Name: caprresi: chimera assembly by plasmid recovery and restriction enzyme site insertion
Uploaded: 2017-06-25T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about CAPRRESI: Chimera Assembly by Plasmid Recovery and Restriction Enzyme Site Insertion at JoVE.com

Эта работа была поддержана Национальным конгрессом и технологией, КОНАЦИТом, Мексикой (грант № 154833) и Национальной академией штата Мексика. Авторы хотели бы поблагодарить Виктора Гонсалеса, Розу И. Сантамарию, Патрицию Бустос и Соледада Хуареса за их административные и технические консультации.

1. Протокол CAPRRESI ПРИМЕЧАНИЕ. На рисунке 1 представлен общий протокол CAPRRESI. Этот метод основан на силиконе и последующей конструкции желаемых химер. <ol><li> Выбор клонирующей плазмиды, pUC18 или pUC19. <ol><li> Выберите вектор pUC, который наилучшим образом соот...

<ol>
	<li>Horton, R. M., Hunt, H. D., Ho, S. N., Pullen, J. K., Pease, L. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+hybrid+genes+without+the+use+of+restriction+enzymes:+gene+splicing+by+overlap+extension.">Engineering hybrid genes without the use of restriction enzymes: gene splicing by overlap extension.</a> Gene. 77 (1), 61-68 (1989).</li><li>Vos, M. J., Kampinga, H. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+PCR+amplification+strategy+for+unrestricted+generation+of+chimeric+genes.">A PCR amplification strategy for unrestricted generation of chimeric genes.</a> Anal. Biochem. 380 (2), 338-340 (2008).</li><li>Hawkins, N. C., Garriga, G., Beh, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Creating+Precise+GFP+Fusions+in+Plasmids+Using+Yeast+Homologous+Recombination.">Creating Precise GFP Fusions in Plasmids Using Yeast Homologous Recombination.</a> Biotechniques. 34 (1), 1-5 (2003).</li><li>Sander, J. D., Joung, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR-Cas+systems+for+editing,+regulating+and+targeting+genomes.">CRISPR-Cas systems for editing, regulating and targeting genomes.</a> Nat Biotechnol. 32 (4), 347-355 (2014).</li><li>Nagy, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cre+recombinase:+The+universal+reagent+for+genome+tailoring.">Cre recombinase: The universal reagent for genome tailoring.</a> Genesis. 26 (2), 99-109 (2000).</li><li>Gibson, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enzymatic+assembly+of+DNA+molecules+up+to+several+hundred+kilobases.">Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases.</a> Nature Methods. 6 (5), 343-345 (2009).</li><li>Norrander, J., Kempe, T., Messing, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Construction+of+improved+M13+vectors+using+oligodeoxynucleotide-directed+mutagenesis.">Construction of improved M13 vectors using oligodeoxynucleotide-directed mutagenesis.</a> Gene. 26 (1), 101-106 (1983).</li><li>Gruber, T. M., Gross, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+sigma+subunits+and+the+partitioning+of+bacterial+transcription+space.">Multiple sigma subunits and the partitioning of bacterial transcription space.</a> Annu Rev Microbiol. 57, 441-466 (2003).</li><li>Edgar, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MUSCLE:+multiple+sequence+alignment+with+high+accuracy+and+high+throughput.">MUSCLE: multiple sequence alignment with high accuracy and high throughput.</a> Nucleic Acids Res. 32 (5), 1792-1797 (2004).</li><li>Thompson, J. D., Gibson, T. J., Higgins, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+sequence+alignment+using+ClustalW+and+ClustalX.">Multiple sequence alignment using ClustalW and ClustalX.</a> Curr Protoc Bioinformatics. , 1-22 (2002).</li><li>Sambrook, J., Russell, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+Cloning:+A+laboratory+manual.">Molecular Cloning: A laboratory manual.</a> CSHLP. , (2001).</li><li>Rutherford, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Artemis:+sequence+visualization+and+annotation.">Artemis: sequence visualization and annotation.</a> Bioinformatics. 16 (10), 944-945 (2000).</li></ol>

CAPRRESI был разработан как альтернатива PRM 2 . Оригинальный PRM - это мощная техника; Он позволяет слияние последовательностей ДНК вдоль любой части выбранных генов. Для PRM ​​гены дикого типа должны быть клонированы в одну и ту же плазмиду. После этого олигонуклеотиды сконструи?...

Сбор химерных генов широко используется в молекулярной биологии для выяснения функции белка и / или для биотехнологических целей. Существуют различные способы слияния генов, такие как перекрытие амплификации ПЦР-продукта 1 , восстановление плазмиды 2 , гомологичная рекомбинация 3 , системы CRISPR-Cas9 4 , сайт-направленная рекомбинация 5 и сборка 6 Гибсона. Каждый из них предлагает различные технические преимущества; Например, гибкость перекрывающегося проектирования ПЦР, выбор конструкций конструкций во время восстановления плазмиды in vivo или высокая эффективность систем CRISPR-Cas9 и Gibson. С другой стороны, некоторые трудности могут возникать при выполнении некоторых из этих методов; Например, первые два подхода основываются на фрагментах ДНК с тупым концом, и лигирование этих типов продуктов может быть технически сложным по сравнению со стандартнымиKy-end лигирование. Рекомбинация на сайте может оставлять следы дополнительных ДНК-последовательностей (шрамов) на оригинале, как в системе CreloxoxP 5 . CRISPR-Cas9 может иногда модифицировать другие области генома в дополнение к целевому сайту 4 . Здесь мы вводим сбор химеры путем извлечения плазмиды и введения сайта рестрикционного фермента (CAPRRESI), протокола для слияния белок-кодирующих генов, который объединяет способ восстановления плазмиды (PRM) с введением сайтов рестрикционных ферментов на синонимичные последовательности ДНК, повышая эффективность лигирования , Для обеспечения целостности аминокислотных последовательностей сайты рестрикционных ферментов вставляются в синонимичные последовательности ДНК. Среди преимуществ CAPPRESI заключается в том, что он может быть выполнен с использованием обычных лабораторных реагентов / инструментов ( например , ферментов, компетентных клеток, растворов и термоциклеров) и что он может давать быстрые результаты (при использовании соответствующих ферментов). Опираясь на ограничениеСайты ферментов, которые появляются из последовательностей ДНК синонимов, могут ограничить выбор точных точек слияния внутри интересующих белков. В таких случаях гены-мишени следует сливать с использованием перекрывающихся олигонуклеотидов, а сайты рестрикционных ферментов следует вставлять в ген устойчивости вектора. CAPRRESI состоит из семи простых шагов ( рис. 1 ): 1) выбор вектора клонирования pUC18 или pUC19 6 ; 2) в силиконовом анализе последовательностей дикого типа, подлежащих сплавлению; 3) выбор областей разломов для сборки химеры и разрушения плазмиды; 4) в силиконовой генерации синонимичных последовательностей ДНК, содержащих сайты рестрикционных ферментов; 5) независимое клонирование генов дикого типа в выбранную плазмиду; 6) нарушение плазмиды с помощью ПЦР с последующим расщеплением рестрикционным ферментом; И 7) восстановление плазмиды с использованием лигирования ДНК и бактериальной трансформации. Химерные гены, полученные этой методикой, должны быть проверены wС последовательностью. Векторы pUC18 / 19 предлагают технические преимущества для клонирования и сборки химеры, такие как малые размеры ( то есть, 2686 пар оснований), высокое количество копий, выгодные функции реакции секвенирования и коммерческая доступность 7 . Здесь хозяин Escherichia coli использовался для сборки и обработки химер, потому что бактериальные культуры дешевы и быстро растут. Учитывая это, потребуется последующее клонирование фрагментов слияния в конечные целевые плазмиды ( например, векторы экспрессии в виде pRK415 у бактерий или pCMV в клетках млекопитающих). CAPRRESI был протестирован на слияние двух первичных генов сигма-фактора: E. colirpoD и Rhizobium etlisigA . Первичные сигма-факторы являются субъединицами РНК-полимеразы, ответственными за инициирование транскрипции, и они состоят из четырех доменов ( т. Е. Σ1, σ2, σ3 и σ4) 8 . Длина аминокислотной последовательностиЧ белков, кодируемых rpoD и sigA, равны соответственно 613 и 685. RpoD и SigA имеют 48% идентичности (охват 98%). Эти первичные сигма-факторы были разделены на два дополнительных фрагмента между областями σ2 и σ3. В соответствии с этой схемой были собраны два химерных гена: химера 01 (RpoDσ1-σ2 + SigAσ3-σ4) и химера 02 (SigAσ1-σ2 + RpoDσ3-σ4). Продукты слияния ДНК были проверены путем секвенирования.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="756">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Platinum Taq DNA polymerase High Fidelity</td>
			<td style="width:71px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:115px;">11304011</td>
			<td style="width:355px;">Produces a mix of blunt/3&#8217;-A overhang ended PCR products</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">High pure plasmid isolation kit</td>
			<td style="width:71px;">Roche</td>
			<td style="width:115px;">11754785001</td>
			<td>Used for all plasmid purification reactions</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">High pure PCR product purification kit</td>
			<td style="width:71px;">Roche</td>
			<td style="width:115px;">11732676001</td>
			<td>Used for all PCR purification reactions from agarose gels</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">AflII restriction enzyme</td>
			<td style="width:71px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:115px;">R0520L</td>
			<td>Recognizes sequence 5&#8217;-CTTAAG-3&#8217; and cuts at 37 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">KpnI-HF restriction enzyme</td>
			<td style="width:71px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:115px;">R3142L</td>
			<td>Recognizes sequence 5&#8217;-GGTACC-3&#8217; and cuts at 37 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">SpeI-HF restriction enzyme</td>
			<td style="width:71px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:115px;">R3133L</td>
			<td>Recognizes sequence 5&#8217;-ACTAGT-3&#8217; and cuts at 37 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">XbaI restriction enzyme</td>
			<td style="width:71px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:115px;">R0145L</td>
			<td>Recognizes sequence 5&#8217;-TCTAGA-3&#8217; and cuts at 37 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Ampicillin sodium salt</td>
			<td style="width:71px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:115px;">A0166-5G</td>
			<td>Antibiotics</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Nalidixic acid</td>
			<td style="width:71px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:115px;">N8878-5G</td>
			<td>Antibiotics</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Yeast Extract</td>
			<td style="width:71px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:115px;">Y1625-1KG</td>
			<td>Bacterial cell culture</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Casein peptone</td>
			<td style="width:71px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:115px;">70171-500G</td>
			<td>Bacterial cell culture</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">NaCl</td>
			<td style="width:71px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:115px;">S9888-1KG</td>
			<td>Sodium chloride</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Agar</td>
			<td style="width:71px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:115px;">05040-1KG</td>
			<td>Bacterial cell culture</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">XbaI restriction enzyme</td>
			<td style="width:71px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:115px;">FD0684</td>
			<td>Fast digest XbaI enzyme</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">KpnI restriction enzyme</td>
			<td style="width:71px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:115px;">FD0524</td>
			<td>Fast digest KpnI enzyme</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Quick Ligation Kit</td>
			<td style="width:71px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:115px;">M2200S</td>
			<td>Fast DNA ligation kit</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">AflII restriction enzyme</td>
			<td style="width:71px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:115px;">FD0834</td>
			<td>Fast digest AflII enzyme</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">SpeI restriction enzyme</td>
			<td style="width:71px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:115px;">FD1253</td>
			<td>Fast digest SpeI enzyme</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

caprresi: chimera assembly by plasmid recovery and restriction enzyme site insertion

Здесь мы представляем сбор химеры путем восстановления плазмиды и введения сайта рестрикционного фермента (CAPRRESI). CAPRRESI извлекает выгоду из многих преимуществ исходного метода извлечения плазмиды и вводит переваривание рестрикционного фермента, чтобы облегчить реакции лигирования ДНК (необходимые для сборки химеры). Для этого протокола пользователи клонируют гены дикого типа в одну и ту же плазмиду (pUC18 или pUC19). После выбора силикона областей аминокислотной последовательности, в которых собираются химеры, пользователи получают все последовательности синонимов ДНК, которые их кодируют. Ad hoc Perl-скрипты позволяют пользователям определять все последовательности синонимов ДНК. После этого шага другой скрипт Perl ищет сайты рестрикционных ферментов на всех синонимичных последовательностях ДНК. Это в силиконовом анализе также выполняется с использованием гена устойчивости к ампициллину ( ampR ), обнаруженного на плазмидах pUC18 / 19. Пользователи разрабатывают олигонуклеотиды внутри регионов синонима, чтобы разрушить гены дикого типа и ampR с помощью ПЦР. После obtАфинирующих и очищающих комплементарных фрагментов ДНК, происходит переваривание рестрикционного фермента. Сбор химеры достигается путем лигирования соответствующих комплементарных фрагментов ДНК. Векторы pUC18 / 19 выбраны для CAPRRESI, поскольку они предлагают технические преимущества, такие как малый размер (2686 базовых пар), высокий номер копии, преимущества функции реакции последовательности и коммерческая доступность. Использование рестрикционных ферментов для сборки химеры устраняет необходимость в ДНК-полимеразах, дающих продукты с тупыми концами. CAPRRESI - это быстрый и недорогой метод слияния белок-кодирующих генов.

На рисунке 1 изображен CAPRRESI. Используя этот метод, два химерных гена были собраны путем обмена доменами двух бактериальных первичных сигма-факторов ( то есть E. coli RpoD и R. etli SigA). Последовательности ДНК генов rpoD и sigA были получены с использован?...

Watch this Scientific Journal Video about CAPRRESI: Chimera Assembly by Plasmid Recovery and Restriction Enzyme Site Insertion at JoVE.com

CAPRRESI: Chimera Assembly by Plasmid Recovery and Restriction Enzyme Site Insertion

Здесь мы представляем сбор химеры путем восстановления плазмиды и введения сайта рестрикционного фермента (CAPRRESI), протокола, основанного на введении сайтов рестрикционных ферментов в последовательности последовательностей синонимов и восстановления функциональной плазмиды. Этот протокол является быстрым и недорогим методом слияния белок-кодирующих генов.

CAPRRESI: сбор химеры путем вставки плазмиды и рестрикционной ферментации сайта

Here, we present chimera assembly by plasmid recovery and restriction enzyme site insertion (CAPRRESI). CAPRRESI benefits from many strengths of the ...

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Biology

Genetics

Biotechnology

SCIENTISTS IN ACTION

Principles of Site-Specific Recombinase (SSR) Technology

Principles of Site-Specific Recombinase SSR Technology

Принципы сайт-специфического рекомбиназы (SSR) Технология

Site-specific recombinase (SSR) technology allows the manipulation of gene structure to explore gene function and has become an integral tool of molecular ...

Assembly, Loading, and Alignment of an Analytical Ultracentrifuge Sample Cell

Ассамблея, Загрузка и согласование аналитической сотовый Пример ультрацентрифуге

The analytical ultracentrifuge (AUC) is a powerful biophysical tool that allows us to record macromolecular sedimentation profiles during high speed ...

Primary Culture and Plasmid Electroporation of the Murine Organ of Corti. 

Первичные культуры и плазмиды электропорации мышей органа Корти.

In all mammals, the sensory epithelium for audition is located along the spiraling organ of Corti that resides within the conch shaped cochlea of the ...

Production of Transgenic Xenopus laevis by Restriction Enzyme Mediated Integration and Nuclear Transplantation

Production of Transgenic Xenopus laevis by Restriction Enzyme Mediated Integration and Nuclear Transplantation

Получение трансгенных Xenopus laevis По рестрикции Интеграция опосредованного и ядерной трансплантации

Stable integration of cloned gene products into the Xenopus genome is necessary to control the time and place of expression, to express genes at later ...

Solid Plate-based Dietary Restriction in Caenorhabditis elegans

Solid Plate-based Dietary Restriction in Caenorhabditis elegans

Твердые пластины основе Диетические ограничения в Caenorhabditis Элеганс</em

Reduction of food intake without malnutrition or starvation is known to increase lifespan and delay the onset of various age-related diseases in a wide ...

High-throughput Yeast Plasmid Overexpression Screen

Высокая пропускная способность дрожжей плазмиды экрана Сверхэкспрессия

The budding yeast, Saccharomyces cerevisiae, is a powerful model system for defining fundamental mechanisms of many important cellular processes, ...

Monitoring Plasmid Replication in Live Mammalian Cells over Multiple Generations by Fluorescence Microscopy

Мониторинг репликации плазмиды в клетках млекопитающих Онлайн над несколькими поколениями с помощью флуоресцентной микроскопии

Few naturally-occurring plasmids are maintained in mammalian cells.  Among these are genomes of gamma-herpesviruses, including Epstein-Barr virus  (EBV) ...

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

В Vivo 4-мерном Tracking гемопоэтических стволовых и клеток-предшественников в взрослой мыши свода черепа костного мозга

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) ...

Generation of Plasmid Vectors Expressing FLAG-tagged Proteins Under the Regulation of Human Elongation Factor-1&#945; Promoter Using Gibson Assembly

Generation of Plasmid Vectors Expressing FLAG-tagged Proteins Under the Regulation of Human Elongation Factor-1ÃƒÅ½Ã‚Â± Promoter Using Gibson Assembly

Генерация плазмидных векторов выражая флага меченных белков соответствии с Положением удлинения Человеческий фактор-1α промотора, используя Gibson Ассамблею

Gibson assembly (GA) cloning offers a rapid, reliable, and flexible alternative to conventional DNA cloning methods. We used GA to create customized ...

Fecal Glucocorticoid Analysis: Non-invasive Adrenal Monitoring in Equids

Фекальные глюкокортикоиды Анализ: безоперационная Надпочечная Мониторинг в Equids

Adrenal activity can be assessed in the equine species by analysis of feces for corticosterone metabolites. During a potentially aversive situation, ...