Name: techniques to induce and quantify cellular senescence
Uploaded: 2017-05-01T11:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Techniques to Induce and Quantify Cellular Senescence at JoVE.com

Deze studie werd ondersteund door de Intramurale Research Program van de National Institutes of Health, National Institute on Aging. De auteurs willen Myriam Gorospe en Kotb Abdelmohsen bedanken voor de vele nuttige discussies over veroudering en Kotb Abdelmohsen voor ook het kritisch lezen van het manuscript. We danken ook ons ​​laboratorium leden, met name Douglas Dluzen voor het kritisch lezen van het manuscript.

1. inducerende Replicatieve Veroudering <ol><li> Dooi weinig overgezette humane diploïde fibroblasten (bijvoorbeeld, WI-38 en IMR-90) of andere cellijnen. OPMERKING: Hier humane diploïde fibroblasten werden gebruikt, maar deze protocollen kunnen worden gebruikt voor senescentie in andere celtypen, zoals endotheelcellen, epitheelcellen of mesenchymale stamcellen bepalen. Kweekomstandigheden kunnen worden geoptimaliseerd voor verschillende celtypen gebruikt vanwege verschillende groeisnelheden en groei...

Hier hebben wij werkwijzen beschreven voor replicatieve en DNA-schade geïnduceerde senescentie waarbij menselijke diploïde fibroblasten. Bovendien kunnen technieken voor het kwantificeren van eiwit en mRNA-niveaus van verschillende senescentie-geassocieerde eiwitten zijn opgenomen, alsmede kleuring voor SA-β-gal en de DNA-schade merker γ-H2AX. Deze protocollen kan wijd om verouderende fenotypen zowel in vitro als in vivo te evalueren, hoewel veel restricties aanwezig voor het karakteriseren senesce...

Meer dan een halve eeuw geleden, Hayflick en collega&#39;s beschreven hoe getransformeerde cellen vermeerderen in cultuur, maar slechts voor een beperkte periode 1. Lange-termijn kweken van menselijke fibroblasten veroorzaakt de cellen te stoppen uitdijende; echter, waren zij metabolisch actief, en dit werd cellulaire veroudering genoemd. Veroudering kan nuttig zijn voor het remmen van tumorigenese, maar het kan ook schadelijk zijn, aangezien het verondersteld bij te dragen aan het verlies van regeneratieve capaciteit die zich voordoet bij het ouder 2, 3. Verouderde cellen bleken te accumuleren in weefsels mens van 4 en zijn betrokken bij een aantal biologische processen, waaronder embryonale ontwikkeling, wondgenezing, weefselherstel, en leeftijdsgebonden ontsteking 2. Continue passage van de cellen in de cultuur induceert replicatieve veroudering, die is gekoppeldom het natuurlijk verloop en genomische instabiliteit telomeer. Diverse cel onderstreept waaronder DNA schade en oncogenen, kunnen ook senescentie 3 veroorzaken. Veroudering aan andere oorzaken dan telomeerattritie factoren vaak stress geïnduceerde of voortijdige senescentie en afhankelijk van de p16 INK4A / Rb pathway 5 algemeen. Hoewel prolifererende ongetransformeerde cellen verschijnen typisch spindel vorm, kan verouderde cellen worden geïdentificeerd als zijnde bepaalde kenmerken, waaronder een vlak, groot morfologie en verhoogde senescentie geassocieerde β-galactosidase-activiteit (SA-β-gal) (figuren 1 en 2). Verouderde cellen accumuleren ook DNA- beschadiging merkers, waaronder γ-H2AX (figuur 3) 6, en mogelijk senescentie-geassocieerde heterochromatine foci (SAHF) (figuur 4) 7. Verouderde cellen hogere niveaus van celcyclus regulatoren, zoals p<html> 16 (p16 INK4A) en / of p21 en p53 (Figuur 5) 8, 9. Bovendien hebben recente gegevens aangetoond dat verouderde cellen niet autonome effecten kunnen hebben door het afscheiden van een aantal pro-inflammatoire cytokines en chemokines genoemd senescentie-geassocieerde secretoir fenotype (SASP) 10. SASP hoewel dit verschijnsel kan van celtype tot celtype in het algemeen wordt aangetoond door een toename van Interleukine-6 ​​(IL-6), IL-8, granulocyt-macrofaag koloniestimulerende factor (GM-CSF), groei- gereguleerde α oncogen (GRO-α), en GRO-β, onder andere (figuur 6). De bijzondere stress of schade induceert senescentie kunnen ook invloed op de secretoire fenotype 11, 12, 13. SASP kan worden gedetecteerd door het meten van de niveaus van uitgescheiden eiwitten via ELISA of cytokine / eiwitarrayss = &quot;xref&quot;&gt; 10 14. Hoewel posttranscriptionele mechanismen SASP eiwitniveaus 11, kan reguleren 15, 16, 17, veranderingen in mRNA-niveaus kunnen worden gedetecteerd in vele gevallen. Deze veranderingen zijn over het algemeen gevoeliger en eenvoudiger te kwantificeren dan eiwitgehalte metingen. Andere verouderend merkers kunnen ook worden beoordeeld, waaronder blijvende DNA-beschadiging nucleaire foci, genoemd DNA-segmenten met chromatine wijzigingen versterkende veroudering (DNA-SCARS) 18, en verschillende andere markers 3, 19, 20. We beschrijven gebruikelijke technieken voor het induceren senescentie van cellen in kweek alsook voor het meten van verscheidene merkers van veroudering, met inbegrip SA-β-Gal, γ-H2AX, SAHF en het eiwit en mRNA van senescence-geassocieerde moleculen.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>16% Tris-glycine gels</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td colspan="2">XP00160BOX</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acid-Phenol ChCl3</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM9720</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa-Fluor 568 goat anti-mouse antibody</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11031</td>
			<td>1:300 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell lifters</td>
			<td>Corning Inc.</td>
			<td>3008</td>
			<td>Cell scraper</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ECL anti-mouse HRP linked antibody</td>
			<td>Amersham</td>
			<td>NA931V</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ECL Plus Western Blotting Substrate</td>
			<td>Pierce</td>
			<td>32132</td>
			<td>ECL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Molecular Probes</td>
			<td>MP01306</td>
			<td>stock 5 mg/ml in dH2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GAPDH antibody</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>sc-32233</td>
			<td>1:1,000-5,000 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlycoBlue</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM9515</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Histone H3 dimethyl K9 monoclonal antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>1220</td>
			<td>1:500 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human IL-6 Quantikine ELISA assay</td>
			<td>R&#38;D systems</td>
			<td>D6050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human IL-8 Quantikine ELISA assay</td>
			<td>R&#38;D systems</td>
			<td>D8000C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human GROa Quantikine ELISA assay</td>
			<td>R&#38;D systems</td>
			<td>DRG00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-N-dimethylformamide&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D4551</td>
			<td>DMF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p16 monoclonal antibody</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>51-1325gr</td>
			<td>1:500 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p21 monoclonal antibody</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>05-345</td>
			<td>1:750 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p53 monoclonal antibody</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>sc-126</td>
			<td>1:500 dilution clone DO-1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>phospho-H2AX (Ser139) FITC conjugate antibody</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>9719</td>
			<td>1:2000 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>POWER SYBR-green PCR master mix&#160;</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>4367659</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pre-stained molecular weight markers</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>161-0374</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProLong Gold Antifade&#160;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>P36930</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PVDF membrane&#160;</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>88518</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Senescence b-Galactosidase Staining Kit</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>9860</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRIzol</td>
			<td>Ambion/Life Tech</td>
			<td>10296028</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

techniques to induce and quantify cellular senescence

In reactie op cellulaire stress of beschadiging, kan woekerende cellen van een specifiek programma dat een toestand van langdurige celcyclus initieert, de zogenaamde cellulaire veroudering veroorzaken. Accumulatie van verouderde cellen optreedt met organismal veroudering en door voortdurende kweken in vitro. Verouderde cellen beïnvloeden vele biologische processen, waaronder embryonale ontwikkeling, weefselherstel en regeneratie, tumor onderdrukking, en veroudering. Kenmerken van verouderde cellen omvatten, maar zijn niet beperkt tot, verhoogde senescentie-geassocieerde β-galactosidase-activiteit (SA-β-gal); p16 INK4A, p53 en p21 niveaus; hogere niveaus van DNA schade, waaronder γ-H2AX; de vorming van senescentie-geassocieerde Heterochromatine Foci (SAHF); en het verwerven van een senescentie geassocieerde fenotype secreet (SASP), een verschijnsel gekenmerkt door de secretie van een aantal pro-inflammatoire cytokines en signaalmoleculen. Hier beschrijven we protocollen voor zowel replicatieve enDNA schade geïnduceerde senescentie in gekweekte cellen. Daarnaast hebben we aandacht technieken om de senescent fenotype monitoren met behulp van verschillende senescentie-geassocieerde markers, inclusief SA-β-gal, γ-H2AX en SAHF kleuring, en eiwit- en mRNA-niveaus van celcyclus regulatoren en SASP factoren kwantificeren. Deze werkwijzen kunnen worden toegepast voor de beoordeling van senescentie in diverse uitvoeringen en weefsels.

Figuren 2-6 tonen representatieve resultaten van SA-β-gal kleuring; kleuring op γ-H2AX en SAHF; beoordeling van eiwitniveaus van p16 INK4A, p21 en p53; en mRNA en eiwitniveaus van ouder wordende-geassocieerde moleculen. Verhoogde SA-β-gal kleuring optreedt met replicatieve en DNA-schade geïnduceerde senescentie. Let er ook op de morfologische veranderingen die optreden bij veroudering. Cellen worden vergroot en stabiel in vergelijking met de spil verschijn...

Watch this Scientific Journal Video about Techniques to Induce and Quantify Cellular Senescence at JoVE.com

Techniques to Induce and Quantify Cellular Senescence

Cellular veroudering, de onomkeerbare toestand van de celcyclus, kan worden geïnduceerd door verschillende cellulaire stress. Hier beschrijven we protocollen bij cellulaire veroudering en methoden ertoe te brengen markers van veroudering te beoordelen.

Technieken voor het induceren en te kwantificeren Cellulaire senescentie

In response to cellular stress or damage, proliferating cells can induce a specific program that initiates a state of long-term cell-cycle arrest, termed ...

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Molecular Biology

Biology

Unit 2

Cell Proliferation

SCIENTISTS IN ACTION

BioMEMS and Cellular Biology: Perspectives and Applications

BioMEMS en Cellulaire Biologie: perspectieven en toepassingen

The ability to culture cells has revolutionized hypothesis testing in basic cell and molecular biology research. It has become a standard methodology in ...

Microinjection Techniques for Studying Mitosis in the Drosophila melanogaster Syncytial Embryo

Microinjection Techniques for Studying Mitosis in the Drosophila melanogaster Syncytial Embryo

Micro-injectie technieken voor het bestuderen van mitose in de Drosophila melanogaster Syncytieel Embryo

This protocol describes the use of the Drosophila melanogaster syncytial embryo  for studying mitosis1.  Drosophila has useful genetics with a sequenced ...

Imaging Mismatch Repair and Cellular Responses to DNA Damage in Bacillus subtilis

Imaging Mismatch Repair and Cellular Responses to DNA Damage in Bacillus subtilis

Imaging mismatch repair en cellulaire reacties op DNA-schade in Bacillus subtilis</em

Both prokaryotes and eukaryotes respond to DNA damage through a complex set of physiological changes. Alterations in gene expression, the redistribution ...

Aseptic Laboratory Techniques: Plating Methods

Aseptische Laboratoriumtechniek: Plating Methoden

Microorganisms are present on all inanimate surfaces creating ubiquitous sources of possible contamination in the laboratory. Experimental success relies ...

RNAi Screening to Identify Postembryonic Phenotypes in C. elegans

RNAi Screening to Identify Postembryonic Phenotypes in C. elegans

RNAi screening Postembryonic fenotypes Leg in C. elegans</em

C. elegans has proven to be a valuable model system for the discovery and functional characterization of many genes and gene pathways1. More sophisticated ...

Telomere Length and Telomerase Activity; A Yin and Yang of Cell Senescence

Lengte van telomeren en telomerase activiteit; Een Yin en Yang van celsenescentie

Telomeres  are repeating DNA sequences at the tip ends of the chromosomes that are diverse  in length and in humans can reach a length of 15,000 base ...

Advanced Confocal Microscopy Techniques to Study Protein-protein Interactions and Kinetics at DNA Lesions

Geavanceerde confocale microscopie technieken om te studeren van eiwit-eiwitinteractie en kinetiek op DNA laesies

Local microirradiation with lasers represents a useful tool for studies of DNA-repair-related processes in live cells. Here, we describe a methodological ...

Simple and Effective Administration and Visualization of Microparticles in the Circulatory System of Small Fishes Using Kidney Injection

Eenvoudig en effectief beheer en visualisatie van deeltjes in de bloedsomloop van kleine vissen met behulp van nier injectie

The systemic administration of micro-size particles into a living organism can be applied for vasculature visualization, drug and vaccine delivery, ...

Nasal Potential Difference to Quantify Trans-epithelial Ion Transport in Mice

Nasale potentiaalverschil te kwantificeren Trans-epitheliale Ion vervoer in muizen

The nasal potential difference test has been used for almost three decades to assist in the diagnosis of cystic fibrosis (CF). It has proven to be helpful ...

Applications of Spatio-temporal Mapping and Particle Analysis Techniques to Quantify Intracellular Ca2+ Signaling In Situ

Applications of Spatio-temporal Mapping and Particle Analysis Techniques to Quantify Intracellular Ca2+ Signaling In Situ

Toepassingen van de Spatio-temporele Mapping en analysetechnieken deeltje te kwantificeren intracellulaire Ca2 + signalering In Situ

Ca2+ imaging of isolated cells or specific types of cells within intact tissues often reveals complex patterns of Ca2+ signaling. This activity requires ...