande energetiche è stato descritto come un inibitore selettivo di Panx1 9. Descriviamo qui un protocollo per l&#39;isolamento di piastrine lavate umani e misurazioni turbidimetrici dell&#39;aggregazione piastrinica adattato per investigare l&#39;effetto del colorante blu brillante FCF come antagonista di aggregazione piastrinica.

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	<tbody>
		<tr>
			<td>citric acid monohydrate (C6H8O7*H2O)</td>
			<td>Roth</td>
			<td>5949-29-1</td>
			<td>danger of eye damage/irritation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>trisodium citrate dihydrate (Na3C6H5O7*2H2O)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S1804</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D(+)-glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G8270</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride (NaCl)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S9888</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride (KCl)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P9541</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium bicarbonate (NaHCO3)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S6014</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dihydrogenophosphate monohydrate (NaH2PO4*H2O)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S9638</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride hexahydrate (MgCl2*6H2O)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M9272</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride hexahydrate (CaCl2*6H2O)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>442909</td>
			<td>danger of eye damage/irritation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-2-hydroxyethylpiperazine-N-2-ethane sulfonic acid (Hepes)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific&#160;</td>
			<td>15630</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>human serum albumin</td>
			<td>CSL Behring</td>
			<td>00257/374</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hydrochloric acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>320331</td>
			<td>Corrosive and irritative for the respiratory system. Can cause severe skin and eye damages.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf 5810 R</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>heparin</td>
			<td>Drosspharm AG/SA</td>
			<td>20810</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>prostacyclin I2 (PGI2)</td>
			<td>Cayman</td>
			<td>18220</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>apyrase from potatoes</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A6535</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>fibrinogen (Haemocomplettan)</td>
			<td>CSL Behring</td>
			<td>HS 73466011</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>thrombo-aggragometer SD-Medical</td>
			<td>SD-Innovation</td>
			<td>TA8V</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brilliant blue FCF (Erioglaucine disodium salt)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>80717</td>
			<td>Harmful to aquatic life with long lasting effects (Avoid release to the environnement)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>collagen</td>
			<td>Horm, Nycomed</td>
			<td></td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>arachidonic acid</td>
			<td>Bio/Data corporation</td>
			<td>C/N 101297</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cell counter Sysmex KX-21N</td>
			<td>Sysmex Digitana&#160;</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15630-056</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glass cuvettes</td>
			<td>SD-Innovation</td>
			<td>THCV1000</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>magnetic stirrers</td>
			<td>SD-Innovation</td>
			<td>THA100</td>
			<td>-</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

turbidimetry on human washed platelets: the effect of the pannexin1-inhibitor brilliant blue fcf on collagen-induced aggregation

Turbidimetria è una tecnica di laboratorio che viene applicata per misurare l&#39;aggregazione delle piastrine sospese in entrambi plasma (plasma ricco di piastrine, PRP) o in tampone (piastrine lavate), mediante l&#39;uso di uno o una combinazione di agonisti. L&#39;uso di piastrine lavate separati dal loro ambiente plasma e in assenza di anticoagulanti consente di studiare le proprietà intrinseche delle piastrine. Tra il grande pannello di agonisti, acido arachidonico (AA), adenosina di-fosfato (ADP), trombina e collagene sono i più usati. La risposta di aggregazione viene quantificato misurando la densità ottica relativa (OD) nel tempo di sospensione di piastrine sotto continua agitazione. Piastrine in sospensione omogenea limitano il passaggio della luce dopo l&#39;aggiunta di un agonista, piastrinico cambiamento forma verifica produrre un piccolo aumento transitorio in OD. A seguito di questa fase di attivazione iniziale, trombi piastrinici formano gradualmente, permettendo il passaggio della luce attraverso la sospensione come result di diminuita OD. Il processo di aggregazione è infine espresso in percentuale, rispetto alla densità ottica del plasma povero di piastrine o tampone. calibratura rigorosa è quindi essenziale all&#39;inizio di ogni esperimento. Come regola generale: taratura 0% è impostato misurando la densità ottica di una sospensione non stimolata piastrine mentre si misura la densità ottica del mezzo di sospensione non contenente piastrine rappresenta un valore del 100%. L&#39;aggregazione piastrinica è generalmente visualizzato come una curva di aggregazione in tempo reale. Turbidimetria è una delle tecniche di laboratorio più comunemente usati per lo studio della funzione piastrinica ed è considerato come il gold standard storico e utilizzato per lo sviluppo di nuovi agenti farmaceutici volti a inibire l&#39;aggregazione piastrinica. Qui, descriviamo protocolli dettagliati per 1) preparazione di umana lavato piastrine e 2) analisi turbidimetrica di aggregazione indotta da collagene di umana lavato piastrine pretrattato con il colorante alimentare blu brillante FCF che è stato recentemente identificata come inibitore di Pannexin1 canali (Panx1).

Il software aggregometro produce automaticamente le curve di aggregazione e fornisce i valori per l&#39;aggregazione massima in percentuale. I valori possono essere copiati ad un software di analisi dei dati per effettuare analisi statistiche e visualizza i valori massimi di aggregazione in forma di grafici a barre. Facoltativamente, ogni singolo punto delle curve di aggregazione possono essere esportati successivamente in un foglio elettronico e poi software statistico (es Grap...

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Turbidimetry on Human Washed Platelets: The Effect of the Pannexin1-inhibitor Brilliant Blue FCF on Collagen-induced Aggregation

Descriviamo un metodo semplice per l&#39;isolamento di piastrine lavate dal sangue umano seguita da agonista indotta misurazioni aggregazione piastrinica turbidimetria. A titolo di esempio applichiamo questo metodo per lo studio della risposta di aggregazione delle piastrine umane al collagene dopo un pre-incubazione con l&#39;inibitore del canale Pannexin1 blu brillante FCF.

Turbidimetria su Human Lavato Piastrine: l&#39;effetto della Pannexin1-inibitore blu brillante FCF sul livello di aggregazione indotta dal collagene

Turbidimetry is a laboratory technique that is applied to measure the aggregation of platelets suspended in either plasma (platelet-rich plasma, PRP) or ...

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Measuring Frailty in HIV-infected Individuals. Identification of Frail Patients is the First Step to Amelioration and Reversal of Frailty

Frailty in soggetti con infezione da HIV di misura. Identificazione dei pazienti fragili è il primo passo per la selezione e la Storno Frailty

A simple, validated protocol consisting of a battery of tests is available to identify elderly patients with frailty syndrome. This syndrome of decreased ...

A Thrombotic Stroke Model Based On Transient Cerebral Hypoxia-ischemia

Un trombotica Stroke modello basato sulla transitoria cerebrale ipossia-ischemia

Stroke research has endured many setbacks in translating neuroprotective therapies into clinical practice. In contrast, the real-world therapy (tPA ...

Phosphorus-31 Magnetic Resonance Spectroscopy: A Tool for Measuring In Vivo Mitochondrial Oxidative Phosphorylation Capacity in Human Skeletal Muscle

Phosphorus-31 Magnetic Resonance Spectroscopy: A Tool for Measuring In Vivo Mitochondrial Oxidative Phosphorylation Capacity in Human Skeletal Muscle

Fosforo-31 spettroscopia di risonanza magnetica: uno strumento per misurare<em&gt; In Vivo</em&gt; Capacità fosforilazione ossidativa mitocondriale nel muscolo scheletrico umano

Skeletal muscle mitochondrial oxidative phosphorylation (OXPHOS) capacity, which is critically important in health and disease, can be measured in vivo ...

Analyzing Beneficial Effects of Nutritional Supplements on Intestinal Epithelial Barrier Functions During Experimental Colitis

Analizzando Effetti benefici dei supplementi nutrizionali sulle funzioni intestinali epiteliali barriera durante Experimental Colitis

Inflammatory bowel diseases (IBD), including Crohn&#39;s disease and ulcerative colitis, are chronic relapsing disorders of the intestines. They cause ...

The 4-vessel Sampling Approach to Integrative Studies of Human Placental Physiology In Vivo

The 4-vessel Sampling Approach to Integrative Studies of Human Placental Physiology In Vivo

L&#39;approccio di campionamento a 4 nave per studi integrativi della fisiologia placentare umana<em&gt; In Vivo</em

The human placenta is highly inaccessible for research while still in utero. The current understanding of human placental physiology in vivo is therefore ...

Measuring the Effect of Chemicals on the Growth and Reproduction of Caenorhabditis elegans

Measuring the Effect of Chemicals on the Growth and Reproduction of Caenorhabditis elegans

Misurare l'effetto delle sostanze chimiche sulla crescita e sulla riproduzione di Caenorhabditis elegans

Toxicological evaluation is crucial for understanding the effects of chemicals on living organisms in basic and applied biological science fields. A ...

A Primary Human Trophoblast Model to Study the Effect of Inflammation Associated with Maternal Obesity on Regulation of Autophagy in the Placenta

Un modello di trofoblasto umano primario per studiare l'effetto di infiammazione associata con l'obesità materna sulla regolazione dell'autofagia nella Placenta

Maternal obesity is associated with an increased risk of adverse perinatal outcomes that are likely mediated by compromised placental function that can be ...