Name: caprresi: chimera assembly by plasmid recovery and restriction enzyme site insertion
Uploaded: 2017-06-25T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about CAPRRESI: Chimera Assembly by Plasmid Recovery and Restriction Enzyme Site Insertion at JoVE.com

עבודה זו נתמכה על ידי Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología, CONACYT, México (מענק מס &#39;154833) ו- Universidad Nacional Autonoma de México. המחברים מבקשים להודות לוויקטור גונזלס, לרוזה א. סנטומריה, לפטרישיה בוסטוס ולסולדדאד יוארז על עצהם המינהלית והטכנית.

1. פרוטוקול CAPRRESI הערה: איור 1 מייצג את פרוטוקול CAPRRESI הכולל. טכניקה זו מבוססת על עיצוב סיליקון הבנייה הבאים של chimeras הרצוי. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחירה של שיבוט פלסמיד, pUC18 או pUC19. <ol sty...

<ol>
	<li>Horton, R. M., Hunt, H. D., Ho, S. N., Pullen, J. K., Pease, L. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+hybrid+genes+without+the+use+of+restriction+enzymes:+gene+splicing+by+overlap+extension.">Engineering hybrid genes without the use of restriction enzymes: gene splicing by overlap extension.</a> Gene. 77 (1), 61-68 (1989).</li><li>Vos, M. J., Kampinga, H. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+PCR+amplification+strategy+for+unrestricted+generation+of+chimeric+genes.">A PCR amplification strategy for unrestricted generation of chimeric genes.</a> Anal. Biochem. 380 (2), 338-340 (2008).</li><li>Hawkins, N. C., Garriga, G., Beh, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Creating+Precise+GFP+Fusions+in+Plasmids+Using+Yeast+Homologous+Recombination.">Creating Precise GFP Fusions in Plasmids Using Yeast Homologous Recombination.</a> Biotechniques. 34 (1), 1-5 (2003).</li><li>Sander, J. D., Joung, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR-Cas+systems+for+editing,+regulating+and+targeting+genomes.">CRISPR-Cas systems for editing, regulating and targeting genomes.</a> Nat Biotechnol. 32 (4), 347-355 (2014).</li><li>Nagy, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cre+recombinase:+The+universal+reagent+for+genome+tailoring.">Cre recombinase: The universal reagent for genome tailoring.</a> Genesis. 26 (2), 99-109 (2000).</li><li>Gibson, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enzymatic+assembly+of+DNA+molecules+up+to+several+hundred+kilobases.">Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases.</a> Nature Methods. 6 (5), 343-345 (2009).</li><li>Norrander, J., Kempe, T., Messing, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Construction+of+improved+M13+vectors+using+oligodeoxynucleotide-directed+mutagenesis.">Construction of improved M13 vectors using oligodeoxynucleotide-directed mutagenesis.</a> Gene. 26 (1), 101-106 (1983).</li><li>Gruber, T. M., Gross, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+sigma+subunits+and+the+partitioning+of+bacterial+transcription+space.">Multiple sigma subunits and the partitioning of bacterial transcription space.</a> Annu Rev Microbiol. 57, 441-466 (2003).</li><li>Edgar, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MUSCLE:+multiple+sequence+alignment+with+high+accuracy+and+high+throughput.">MUSCLE: multiple sequence alignment with high accuracy and high throughput.</a> Nucleic Acids Res. 32 (5), 1792-1797 (2004).</li><li>Thompson, J. D., Gibson, T. J., Higgins, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+sequence+alignment+using+ClustalW+and+ClustalX.">Multiple sequence alignment using ClustalW and ClustalX.</a> Curr Protoc Bioinformatics. , 1-22 (2002).</li><li>Sambrook, J., Russell, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+Cloning:+A+laboratory+manual.">Molecular Cloning: A laboratory manual.</a> CSHLP. , (2001).</li><li>Rutherford, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Artemis:+sequence+visualization+and+annotation.">Artemis: sequence visualization and annotation.</a> Bioinformatics. 16 (10), 944-945 (2000).</li></ol>

CAPRRESI תוכנן כחלופה ל- PRM 2 . PRM המקורי הוא טכניקה חזקה; זה מאפשר את היתוך של רצפי DNA לאורך כל חלק של הגנים שנבחרו. עבור PRM, גנים wildtype צריך להיות משובטים לאותו פלסמיד. לאחר מכן, oligonucleotides נועדו בתוך wildtype ואנטיביוטיקה גנים ההתנגדות נמצא על הפלסמיד. שיבוש פלסמיד מוש...

הרכבה גנטית Chimeric כבר בשימוש נרחב בביולוגיה מולקולרית כדי להבהיר פונקציה חלבון ו / או למטרות ביוטכנולוגיות. קיימות שיטות שונות עבור גנים התכה, כגון חפיפה PCR הגברה המוצר 1 , התאוששות פלסמיד 2 , רקומבינציה הומולוגיים 3 , CRISPR-Cas9 מערכות 4 , מכוונת רקומבינציה 5 , ו Gibson הרכבה 6 . כל אחד מהם מציע יתרונות טכניים שונים; לדוגמה, את הגמישות של עיצוב PCR חופפים, את הבחירה vivo של קונסטרוקציות במהלך התאוששות פלסמיד, או היעילות הגבוהה של מערכות CRISPR-Cas9 ו גיבסון. מצד שני, כמה קשיים יכולים להתעורר בעת ביצוע כמה שיטות אלה; לדוגמה, שתי הגישות הראשונות מסתמכות על שברי דנ&quot;א קהים, ו קשירה של סוגים אלה של מוצרים יכול להיות מאתגר מבחינה טכנית לעומת sticKy- הסתיים קשירת. ריאקומבינציה מכוונת אתר יכולה להשאיר עקבות של רצפי DNA נוספים (scars) על המקור, כמו במערכת CreloxP 5 . CRISPR-Cas9 יכול לפעמים לשנות אזורי גנום אחרים בנוסף לאתר היעד 4 . כאן, אנו מציגים את ההרכבה של כימאים על ידי התאוששות פלסמידית והגבלת כניסה לאנזימים באתר (CAPRRESI), פרוטוקול להרכבת גנים המקודדים חלבונים המשלבים את שיטת ההתאוששות הפלסמידית (PRM) עם החדרת אתרי אנזים מגבילים על רצפי DNA נרדפים, . כדי להבטיח שלמות חומצות אמינו רצף, אתרי אנזים הגבלה מוכנסים על רצף דנ&quot;א נרדף מתיחה. בין היתרונות של CAPPRESI ניתן לעשות זאת באמצעות ריאגנטים רגילים של מעבדה / כלים ( למשל , אנזימים, תאים מוסמכים, פתרונות, ו thermocycler) וכי הוא יכול לתת תוצאות מהירות (כאשר האנזימים המתאימים משמשים). הסתמכות על הגבלהאתרי האנזים המגיעים מרצפי DNA נרדפים יכולים להגביל את הבחירה של נקודות ההיתוך המדויקות בתוך החלבונים המעניינים. במקרים כאלה, גנים היעד צריך להיות התמזגו באמצעות oligonucleotides חופפים, אתרי הגבלת אנזים צריך להיות מוכנס אל הגן ההתנגדות של וקטור. CAPRRESI מורכב שבעה שלבים פשוטים ( איור 1 ): 1) הבחירה של וקטור שיבוט, pUC18 או pUC19 6 ; 2) בניתוח סיליקו של sequtyences wildtype להיות התמזגו; 3) בחירה של אזורים שבירת הרכבה כימרה ו הפרעה פלסמיד; 4) בדור סיליקו של רצפי דנ&quot;א נרדפים המכילים אתרי אנזים מגבילים; 5) שיבוט עצמאי של הגנים wildtype לתוך הפלסמיד הנבחר; 6) הפרעה פלסמיד ידי PCR, ואחריו הגבלת אנזים אכול; ו 7) התאוששות פלסמיד באמצעות קשירת דנ&quot;א שינוי בקטריאלי. גנים Chimeric המיוצרים על ידי טכניקה זו צריך להיות מאומת wIth רצף. PUC18 / 19 וקטורים מציעים יתרונות טכניים עבור שיבוט ו כימרה הרכבה, כגון גודל קטן ( כלומר, 2,686 זוגות זוג), מספר עותק גבוה, תכונות תגובה רצף יתרון, וזמינות מסחרית 7 . כאן, המארח Escherichia coli שימש כדי להרכיב ולטפל chimeras כי תרבויות חיידקים זולים לגדול מהר. בהתחשב בכך, שיבוט הבאים של שברי היתוך לתוך פלסמידים היעד הסופי יהיה צורך ( למשל, וקטורים ביטוי כמו pRK415 בחיידקים או pCMV בתאי יונקים). CAPRRESI נבדק עבור מיזוג שני גנים עיקריים גורם sigma: E. colirpoD ו Rhizobium etlisigA . גורמי סיגמא ראשוניים הם יחידות RNA פולימראז האחראיות ליזום שעתוק, והם מורכבים מארבעה תחומים ( כלומר , σ1, σ2, σ3 ו- σ4) 8 . רצף חומצות האמינו lengtH של חלבונים המקודדים על ידי rpoD ו sigA הם 613 ו 685, בהתאמה. RpoD ו SigA לשתף 48% זהות (98% כיסוי). גורמי הסיגמא העיקריים הללו נחלקו לשני חלקים משלימים בין אזורים σ2 ו- σ3. שני גנים chimeric התאספו על פי עיצוב זה: כימרה 01 (RpoDσ1-σ2 + SigAσ3-σ4) ו chimera 02 (SigAσ1-σ2 + RpoDσ3-σ4). מוצרים היתוך דנ&quot;א אומתו על ידי רצף.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="756">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Platinum Taq DNA polymerase High Fidelity</td>
			<td style="width:71px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:115px;">11304011</td>
			<td style="width:355px;">Produces a mix of blunt/3&#8217;-A overhang ended PCR products</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">High pure plasmid isolation kit</td>
			<td style="width:71px;">Roche</td>
			<td style="width:115px;">11754785001</td>
			<td>Used for all plasmid purification reactions</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">High pure PCR product purification kit</td>
			<td style="width:71px;">Roche</td>
			<td style="width:115px;">11732676001</td>
			<td>Used for all PCR purification reactions from agarose gels</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">AflII restriction enzyme</td>
			<td style="width:71px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:115px;">R0520L</td>
			<td>Recognizes sequence 5&#8217;-CTTAAG-3&#8217; and cuts at 37 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">KpnI-HF restriction enzyme</td>
			<td style="width:71px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:115px;">R3142L</td>
			<td>Recognizes sequence 5&#8217;-GGTACC-3&#8217; and cuts at 37 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">SpeI-HF restriction enzyme</td>
			<td style="width:71px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:115px;">R3133L</td>
			<td>Recognizes sequence 5&#8217;-ACTAGT-3&#8217; and cuts at 37 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">XbaI restriction enzyme</td>
			<td style="width:71px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:115px;">R0145L</td>
			<td>Recognizes sequence 5&#8217;-TCTAGA-3&#8217; and cuts at 37 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Ampicillin sodium salt</td>
			<td style="width:71px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:115px;">A0166-5G</td>
			<td>Antibiotics</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Nalidixic acid</td>
			<td style="width:71px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:115px;">N8878-5G</td>
			<td>Antibiotics</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Yeast Extract</td>
			<td style="width:71px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:115px;">Y1625-1KG</td>
			<td>Bacterial cell culture</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Casein peptone</td>
			<td style="width:71px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:115px;">70171-500G</td>
			<td>Bacterial cell culture</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">NaCl</td>
			<td style="width:71px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:115px;">S9888-1KG</td>
			<td>Sodium chloride</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Agar</td>
			<td style="width:71px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:115px;">05040-1KG</td>
			<td>Bacterial cell culture</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">XbaI restriction enzyme</td>
			<td style="width:71px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:115px;">FD0684</td>
			<td>Fast digest XbaI enzyme</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">KpnI restriction enzyme</td>
			<td style="width:71px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:115px;">FD0524</td>
			<td>Fast digest KpnI enzyme</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Quick Ligation Kit</td>
			<td style="width:71px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:115px;">M2200S</td>
			<td>Fast DNA ligation kit</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">AflII restriction enzyme</td>
			<td style="width:71px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:115px;">FD0834</td>
			<td>Fast digest AflII enzyme</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">SpeI restriction enzyme</td>
			<td style="width:71px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:115px;">FD1253</td>
			<td>Fast digest SpeI enzyme</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

caprresi: chimera assembly by plasmid recovery and restriction enzyme site insertion

כאן, אנו מציגים כימרה הרכבה על ידי התאוששות פלסמיד והגבלה אנזים האתר הכניסה (CAPRRESI). יתרונות CAPRRESI מכוחות רבים של שיטת ההתאוששות הפלסמידית המקורית ומציג עיכול אנזים הגבלה כדי להקל על תגובות קשירת DNA (נדרש הרכבה כימרה). עבור פרוטוקול זה, משתמשים שיבוט wildtype גנים לתוך פלסמיד זהה (pUC18 או pUC19). לאחר הבחירה סיליקו של רצף חומצות אמינו אזורים שבהם chimeras צריך להיות התאספו, משתמשים לקבל את כל רצפי DNA נרדף לקודד אותם. אד סקריפטים Perl לאפשר למשתמשים לקבוע את כל רצפי DNA נרדף. לאחר שלב זה, עוד סקריפט Perl מחפש אתרי אנזים הגבלה על כל רצפי DNA נרדף. זה ניתוח סיליקו מבוצע גם באמצעות הגן עמיד ampicillin ( ampR ) נמצא על pUC18 / 19 פלסמידים. משתמשים בעיצוב oligonucleotides בתוך אזורים נרדפים לשבש wildtype ו ampR גנים על ידי PCR. לאחר קבלתAining ו טיהור שברי דנ&quot;א משלימים, עיכול אנזים הגבלה הושלמה. כימרה הרכבה מושגת על ידי ligating מתאים משברים דנ&quot;א משלימים. PUC18 / 19 וקטורים נבחרים עבור CAPRRESI כי הם מציעים יתרונות טכניים, כגון גודל קטן (2,686 זוגות זוג), מספר עותק גבוה, תכונות תגובה רצף יתרון, וזמינות מסחרית. השימוש אנזימים הגבלת הרכבה כימרה מבטלת את הצורך פולימרים DNA המניבים מוצרים קהה- End. CAPRRESI היא שיטה מהירה וזולה עבור מיזוג גנים המקודדים חלבונים.

איור 1 מתאר את CAPRRESI. באמצעות שיטה זו, שני גנים chimeric התאספו על ידי החלפת תחומים של שני גורמי סיגמא עיקרי חיידקי ( כלומר, E. coli RpoD ו R. etli SigA). רצפי ה- DNA של גנים rpoD ו sigA התקבלו באמצעות דפדפן Genome Genem 14 מ GenBank קבצים הגנום N...

Watch this Scientific Journal Video about CAPRRESI: Chimera Assembly by Plasmid Recovery and Restriction Enzyme Site Insertion at JoVE.com

CAPRRESI: Chimera Assembly by Plasmid Recovery and Restriction Enzyme Site Insertion

כאן, אנו מציגים כימרה הרכבה על ידי התאוששות פלסמיד והגבלת אנזים האתר הכניסה (CAPRRESI), פרוטוקול המבוסס על החדרת אתרי אנזים הגבלה לתוך רצפי DNA נרדף התאוששות פלסמיד פונקציונלי. פרוטוקול זה הוא שיטה מהירה בעלות נמוכה עבור מיזוג גנים מקודדים חלבונים.

CAPRRESI: כימרה האסיפה על ידי פלסמיד השחזור והגבלת אנזים האתר הכנס

Here, we present chimera assembly by plasmid recovery and restriction enzyme site insertion (CAPRRESI). CAPRRESI benefits from many strengths of the ...

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Biology

Genetics

Biotechnology

SCIENTISTS IN ACTION

Principles of Site-Specific Recombinase (SSR) Technology

Principles of Site-Specific Recombinase SSR Technology

עקרונות אתר ספציפיות recombinase (SSR) טכנולוגיה

Site-specific recombinase (SSR) technology allows the manipulation of gene structure to explore gene function and has become an integral tool of molecular ...

Assembly, Loading, and Alignment of an Analytical Ultracentrifuge Sample Cell

העצרת, טוען, ואת המערך של תא ultracentrifuge אנליטית לדוגמא

The analytical ultracentrifuge (AUC) is a powerful biophysical tool that allows us to record macromolecular sedimentation profiles during high speed ...

Primary Culture and Plasmid Electroporation of the Murine Organ of Corti. 

תרבות ראשיים electroporation פלסמיד של האיבר Murine של קורטי.

In all mammals, the sensory epithelium for audition is located along the spiraling organ of Corti that resides within the conch shaped cochlea of the ...

Production of Transgenic Xenopus laevis by Restriction Enzyme Mediated Integration and Nuclear Transplantation

Production of Transgenic Xenopus laevis by Restriction Enzyme Mediated Integration and Nuclear Transplantation

הפקה של טראנסגנטי Xenopus laevis על ידי שילוב אנזימים מתווכת הגבלת והשתלות גרעיני

Stable integration of cloned gene products into the Xenopus genome is necessary to control the time and place of expression, to express genes at later ...

Solid Plate-based Dietary Restriction in Caenorhabditis elegans

Solid Plate-based Dietary Restriction in Caenorhabditis elegans

Solid פלייט מבוססי הגבלת תזונתיים ב Caenorhabditis elegans</em

Reduction of food intake without malnutrition or starvation is known to increase lifespan and delay the onset of various age-related diseases in a wide ...

High-throughput Yeast Plasmid Overexpression Screen

תפוקה גבוהה Overexpression פלסמיד שמרים מסך

The budding yeast, Saccharomyces cerevisiae, is a powerful model system for defining fundamental mechanisms of many important cellular processes, ...

Monitoring Plasmid Replication in Live Mammalian Cells over Multiple Generations by Fluorescence Microscopy

ניטור כפול פלסמיד בתאי יונקים חיים דרך מספר דורות על ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטי

Few naturally-occurring plasmids are maintained in mammalian cells.  Among these are genomes of gamma-herpesviruses, including Epstein-Barr virus  (EBV) ...

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

במעקב 4 ממדי Vivo של תאי גזע ואבות היווצרות דם במבוגרי עכבר calvarial מח עצם

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) ...

Generation of Plasmid Vectors Expressing FLAG-tagged Proteins Under the Regulation of Human Elongation Factor-1&#945; Promoter Using Gibson Assembly

Generation of Plasmid Vectors Expressing FLAG-tagged Proteins Under the Regulation of Human Elongation Factor-1ÃƒÅ½Ã‚Â± Promoter Using Gibson Assembly

דור של פלסמיד וקטורים לבטא חלבונים מתויג FLAG על פי תקנות ההסדרה של יזם אדם התארכות Factor-1α שימוש גיבסון עצרת

Gibson assembly (GA) cloning offers a rapid, reliable, and flexible alternative to conventional DNA cloning methods. We used GA to create customized ...

Fecal Glucocorticoid Analysis: Non-invasive Adrenal Monitoring in Equids

ניתוח Glucocorticoid צואה: לא פולשני ניטור הכליה ב Equids

Adrenal activity can be assessed in the equine species by analysis of feces for corticosterone metabolites. During a potentially aversive situation, ...