Name: caprresi: chimera assembly by plasmid recovery and restriction enzyme site insertion
Uploaded: 2017-06-25T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about CAPRRESI: Chimera Assembly by Plasmid Recovery and Restriction Enzyme Site Insertion at JoVE.com

Dette arbeidet ble støttet av Consejo Nacional de Ciencia og Tecnología, CONACYT, México (stipendnummer 154833) og Universidad Nacional Autónoma de México. Forfatterne ønsker å takke Víctor González, Rosa I. Santamaría, Patricia Bustos og Soledad Juárez for deres administrative og tekniske råd.

1. CAPRRESI-protokoll MERK: Figur 1 representerer den generelle CAPRRESI-protokollen. Denne teknikken er basert på en silikondesign og den etterfølgende konstruksjonen av de ønskede kimærene. <ol><li> Utvalg av kloningsplasmidet, pUC18 eller pUC19. <ol><li> Velg pUC-vektoren som best passer til tekniske krav. MERK: Begge vektorer har samme sekvens, unntatt orienteringen av det flere kloningsstedet. Dette er viktig for utformingen av oli...

<ol>
	<li>Horton, R. M., Hunt, H. D., Ho, S. N., Pullen, J. K., Pease, L. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+hybrid+genes+without+the+use+of+restriction+enzymes:+gene+splicing+by+overlap+extension.">Engineering hybrid genes without the use of restriction enzymes: gene splicing by overlap extension.</a> Gene. 77 (1), 61-68 (1989).</li><li>Vos, M. J., Kampinga, H. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+PCR+amplification+strategy+for+unrestricted+generation+of+chimeric+genes.">A PCR amplification strategy for unrestricted generation of chimeric genes.</a> Anal. Biochem. 380 (2), 338-340 (2008).</li><li>Hawkins, N. C., Garriga, G., Beh, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Creating+Precise+GFP+Fusions+in+Plasmids+Using+Yeast+Homologous+Recombination.">Creating Precise GFP Fusions in Plasmids Using Yeast Homologous Recombination.</a> Biotechniques. 34 (1), 1-5 (2003).</li><li>Sander, J. D., Joung, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR-Cas+systems+for+editing,+regulating+and+targeting+genomes.">CRISPR-Cas systems for editing, regulating and targeting genomes.</a> Nat Biotechnol. 32 (4), 347-355 (2014).</li><li>Nagy, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cre+recombinase:+The+universal+reagent+for+genome+tailoring.">Cre recombinase: The universal reagent for genome tailoring.</a> Genesis. 26 (2), 99-109 (2000).</li><li>Gibson, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enzymatic+assembly+of+DNA+molecules+up+to+several+hundred+kilobases.">Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases.</a> Nature Methods. 6 (5), 343-345 (2009).</li><li>Norrander, J., Kempe, T., Messing, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Construction+of+improved+M13+vectors+using+oligodeoxynucleotide-directed+mutagenesis.">Construction of improved M13 vectors using oligodeoxynucleotide-directed mutagenesis.</a> Gene. 26 (1), 101-106 (1983).</li><li>Gruber, T. M., Gross, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+sigma+subunits+and+the+partitioning+of+bacterial+transcription+space.">Multiple sigma subunits and the partitioning of bacterial transcription space.</a> Annu Rev Microbiol. 57, 441-466 (2003).</li><li>Edgar, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MUSCLE:+multiple+sequence+alignment+with+high+accuracy+and+high+throughput.">MUSCLE: multiple sequence alignment with high accuracy and high throughput.</a> Nucleic Acids Res. 32 (5), 1792-1797 (2004).</li><li>Thompson, J. D., Gibson, T. J., Higgins, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+sequence+alignment+using+ClustalW+and+ClustalX.">Multiple sequence alignment using ClustalW and ClustalX.</a> Curr Protoc Bioinformatics. , 1-22 (2002).</li><li>Sambrook, J., Russell, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+Cloning:+A+laboratory+manual.">Molecular Cloning: A laboratory manual.</a> CSHLP. , (2001).</li><li>Rutherford, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Artemis:+sequence+visualization+and+annotation.">Artemis: sequence visualization and annotation.</a> Bioinformatics. 16 (10), 944-945 (2000).</li></ol>

CAPRRESI ble designet som et alternativ til PRM 2 . Den opprinnelige PRM er en kraftig teknikk; Det tillater fusjon av DNA-sekvenser langs hvilken som helst del av de valgte gener. For PRM bør wildtype-gener klones inn i det samme plasmidet. Deretter er oligonukleotider konstruert inne i wildtype- og antibiotikaresistensgener funnet på plasmidet. Plasmidforstyrrelse oppnås ved PCR ved bruk av stump-endede, høyfidelis-DNA-polymeraser og tidligere utformede oligonukleotider. Ligeringen av kompl...

Kimære gensamlinger har blitt mye brukt i molekylærbiologi for å belyse proteinfunksjon og / eller bioteknologiske formål. Forskjellige metoder eksisterer for fusjonsgener, slik som overlappende PCR-produktforsterkning 1 , plasmidutvinning 2 , homolog rekombinasjon 3 , CRISPR-Cas9-systemer 4 , stedregistrert rekombinasjon 5 og Gibson-samling 6 . Hver av disse tilbyr forskjellige tekniske fordeler; For eksempel fleksibiliteten til overlappende PCR-design, in vivo- valget av konstruksjoner under plasmidutvinning eller høy effektivitet av CRISPR-Cas9- og Gibson-systemer. På den annen side kan det oppstå noen vanskeligheter når du utfører noen av disse metodene; For eksempel er de to første tilnærmingene avhengig av stumpede DNA-fragmenter, og ligering av disse typer produkter kan være teknisk utfordrende sammenlignet med stikkKy-endig ligering. Site-directed rekombination kan etterlate spor av ekstra DNA-sekvenser (arr) på originalen, som i CrecoxP- systemet 5 . CRISPR-Cas9 kan noen ganger endre andre genomregioner i tillegg til målstedet 4 . Her presenterer vi chimera-montering ved plasmidgjenoppretting og restriksjonsenzymstedinnsetting (CAPRRESI), en protokoll for fusing proteinkoding gener som kombinerer plasmidgjenvinningsmetoden (PRM) med innsetting av restriksjonsenzymsteder på synonym-DNA-sekvenser, forbedrende ligeringseffektivitet . For å sikre aminosyresekvensintegritet settes restriksjonsenzymsteder inn på synonym-DNA-sekvensstrøk. Blant fordelene med CAPPRESI er at den kan utføres ved hjelp av vanlige laboratoriereagenser / verktøy ( f.eks . Enzymer, kompetente celler, løsninger og termocykler) og at det kan gi raske resultater (når de aktuelle enzymer brukes). Stole på begrensningEnzymsteder som kommer fra synonym-DNA-sekvenser kan begrense valget av de eksakte fusjonspunktene inne i proteiene av interesse. I slike tilfeller bør målgener bli fusjonert ved bruk av overlappende oligonukleotider, og restriktionsenzymsteder bør settes inn på resistensgenet til vektoren. CAPRRESI består av syv enkle trinn ( figur 1 ): 1) utvalg av kloningsvektoren, pUC18 eller pUC196; 2) i silikoanalyse av wildtype-sekvensene som skal smeltes; 3) utvalg av bryteområder for kimærsammenstilling og plasmidforstyrrelse; 4) i silico- generasjon av synonym-DNA-sekvenser som inneholder restriksjonsenzymsteder; 5) uavhengig kloning av wildtype-gener til det valgte plasmid; 6) plasmidforstyrrelse ved PCR, etterfulgt av restriktionsenzym fordøyelse; Og 7) plasmidutvinning ved bruk av DNA-ligering og bakteriell transformasjon. Kimære gener fremstilt ved denne teknikken bør verifiseres wEtter sekvensering. PUC18 / 19 vektorer tilbyr tekniske fordeler for kloning og kimærmontering, for eksempel liten størrelse ( dvs. 2 686 basepar), høykopi-nummer, fordelaktige sekvenseringsreaksjonsfunksjoner og kommersiell tilgjengelighet 7 . Her ble en Escherichia coli vert brukt til å samle og håndtere chimærene fordi bakteriekulturer er billige og vokser raskt. På grunn av dette vil etterfølgende kloning av fusjonsfragmentene i de endelige målplasmiderne være nødvendig ( eks. Ekspresjonsvektorer som pRK415 i bakterier eller pCMV i pattedyrceller). CAPRRESI ble testet for å fusere to primære sigmafaktorgener: E. colirpoD og Rhizobium etlisigA . Primær sigmafaktorer er RNA-polymerasubenheter som er ansvarlige for transkripsjonsinitiering, og de består av fire domener ( dvs. σ1, σ2, σ3 og σ4) 8 . Aminosyresekvensen lengterH av proteiner kodet av rpoD og sigA er henholdsvis 613 og 685. RpoD og SigA deler 48% identitet (98% dekning). Disse primære sigmafaktorene ble delt inn i to komplementære fragmenter mellom regioner σ2 og σ3. To kimære gener ble samlet i henhold til denne konstruksjonen: chimera 01 (RpoDσ1-σ2 + SigAσ3-σ4) og kimær 02 (SigAσ1-σ2 + RpoDσ3-σ4). DNA-fusjonsprodukter ble verifisert ved sekvensering.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="756">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Platinum Taq DNA polymerase High Fidelity</td>
			<td style="width:71px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:115px;">11304011</td>
			<td style="width:355px;">Produces a mix of blunt/3&#8217;-A overhang ended PCR products</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">High pure plasmid isolation kit</td>
			<td style="width:71px;">Roche</td>
			<td style="width:115px;">11754785001</td>
			<td>Used for all plasmid purification reactions</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">High pure PCR product purification kit</td>
			<td style="width:71px;">Roche</td>
			<td style="width:115px;">11732676001</td>
			<td>Used for all PCR purification reactions from agarose gels</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">AflII restriction enzyme</td>
			<td style="width:71px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:115px;">R0520L</td>
			<td>Recognizes sequence 5&#8217;-CTTAAG-3&#8217; and cuts at 37 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">KpnI-HF restriction enzyme</td>
			<td style="width:71px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:115px;">R3142L</td>
			<td>Recognizes sequence 5&#8217;-GGTACC-3&#8217; and cuts at 37 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">SpeI-HF restriction enzyme</td>
			<td style="width:71px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:115px;">R3133L</td>
			<td>Recognizes sequence 5&#8217;-ACTAGT-3&#8217; and cuts at 37 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">XbaI restriction enzyme</td>
			<td style="width:71px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:115px;">R0145L</td>
			<td>Recognizes sequence 5&#8217;-TCTAGA-3&#8217; and cuts at 37 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Ampicillin sodium salt</td>
			<td style="width:71px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:115px;">A0166-5G</td>
			<td>Antibiotics</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Nalidixic acid</td>
			<td style="width:71px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:115px;">N8878-5G</td>
			<td>Antibiotics</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Yeast Extract</td>
			<td style="width:71px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:115px;">Y1625-1KG</td>
			<td>Bacterial cell culture</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Casein peptone</td>
			<td style="width:71px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:115px;">70171-500G</td>
			<td>Bacterial cell culture</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">NaCl</td>
			<td style="width:71px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:115px;">S9888-1KG</td>
			<td>Sodium chloride</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Agar</td>
			<td style="width:71px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:115px;">05040-1KG</td>
			<td>Bacterial cell culture</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">XbaI restriction enzyme</td>
			<td style="width:71px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:115px;">FD0684</td>
			<td>Fast digest XbaI enzyme</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">KpnI restriction enzyme</td>
			<td style="width:71px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:115px;">FD0524</td>
			<td>Fast digest KpnI enzyme</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Quick Ligation Kit</td>
			<td style="width:71px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:115px;">M2200S</td>
			<td>Fast DNA ligation kit</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">AflII restriction enzyme</td>
			<td style="width:71px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:115px;">FD0834</td>
			<td>Fast digest AflII enzyme</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">SpeI restriction enzyme</td>
			<td style="width:71px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:115px;">FD1253</td>
			<td>Fast digest SpeI enzyme</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

caprresi: chimera assembly by plasmid recovery and restriction enzyme site insertion

Her presenterer vi kimærmontering ved plasmidgjenoppretting og restriksjon av enzyminnlegg (CAPRRESI). CAPRRESI drar fordel av mange styrker av den opprinnelige plasmidgjenvinningsmetoden og introduserer restriktionsenzymfordøyelse for å lette DNA-ligeringsreaksjoner (kreves for kimærmontering). For denne protokollen klones brukere av wildtype-gener i det samme plasmidet (pUC18 eller pUC19). Etter at silikoseleksjonen av aminosyresekvensregioner hvor kimærene skulle settes sammen, oppnår brukere alle de synonym-DNA-sekvensene som koder for dem. Ad hoc Perl skript gir brukere mulighet til å bestemme alle synonyme DNA-sekvenser. Etter dette trinnet søker et annet Perl-skript for restriktionsenzymsteder på alle synonym-DNA-sekvenser. Dette i silikoanalyse utføres også ved bruk av ampicillinresistensgenet ( ampR ) funnet på pUC18 / 19 plasmider. Brukere utformer oligonukleotider inne i synonymområder for å forstyrre wildtype- og ampR- gener ved PCR. Etter obtAining og rensing av komplementære DNA-fragmenter, oppnås restriksjon enzym-fordøyelse. Kimærsammenstilling oppnås ved å ligere passende komplementære DNA-fragmenter. PUC18 / 19 vektorer er valgt for CAPRRESI fordi de tilbyr tekniske fordeler, som for eksempel liten størrelse (2 686 basepar), høy kopiantal, fordelaktige sekvenseringsreaksjonsfunksjoner og kommersiell tilgjengelighet. Bruken av restriksjonsenzymer for kimærsammensetning eliminerer behovet for DNA-polymeraser som gir truende produkter. CAPRRESI er en rask og rimelig metode for fusjon av proteinkoding gener.

Figur 1 viser CAPRRESI. Ved anvendelse av denne metoden ble to kimære gener samlet ved å bytte domenene til to bakterielle primære sigmafaktorer ( dvs. E. coli RpoD og R. etli SigA). DNA-sekvensene av rpoD- og sigA- gener ble oppnådd ved bruk av Artemis Genome Browser 14 fra henholdsvis GenBank-genomfiler NC_000913 og NC_007761. DNA-sekvensen av pUC18-vektoren ble oppnådd fra nukleotiddatabasen til NCBI-ser...

Watch this Scientific Journal Video about CAPRRESI: Chimera Assembly by Plasmid Recovery and Restriction Enzyme Site Insertion at JoVE.com

CAPRRESI: Chimera Assembly by Plasmid Recovery and Restriction Enzyme Site Insertion

Her presenterer vi kimærmontering ved plasmidgjenoppretting og restriksjonsenzymstedinnsetting (CAPRRESI), en protokoll basert på innsetting av restriksjonsenzymsteder i synonym-DNA-sekvenser og funksjonell plasmidutvinning. Denne protokollen er en rask og rimelig metode for fusjon av proteinkoding-gener.

CAPRRESI: Chimera Assembly ved Plasmid Recovery og Restriction Enzyme Site Insertion

Here, we present chimera assembly by plasmid recovery and restriction enzyme site insertion (CAPRRESI). CAPRRESI benefits from many strengths of the ...

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Biology

Genetics

Biotechnology

SCIENTISTS IN ACTION

Principles of Site-Specific Recombinase (SSR) Technology

Principles of Site-Specific Recombinase SSR Technology

Site-specific recombinase (SSR) technology allows the manipulation of gene structure to explore gene function and has become an integral tool of molecular ...

Assembly, Loading, and Alignment of an Analytical Ultracentrifuge Sample Cell

The analytical ultracentrifuge (AUC) is a powerful biophysical tool that allows us to record macromolecular sedimentation profiles during high speed ...

Primary Culture and Plasmid Electroporation of the Murine Organ of Corti. 

In all mammals, the sensory epithelium for audition is located along the spiraling organ of Corti that resides within the conch shaped cochlea of the ...

Production of Transgenic Xenopus laevis by Restriction Enzyme Mediated Integration and Nuclear Transplantation

Production of Transgenic Xenopus laevis by Restriction Enzyme Mediated Integration and Nuclear Transplantation

Stable integration of cloned gene products into the Xenopus genome is necessary to control the time and place of expression, to express genes at later ...

Solid Plate-based Dietary Restriction in Caenorhabditis elegans

Solid Plate-based Dietary Restriction in Caenorhabditis elegans

Reduction of food intake without malnutrition or starvation is known to increase lifespan and delay the onset of various age-related diseases in a wide ...

High-throughput Yeast Plasmid Overexpression Screen

The budding yeast, Saccharomyces cerevisiae, is a powerful model system for defining fundamental mechanisms of many important cellular processes, ...

Monitoring Plasmid Replication in Live Mammalian Cells over Multiple Generations by Fluorescence Microscopy

Overvåking plasmidreplikasjon i Live pattedyrceller over flere generasjoner av fluorescensmikropskopi

Few naturally-occurring plasmids are maintained in mammalian cells.  Among these are genomes of gamma-herpesviruses, including Epstein-Barr virus  (EBV) ...

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

In Vivo 4-Dimensional Sporing av Hematopoietiske Stem og stamceller i Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) ...

Generation of Plasmid Vectors Expressing FLAG-tagged Proteins Under the Regulation of Human Elongation Factor-1&#945; Promoter Using Gibson Assembly

Generation of Plasmid Vectors Expressing FLAG-tagged Proteins Under the Regulation of Human Elongation Factor-1ÃƒÅ½Ã‚Â± Promoter Using Gibson Assembly

Generasjon av Plasmidvektorer Uttrykke FLAG-merket Proteiner Under forordning of Human Forlengelse Factor-1α Arrangøren Bruke Gibson Assembly

Gibson assembly (GA) cloning offers a rapid, reliable, and flexible alternative to conventional DNA cloning methods. We used GA to create customized ...

Fecal Glucocorticoid Analysis: Non-invasive Adrenal Monitoring in Equids

Fecal Glukokortikoid analyse: Ikke-invasiv Adrenal Monitoring i Equids

Adrenal activity can be assessed in the equine species by analysis of feces for corticosterone metabolites. During a potentially aversive situation, ...