Name: techniques to induce and quantify cellular senescence
Uploaded: 2017-05-01T11:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Techniques to Induce and Quantify Cellular Senescence at JoVE.com

Denne undersøgelse blev støttet af Intramural forskningsprogram af National Institutes of Health, National Institute on Aging. Forfatterne vil gerne takke Myriam Gorospe og Kotb Abdelmohsen for mange nyttige diskussioner om ældning og Kotb Abdelmohsen til også kritisk læsning af manuskriptet. Vi takker også vores laboratorium medlemmer, især Douglas Dluzen til kritisk læsning af manuskriptet.

1. Induktion Replikativ Ældning <ol><li> Optø lav passage humane diploide fibroblaster (fx WI-38 og IMR-90) eller andre cellelinjer. BEMÆRK: Her blev humane diploide fibroblaster anvendes, men disse protokoller kan anvendes til at vurdere senescens i andre celletyper, såsom endotheliale, epitheliale, eller mesenchymstamceller. Dyrkningsbetingelser kan optimeres til de forskellige celletyper, der anvendes på grund af forskellige vækstrater og vækstbetingelser. BEMÆRK: Cellerne skal være ...

Her har vi beskrevet fremgangsmåder til replikativ og DNA-ødelæggelse induceret aldring anvendelse af humane diploide fibroblaster. Desuden er teknikker til kvantificering protein og mRNA-niveauer af forskellige senescens-associerede proteiner indbefattet, samt farvning for SA-β-gal og for DNA-skade markør γ-H2AX. Disse protokoller kan i vid udstrækning anvendes til at vurdere aldrende fænotyper både in vitro og in vivo, selvom der findes mange advarsler til karakterisering senescens in vi...

Over et halvt århundrede siden, Hayflick og kolleger beskrev, hvordan ikke-transformerede celler formere i kultur, men kun i en begrænset periode 1. Langsigtet dyrkning af humane fibroblaster forårsaget cellerne til at stoppe prolifererende; men de var metabolisk aktiv, og dette blev kaldt cellesenescens. Senescens kan være gavnligt for inhibering tumorigenese, men det kan også være skadelig, da det menes at bidrage til tab af regenerationsevne der opstår med aldring 2, 3. Aldrende celler er blevet vist at akkumuleres i væv som mennesker alder 4 og har været impliceret i en række biologiske processer, herunder fosterudvikling, sårheling, vævsreparation, og aldersrelateret inflammation 2. Kontinuerlig passage af celler i kultur inducerer replikativ senescens, som er blevet forbundetat telomer nedslidning og genomisk ustabilitet. Forskellige celle-spændinger, herunder DNA-skade og onkogener, kan også forårsage ældning 3. Senescens forårsaget af andre end telomer nedslidning faktorer kaldes ofte stress-induceret eller for tidlig ældning og afhænger generelt af p16 INK4a / Rb pathway 5. Selvom prolifererende, utransformerede celler typisk forekommer spindlen i form, kan aldrende celler identificeres som havende visse karakteristika, herunder en flad, stor morfologi og øget senescens-associerede β-galactosidaseaktivitet (SA-β-gal) (figur 1 &amp; 2). Aldrende celler akkumulerer også DNA damage markører, herunder γ-H2AX (figur 3) 6, og potentielt senescens-associerede heterochromatin foci (SAHF) (figur 4) 7. Aldrende celler har højere niveauer af cellecyklusregulatorer, herunder p<html> 16 (p16 INK4a) og / eller p21 og p53 (figur 5) 8, 9. Endvidere har nylige data vist, at aldrende celler kan have ikke-selvstændige virkninger ved at udskille en række pro-inflammatoriske cytokiner og chemokiner kaldes senescens-associerede sekretorisk fænotype (SASP) 10. Selvom denne SASP fænomen kan variere fra celletype til celletype, i almindelighed påvises det ved en stigning i interleukin-6 (IL-6), IL-8, granulocyt-makrofag-kolonistimulerende faktor (GM-CSF), vækst- reguleret onkogen α (GRO-α), og GRO-β, blandt andre (figur 6). Den særlige stress eller skade, der inducerer senescens kan også påvirke den sekretoriske fænotype 11, 12, 13. SASP kan påvises ved måling af niveauerne af udskilte proteiner ved anvendelse ELISA&#39;er eller cytokin / proteinarrayss = &quot;xref&quot;&gt; 10, 14. Selvom posttranskriptionelle mekanismer kan regulere SASP proteinniveauer 11, 15, 16, 17, kan også detekteres ændringer i mRNA-niveauer i mange tilfælde. Disse ændringer er generelt mere følsomme og lettere at kvantificere end målinger proteinniveau. Andre aldrende markører kan også vurderes, herunder vedvarende DNA beskadigelse nuklear foci, kaldet DNA-segmenter med chromatin ændringer forstærkende senescens (DNA-SCARS) 18, og forskellige andre markører 3, 19, 20. Her beskriver vi almindelige teknikker til induktion senescens i celler i kultur og også til måling af flere markører for senescens, herunder SA-β-Gal, γ-H2AX, SAHF, og proteinet og mRNA af ældesnce-associerede molekyler.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>16% Tris-glycine gels</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td colspan="2">XP00160BOX</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acid-Phenol ChCl3</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM9720</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa-Fluor 568 goat anti-mouse antibody</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11031</td>
			<td>1:300 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell lifters</td>
			<td>Corning Inc.</td>
			<td>3008</td>
			<td>Cell scraper</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ECL anti-mouse HRP linked antibody</td>
			<td>Amersham</td>
			<td>NA931V</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ECL Plus Western Blotting Substrate</td>
			<td>Pierce</td>
			<td>32132</td>
			<td>ECL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Molecular Probes</td>
			<td>MP01306</td>
			<td>stock 5 mg/ml in dH2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GAPDH antibody</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>sc-32233</td>
			<td>1:1,000-5,000 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlycoBlue</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM9515</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Histone H3 dimethyl K9 monoclonal antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>1220</td>
			<td>1:500 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human IL-6 Quantikine ELISA assay</td>
			<td>R&#38;D systems</td>
			<td>D6050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human IL-8 Quantikine ELISA assay</td>
			<td>R&#38;D systems</td>
			<td>D8000C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human GROa Quantikine ELISA assay</td>
			<td>R&#38;D systems</td>
			<td>DRG00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-N-dimethylformamide&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D4551</td>
			<td>DMF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p16 monoclonal antibody</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>51-1325gr</td>
			<td>1:500 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p21 monoclonal antibody</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>05-345</td>
			<td>1:750 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p53 monoclonal antibody</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>sc-126</td>
			<td>1:500 dilution clone DO-1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>phospho-H2AX (Ser139) FITC conjugate antibody</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>9719</td>
			<td>1:2000 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>POWER SYBR-green PCR master mix&#160;</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>4367659</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pre-stained molecular weight markers</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>161-0374</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProLong Gold Antifade&#160;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>P36930</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PVDF membrane&#160;</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>88518</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Senescence b-Galactosidase Staining Kit</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>9860</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRIzol</td>
			<td>Ambion/Life Tech</td>
			<td>10296028</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

techniques to induce and quantify cellular senescence

Som reaktion på cellulær stress eller skade, kan prolifererende celler inducerer et specifikt program, der initierer en tilstand af langsigtet cellecyklus-standsning, betegnet cellulær aldring. Akkumulering af aldrende celler forekommer med organismal aldring og gennem løbende dyrkning in vitro. Aldrende celler påvirker mange biologiske processer, herunder fosterudvikling, vævsheling og regenerering, tumorsuppression, og aldring. Kendetegnende for aldrende celler indbefatter, men er ikke begrænset til, øget senescens-associerede β-galactosidaseaktivitet (SA-β-gal); p16 INK4a, p53, og p21-niveauer; højere niveauer af DNA-skade, herunder γ-H2AX; dannelsen af ​​Ældning-associeret heterochro Foci (SAHF); og erhvervelse af et Ældning-associeret Sekretorisk Fænotype (SASP), et fænomen karakteriseret ved udskillelse af en række pro-inflammatoriske cytokiner og signalmolekyler. Her beskriver vi protokoller for både replikativ ogDNA-beskadigelse-induceret senescens i dyrkede celler. Desuden fremhæver vi teknikker til at overvåge aldrende fænotype under anvendelse af adskillige senescens-associerede markører, herunder SA-β-gal, γ-H2AX og SAHF farvning, og at kvantificere protein og mRNA-niveauer af cellecyklusregulatorer og SASP faktorer. Disse fremgangsmåder kan anvendes til vurdering af senescens i forskellige modeller og væv.

Figurerne 2 - 6 viser repræsentative resultater fra SA-β-gal-farvning; farvning for γ-H2AX og SAHF; vurdering af proteinniveauer af p16 INK4a, p21, og p53; og mRNA og proteinniveauer af aldrende-associerede molekyler. Øget SA-β-gal-farvning sker med replikativ og DNA-beskadigelse-induceret aldring. Også observere de morfologiske ændringer, der sker med ældning. Cellerne bliver forstørret og flad i forhold til spindlen udseende prolifererende fibroblas...

Watch this Scientific Journal Video about Techniques to Induce and Quantify Cellular Senescence at JoVE.com

Techniques to Induce and Quantify Cellular Senescence

Cellulær aldring, den irreversible tilstand af celle-cyklus arrest, kan induceres ved forskellige cellulære spændinger. Her beskriver vi protokoller til at inducere cellulær aldring og metoder til vurdering markører for senescens.

Teknikker til at fremkalde og kvantificere cellesenescens

In response to cellular stress or damage, proliferating cells can induce a specific program that initiates a state of long-term cell-cycle arrest, termed ...

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Molecular Biology

Biology

Unit 2

Cell Proliferation

SCIENTISTS IN ACTION

BioMEMS and Cellular Biology: Perspectives and Applications

The ability to culture cells has revolutionized hypothesis testing in basic cell and molecular biology research. It has become a standard methodology in ...

Microinjection Techniques for Studying Mitosis in the Drosophila melanogaster Syncytial Embryo

Microinjection Techniques for Studying Mitosis in the Drosophila melanogaster Syncytial Embryo

This protocol describes the use of the Drosophila melanogaster syncytial embryo  for studying mitosis1.  Drosophila has useful genetics with a sequenced ...

Imaging Mismatch Repair and Cellular Responses to DNA Damage in Bacillus subtilis

Imaging Mismatch Repair and Cellular Responses to DNA Damage in Bacillus subtilis

Both prokaryotes and eukaryotes respond to DNA damage through a complex set of physiological changes. Alterations in gene expression, the redistribution ...

Aseptic Laboratory Techniques: Plating Methods

Microorganisms are present on all inanimate surfaces creating ubiquitous sources of possible contamination in the laboratory. Experimental success relies ...

RNAi Screening to Identify Postembryonic Phenotypes in C. elegans

RNAi Screening to Identify Postembryonic Phenotypes in C. elegans

RNAi screening for at identificere Postembryonic fænotyper i C. elegans</em

C. elegans has proven to be a valuable model system for the discovery and functional characterization of many genes and gene pathways1. More sophisticated ...

Telomere Length and Telomerase Activity; A Yin and Yang of Cell Senescence

Telomerlængde og telomerase-aktivitet, A Yin og Yang celleældning

Telomeres  are repeating DNA sequences at the tip ends of the chromosomes that are diverse  in length and in humans can reach a length of 15,000 base ...

Advanced Confocal Microscopy Techniques to Study Protein-protein Interactions and Kinetics at DNA Lesions

Avanceret Konfokal mikroskopi-teknikker til at undersøge Protein-protein interaktioner og kinetik ved DNA læsioner

Local microirradiation with lasers represents a useful tool for studies of DNA-repair-related processes in live cells. Here, we describe a methodological ...

Simple and Effective Administration and Visualization of Microparticles in the Circulatory System of Small Fishes Using Kidney Injection

Enkel og effektiv Administration og visualisering af mikropartikler i kredsløbet af små fisk ved hjælp af nyre injektion

The systemic administration of micro-size particles into a living organism can be applied for vasculature visualization, drug and vaccine delivery, ...

Nasal Potential Difference to Quantify Trans-epithelial Ion Transport in Mice

Nasal potentielle forskel at kvantificere Trans-epitelial Ion Transport i mus

The nasal potential difference test has been used for almost three decades to assist in the diagnosis of cystic fibrosis (CF). It has proven to be helpful ...

Applications of Spatio-temporal Mapping and Particle Analysis Techniques to Quantify Intracellular Ca2+ Signaling In Situ

Applications of Spatio-temporal Mapping and Particle Analysis Techniques to Quantify Intracellular Ca2+ Signaling In Situ

Anvendelser af Spatio-temporale kortlægning og partikel analyseteknikker til at kvantificere intracellulære Ca2 + signalering In Situ

Ca2+ imaging of isolated cells or specific types of cells within intact tissues often reveals complex patterns of Ca2+ signaling. This activity requires ...