Name: techniques to induce and quantify cellular senescence
Uploaded: 2017-05-01T11:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Techniques to Induce and Quantify Cellular Senescence at JoVE.com

מחקר זה נתמך על ידי התכנית העירונית המחקר של המכון הלאומי לבריאות, המכון הלאומי להזדקנות. המחברים מבקשים להודות מרים Gorospe ו קוטב Abdelmohsen לדיונים רבים מועילים על הזדקנות ובין הקוטב Abdelmohsen עבור אנוש גם לקרוא את כתב היד. אנו מודים גם אנשי המעבדה שלנו, במיוחד דאגלס Dluzen עבור האנושות לקרוא את כתב היד.

הזדקנות 1. התרמה בשכפול הדנ&quot;א <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפיברובלסטים דיפלואידי אדם נמוך מעבר הפשרה (למשל, WI-38 ו- IMR-90) או שורות תאים אחרות. הערה: הנה, הפיברובלסטים דיפלואידי האדם שימשו, אבל פרוטוקולים אלה יכולים לשמש כדי להעריך הזדקנות ...

הנה, יש לנו תיאר שיטות להזדקנות המושרה-נזק לדנ&quot;א בשכפול הדנ&quot;א ושימוש פיברובלסטים דיפלואידי האנושי. בנוסף, טכניקות לכימות חלבון רמות ה- mRNA של חלבונים שונים הקשורים להזדקנות כלולים, כמו גם מכתים עבור SA-β-gal ועבור סמן DNA נזק γ-H2AX. ניתן פרוטוקולים אלה בשימוש נרחב כדי לה...

לפני יותר מחצי מאה, Hayflick ועמיתיו תארו כיצד untransformed תאים להתרבות בתרבות, אבל רק עבור תקופה מוגבלת של זמן 1. תרביות של פיברובלסטים אדם לטווח ארוכים גורמות לתאים להפסיק מתרבים; עם זאת, הם היו מבחינה מטבולית פעילה, וזה נקרא הזדקנות תאית. הזדקנות יכולה להיות מועילה עבור עיכוב היווצרות גידול, אבל זה גם יכול להזיק, כפי שהוא חשב לתרום אובדן יכולת התחדשות המתרחשת עם 2 הזדקנות, 3. שתאים מזדקנים הוכחו להצטבר ברקמות כבני אדם בגיל 4 ו היו מעורבים מספר תהליכים ביולוגיים, כולל ההתפתחות העוברית, לריפוי פצעים, תיקון רקמות, ודלקות הקשורות לגיל 2. passaging המתמשכת של תאים בתרבית המשרה הזדקנות בשכפול הדנ&quot;א, אשר נקשרהטלומרים התשה וחוסר יציבות גנומית. מדגיש תא שונים, לרבות נזק לדנ&quot;א אונקוגנים, יכול גם לגרום להזדקנות 3. הזדקנות נגרמת על ידי גורמים אחרים מלבד תשה הטלומרים נקראת לעתים מתח מושרה או הזדקנות מוקדמת וכן תלויה בדרך כלל על p16 INK4A / Rb המסלול 5. למרות מתרבה, תאי untransformed מופיעים בדרך כלל ציר בכושר, ניתן לזהות תאים מזדקנים כבעל מאפיינים מסוימים, כולל מורפולוגיה שטוחה, גדולה הקשורים להזדקנות מוגברת פעילות β-galactosidase (SA-β-gal) (איורי 1 &amp; 2). שתאים מזדקנים גם לצבור סמנים לנזק לדנ&quot;א, כולל γ-H2AX (איור 3) 6, ו, באופן פוטנציאלי, מוקדים heterochromatin הקשורים להזדקנות (SAHF) (איור 4) 7. יש שתאים מזדקנים רמות גבוהות יותר של רגולטורי מחזור התא, כולל p<html> 16 (P16 INK4A) ו / או p21 ו- p53 (איור 5) 8, 9. יתר על כן, הנתונים האחרונים הראו כי שתאים מזדקנים יכולות להיות השפעות בלתי אוטונומית על ידי הפרשת מספר פרו-דלקתיות ציטוקינים chemokines נקרא פנוטיפ הפרשה קשורה-הזדקנות (SASP) 10. למרות תופעת SASP עשויה להשתנות מן סוג תא לסוג תא, באופן כללי, זה בא לידי ביטוי בגידול Interleukin-6 (IL-6), IL-8, גורם מגרת מושבת מקרופאג-גרנולוציט (GM-CSF), צמיחה, α אונקוגן מוסדר (GRO-α), ו Gro-β, בין היתר (איור 6). לחץ מסוים או ניזק המשרה הזדקנות עשוי גם להשפיע על הפנוטיפ פרשת 11, 12, 13. SASP ניתן לאתר על ידי מדידת רמות של חלבונים המופרשים באמצעות ELISAs או ציטוקינים / מערכים חלבוןs = &quot;Xref&quot;&gt; 10, 14. למרות מנגנונים שלאחר תעתיק יכולים לווסת את רמות חלבון SASP 11, 15, 16, 17, שינויים ברמות mRNA יכול גם להתגלות במקרים רבים. שינויים אלה הם בדרך כלל יותר רגישים יותר קלים לכמת מ מדידות רמת חלבון. סמני ההזדקנות אחרים ניתן להעריך גם, כולל מוקדי הגרעין עיקש נזק לדנ&quot;א, קטעי DNA הנקרא עם שינויים הכרומטין חיזוק הזדקנות (DNA-צלקות) 18, וסמנים אחרים שונים 3, 19, 20. כאן, אנו מתארים שיטות נפוצות גרימת הזדקנות בתאים בתרבית וגם למדידת מספר סמנים של הזדקנות, כולל SA-β-גל, γ-H2AX, SAHF, ואת חלבון ה- mRNA של להזדקןNCE הקשורים מולקולות.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>16% Tris-glycine gels</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td colspan="2">XP00160BOX</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acid-Phenol ChCl3</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM9720</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa-Fluor 568 goat anti-mouse antibody</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11031</td>
			<td>1:300 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell lifters</td>
			<td>Corning Inc.</td>
			<td>3008</td>
			<td>Cell scraper</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ECL anti-mouse HRP linked antibody</td>
			<td>Amersham</td>
			<td>NA931V</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ECL Plus Western Blotting Substrate</td>
			<td>Pierce</td>
			<td>32132</td>
			<td>ECL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Molecular Probes</td>
			<td>MP01306</td>
			<td>stock 5 mg/ml in dH2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GAPDH antibody</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>sc-32233</td>
			<td>1:1,000-5,000 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlycoBlue</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM9515</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Histone H3 dimethyl K9 monoclonal antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>1220</td>
			<td>1:500 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human IL-6 Quantikine ELISA assay</td>
			<td>R&#38;D systems</td>
			<td>D6050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human IL-8 Quantikine ELISA assay</td>
			<td>R&#38;D systems</td>
			<td>D8000C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human GROa Quantikine ELISA assay</td>
			<td>R&#38;D systems</td>
			<td>DRG00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-N-dimethylformamide&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D4551</td>
			<td>DMF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p16 monoclonal antibody</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>51-1325gr</td>
			<td>1:500 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p21 monoclonal antibody</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>05-345</td>
			<td>1:750 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p53 monoclonal antibody</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>sc-126</td>
			<td>1:500 dilution clone DO-1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>phospho-H2AX (Ser139) FITC conjugate antibody</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>9719</td>
			<td>1:2000 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>POWER SYBR-green PCR master mix&#160;</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>4367659</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pre-stained molecular weight markers</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>161-0374</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProLong Gold Antifade&#160;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>P36930</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PVDF membrane&#160;</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>88518</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Senescence b-Galactosidase Staining Kit</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>9860</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRIzol</td>
			<td>Ambion/Life Tech</td>
			<td>10296028</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

techniques to induce and quantify cellular senescence

בתגובה ללחץ או נזק לתאים, תאי מתרבים יכול לגרום תוכנית ספציפית יוזם במצב של מעצר מחזור התא לטווח ארוך, כינה הזדקנות תאית. הצטברות של תאים מזדקנים מתרחשת עם והזדקנות האורגניזם ובאמצעות culturing המתמשך במבחנה. שתאים מזדקנים להשפיע על תהליכים ביולוגיים רבים, כולל התפתחות עוברית, תיקון רקמות התחדשות, דיכוי גידולים, והזדקנות. סימני היכר של תאים מזדקנים כוללים, אך אינם מוגבלים, פעילות β-galactosidase הזדקנות הקשורה מוגברת (SA-β-gal); רמות p16 INK4A, p53, ו p21; רמות גבוהות יותר של נזק לדנ&quot;א, כולל H2AX γ; היווצרות מוקדי heterochromatin הקשורים הזדקנות (SAHF); ורכישת פנוטיפ הפרשה הקשורים הזדקנות (SASP), תופעה המאופיינת על ידי הפרשת מספר ציטוקינים פרו-דלקתיים מולקולות איתות. כאן, אנו מתארים פרוטוקולים הוא בשכפול הדנ&quot;א ואתDNA נזק הנגרם הזדקנות תאים בתרבית. בנוסף, אנו מדגישים טכניקות כדי לפקח על הפנוטיפ senescent באמצעות מספר סמנים הקשורים להזדקנות, כולל SA-β-gal, γ-H2AX והכתים SAHF, ו לכמת רמות חלבון ה- mRNA של הרגולטורים מחזור התא וגורמים SASP. שיטות אלה ניתן להחיל את הערכה של הזדקנות במודלים ורקמות שונים.

<html> איורים 2 - 6 להראות תוצאות נציג מכתים SA-β-gal; מכתים עבור γ-H2AX ו SAHF; הערכת רמות החלבון p16 של INK4A, p21, ו- p53; ו mRNA ורמות חלבון של מולקולות senescent קשור. SA-β-gal מכתים מוגברת מתרחשת עם הזדקנות בשכפול הדנ&quot;א ואת DNA-induced נזק. כמו כן, לבחון את השינויים ה...

Watch this Scientific Journal Video about Techniques to Induce and Quantify Cellular Senescence at JoVE.com

Techniques to Induce and Quantify Cellular Senescence

הזדקנות תאית, המדינה ההפיכה של מעצר מחזור התא, יכולה להיגרם על ידי מדגיש הסלולר שונה. כאן, אנו מתארים פרוטוקולים לגרום הזדקנות תאית שיטות להערכת סמנים של הזדקנות.

טכניקות כדי להשרות ולכמת סלולר הזדקנות

In response to cellular stress or damage, proliferating cells can induce a specific program that initiates a state of long-term cell-cycle arrest, termed ...

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Molecular Biology

Biology

Unit 2

Cell Proliferation

SCIENTISTS IN ACTION

BioMEMS and Cellular Biology: Perspectives and Applications

BioMEMS וביולוגיה נייד: היבטים ויישומים

The ability to culture cells has revolutionized hypothesis testing in basic cell and molecular biology research. It has become a standard methodology in ...

Microinjection Techniques for Studying Mitosis in the Drosophila melanogaster Syncytial Embryo

Microinjection Techniques for Studying Mitosis in the Drosophila melanogaster Syncytial Embryo

Microinjection טכניקות לימוד מיטוזה ב תסיסנית melanogaster סינסיציאלי עובריים

This protocol describes the use of the Drosophila melanogaster syncytial embryo  for studying mitosis1.  Drosophila has useful genetics with a sequenced ...

Imaging Mismatch Repair and Cellular Responses to DNA Damage in Bacillus subtilis

Imaging Mismatch Repair and Cellular Responses to DNA Damage in Bacillus subtilis

הדמיה תיקון Mismatch ותגובות נייד נזק לדנ&quot;א Bacillus subtilis</em

Both prokaryotes and eukaryotes respond to DNA damage through a complex set of physiological changes. Alterations in gene expression, the redistribution ...

Aseptic Laboratory Techniques: Plating Methods

טכניקות מעבדה אספטיים: שיטות ציפוי

Microorganisms are present on all inanimate surfaces creating ubiquitous sources of possible contamination in the laboratory. Experimental success relies ...

RNAi Screening to Identify Postembryonic Phenotypes in C. elegans

RNAi Screening to Identify Postembryonic Phenotypes in C. elegans

RNAi הקרנת לזהות פנוטיפים Postembryonic ב ג elegans</em

C. elegans has proven to be a valuable model system for the discovery and functional characterization of many genes and gene pathways1. More sophisticated ...

Telomere Length and Telomerase Activity; A Yin and Yang of Cell Senescence

אורך הטלומרים ופעילות Telomerase; יין והיאנג של הזדקנות תא

Telomeres  are repeating DNA sequences at the tip ends of the chromosomes that are diverse  in length and in humans can reach a length of 15,000 base ...

Advanced Confocal Microscopy Techniques to Study Protein-protein Interactions and Kinetics at DNA Lesions

מיקרוסקופיה קונפוקלית טכניקות ללמוד אינטראקציות חלבון-חלבון וקינטיקה ב DNA נגעים מתקדמות

Local microirradiation with lasers represents a useful tool for studies of DNA-repair-related processes in live cells. Here, we describe a methodological ...

Simple and Effective Administration and Visualization of Microparticles in the Circulatory System of Small Fishes Using Kidney Injection

ניהול פשוטה ויעילה והדמיה של Microparticles במערכת הדם של דגים קטנים באמצעות הזרקת כליות

The systemic administration of micro-size particles into a living organism can be applied for vasculature visualization, drug and vaccine delivery, ...

Nasal Potential Difference to Quantify Trans-epithelial Ion Transport in Mice

האף הפרש הפוטנציאלים לכמת תחבורה טרנס-אפיתל יון בעכברים

The nasal potential difference test has been used for almost three decades to assist in the diagnosis of cystic fibrosis (CF). It has proven to be helpful ...

Applications of Spatio-temporal Mapping and Particle Analysis Techniques to Quantify Intracellular Ca2+ Signaling In Situ

Applications of Spatio-temporal Mapping and Particle Analysis Techniques to Quantify Intracellular Ca2+ Signaling In Situ

יישומים של מיפוי-עתיים, טכניקות ניתוח חלקיקים לכמת Ca תאיים2 + איתות בחיי עיר

Ca2+ imaging of isolated cells or specific types of cells within intact tissues often reveals complex patterns of Ca2+ signaling. This activity requires ...