Name: techniques to induce and quantify cellular senescence
Uploaded: 2017-05-01T11:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Techniques to Induce and Quantify Cellular Senescence at JoVE.com

Denne studien ble støttet av egenutført Research Program av National Institutes of Health, National Institute on Aging. Forfatterne ønsker å takke Myriam Gorospe og Kotb Abdelmohsen for mange nyttige diskusjoner om alderdom og Kotb Abdelmohsen for også kritisk lesing av manuskriptet. Vi takker også våre laboratorie medlemmer, spesielt Douglas Dluzen for kritisk lesing av manuskriptet.

1. Inducing replikativ Senescence <ol><li> Tine lav-passasje humane diploide fibroblaster (f.eks, WI-38 og IMR-90) eller andre cellelinjer. MERK: Her er humane diploide fibroblaster ble anvendt, men disse protokollene kan bli anvendt for å vurdere cellealdring på andre celletyper, slik som endotel, epitel, eller stamceller. Dyrkingsbetingelsene kan bli optimalisert for forskjellige celletyper som brukes på grunn av forskjellige vekstrater eller vekstbetingelser. MERK: Cellene må være prolif...

Her har vi beskrevet fremgangsmåter for replikativ og DNA-skade indusert cellealdring med humane diploide fibroblaster. I tillegg er teknikker for kvantifisering av protein og mRNA-nivåer av forskjellige aldrings-assosierte proteiner inkludert, i tillegg til farging for SA-β-gal og for DNA-skade markør γ-H2AX. Disse protokollene kan bli mye brukt til å vurdere senescent fenotyper både in vitro og in vivo, selv om mange begrensninger eksisterer for å karakterisere senescens in vivo <sup...

Over et halvt århundre siden, Hayflick og kolleger beskrev hvordan untransformed celler sprer i kultur, men for bare en begrenset periode 1. Langsiktig dyrking av humane fibroblaster forårsaket cellene for å stoppe voksende; men de var metabolsk aktiv, og dette ble kalt mobilnettet senescence. Senescens kan være fordelaktig for å hemme tumorgenese, men det kan også være skadelig, da det er antatt å bidra til tap av evne til reproduksjon som oppstår med aldring 2, 3. Senescent-celler er vist å akkumuleres i vev som mennesker alder 4 og har vært implisert i et utall biologiske prosesser, inkludert embryonisk utvikling, leging av sår, vevsreparasjon, og aldersrelatert inflammasjon 2. Kontinuerlig passering av celler i kultur induserer replikative senescens, som har vært knyttettil telomerer avgang og genomisk ustabilitet. Forskjellige cellespenninger, inkludert DNA-skade og onkogener, kan også føre til begynnende alderdom 3. Senescens forårsaket av andre enn telomere slitasjefaktorene er ofte kalt stress-fremkalt eller viser for tidlig senescens og avhenger generelt av p16 INK4A / Rb sti 5. Selv om formerende, ikke-transformerte celler vanligvis vises spindel i formen, kan aldrende celler bli identifisert som å ha visse egenskaper, herunder en flat, stort morfologi og øket begynnende alderdom-assosiert β-galaktosidase-aktivitet (SA-β-gal) (figurene 1 og 2). Aldrende celler også samle opp DNA-skade-markører, inkludert γ-H2AX (figur 3) til 6, og eventuelt begynnende alderdom-assosiert heterochromatin foci (SAHF) (figur 4) 7. Aldrende celler har høyere nivåer av cellesyklusregulerende midler, inkludert p-<html> 16 (p16 INK4A) og / eller p21 og p53 (figur 5) 8, 9. Dessuten har nyere data vist at aldrende celler kan ha ikke-autonome effekter ved å skille et antall av pro-inflammatoriske cytokiner og kjemokiner som kalles den begynnende alderdom-assosiert sekretorisk fenotype (SASP) 10. Selv om dette fenomen SASP kan variere fra celletype til celletype, generelt, er det vist ved en økning i Interleukin-6 (IL-6), IL-8, granulocytt-makrofag-kolonistimulerende faktor (GM-CSF), vekst- regulert onkogen α (GRO-α), og GRO-β, blant andre (figur 6). Den spesielle stress eller skade som induserer senescens kan også påvirke sekretorisk fenotype 11, 12, 13. SASP kan påvises ved å måle nivåene av utskilte proteiner ved anvendelse av ELISA-er eller cytokin / protein-arrayers = &quot;ekstern referanse&quot;&gt; 10, 14. Selv om post-transkripsjonelle mekanismer kan regulere SASP proteinnivåene 11, 15, 16, 17, endringer i mRNA-nivåer kan også bli detektert i mange tilfeller. Disse endringene er generelt mer sensitiv og lettere å kvantifisere protein enn nivåmålinger. Andre senescent markører kan også bli vurdert, inkludert vedvarende DNA-skade foci, som kalles DNA-segmenter med kromatin endringer armerings senescens (DNA-SCARS) 18, og forskjellige andre markører 3, 19, 20. Her beskriver vi vanlige teknikkene for indusering av cellealdring på celler i kultur, og også for å måle flere markører av senescens, inkludert SA-β-Gal, γ-H2AX, SAHF, og protein og mRNA fra senescence-assosierte molekyler.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>16% Tris-glycine gels</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td colspan="2">XP00160BOX</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acid-Phenol ChCl3</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM9720</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa-Fluor 568 goat anti-mouse antibody</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11031</td>
			<td>1:300 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell lifters</td>
			<td>Corning Inc.</td>
			<td>3008</td>
			<td>Cell scraper</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ECL anti-mouse HRP linked antibody</td>
			<td>Amersham</td>
			<td>NA931V</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ECL Plus Western Blotting Substrate</td>
			<td>Pierce</td>
			<td>32132</td>
			<td>ECL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Molecular Probes</td>
			<td>MP01306</td>
			<td>stock 5 mg/ml in dH2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GAPDH antibody</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>sc-32233</td>
			<td>1:1,000-5,000 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlycoBlue</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM9515</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Histone H3 dimethyl K9 monoclonal antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>1220</td>
			<td>1:500 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human IL-6 Quantikine ELISA assay</td>
			<td>R&#38;D systems</td>
			<td>D6050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human IL-8 Quantikine ELISA assay</td>
			<td>R&#38;D systems</td>
			<td>D8000C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human GROa Quantikine ELISA assay</td>
			<td>R&#38;D systems</td>
			<td>DRG00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-N-dimethylformamide&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D4551</td>
			<td>DMF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p16 monoclonal antibody</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>51-1325gr</td>
			<td>1:500 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p21 monoclonal antibody</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>05-345</td>
			<td>1:750 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p53 monoclonal antibody</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>sc-126</td>
			<td>1:500 dilution clone DO-1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>phospho-H2AX (Ser139) FITC conjugate antibody</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>9719</td>
			<td>1:2000 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>POWER SYBR-green PCR master mix&#160;</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>4367659</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pre-stained molecular weight markers</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>161-0374</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProLong Gold Antifade&#160;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>P36930</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PVDF membrane&#160;</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>88518</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Senescence b-Galactosidase Staining Kit</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>9860</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRIzol</td>
			<td>Ambion/Life Tech</td>
			<td>10296028</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

techniques to induce and quantify cellular senescence

Som svar på cellulært stress eller skade, kan prolifererende celler induserer et bestemt program som starter en tilstand av langvarig celle-syklus arrest, kalt mobilnettet senescence. Akkumulering av aldrende celler som oppstår med organisme aldring og gjennom kontinuerlig dyrking in vitro. Aldrende celler påvirke mange biologiske prosesser, inkludert embryonisk utvikling, vevsreparasjon og regenerering, som svulsthemmer, og aldring. Kjennetegnene ved senescent celler omfatter, men er ikke begrenset til, øket begynnende alderdom-assosiert β-galaktosidase-aktivitet (SA-β-gal); p16 INK4A, p53 og p21 nivåer; høyere nivåer av DNA-skade, inkludert γ-H2AX; dannelsen av Senescence-assosiert Heterokromatin Foci (SAHF); og anskaffelse av en Senescence-assosiert Sekretorisk Fenotype (SASP), et fenomen karakterisert ved sekresjon av et antall av pro-inflammatoriske cytokiner og signaliseringsmolekyler. Her beskriver vi protokollene for både replicative ogDNA-skade indusert cellealdring i dyrkede celler. I tillegg har vi fremheve teknikker for å overvåke senescent fenotypen ved hjelp av flere aldrings-assosierte markører, inkludert SA-β-gal, γ-H2AX og SAHF flekker, og for å kvantifisere protein og mRNA-nivåer av cellesyklus regulatorer og SASP faktorer. Disse metodene kan brukes til vurdering av cellealdring i ulike modeller og vev.

Figurene 2 - 6 viser representative resultater fra SA-β-gal-farging; farging for γ-H2AX og SAHF; Vurderingen av protein nivåer av p16 INK4A, p21 og p53; og mRNA og proteinnivåene av senescent-assosierte molekyler. Økt SA-β-gal-farving forekommer med replikativ og DNA-skade indusert cellealdring. Også observere de morfologiske endringene som skjer med begynnende alderdom. Celler blir forstørret og flat i forhold til spindelen utseende prolifererende fib...

Watch this Scientific Journal Video about Techniques to Induce and Quantify Cellular Senescence at JoVE.com

Techniques to Induce and Quantify Cellular Senescence

Cellular senescens, den irreversible tilstand av cellesyklus-stans, kan induseres ved hjelp av forskjellige cellespenninger. Her beskriver vi protokollene for å indusere celle alderdom og metoder for å vurdere markører for begynnende alderdom.

Teknikker for å indusere og kvantifisere Cellular Senescence

In response to cellular stress or damage, proliferating cells can induce a specific program that initiates a state of long-term cell-cycle arrest, termed ...

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Molecular Biology

Biology

Unit 2

Cell Proliferation

SCIENTISTS IN ACTION

BioMEMS and Cellular Biology: Perspectives and Applications

The ability to culture cells has revolutionized hypothesis testing in basic cell and molecular biology research. It has become a standard methodology in ...

Microinjection Techniques for Studying Mitosis in the Drosophila melanogaster Syncytial Embryo

Microinjection Techniques for Studying Mitosis in the Drosophila melanogaster Syncytial Embryo

This protocol describes the use of the Drosophila melanogaster syncytial embryo  for studying mitosis1.  Drosophila has useful genetics with a sequenced ...

Imaging Mismatch Repair and Cellular Responses to DNA Damage in Bacillus subtilis

Imaging Mismatch Repair and Cellular Responses to DNA Damage in Bacillus subtilis

Both prokaryotes and eukaryotes respond to DNA damage through a complex set of physiological changes. Alterations in gene expression, the redistribution ...

Aseptic Laboratory Techniques: Plating Methods

Microorganisms are present on all inanimate surfaces creating ubiquitous sources of possible contamination in the laboratory. Experimental success relies ...

RNAi Screening to Identify Postembryonic Phenotypes in C. elegans

RNAi Screening to Identify Postembryonic Phenotypes in C. elegans

RNAi Screening for å identifisere Postembryonic fenotyper i C. elegans</em

C. elegans has proven to be a valuable model system for the discovery and functional characterization of many genes and gene pathways1. More sophisticated ...

Telomere Length and Telomerase Activity; A Yin and Yang of Cell Senescence

Telomere Lengde og telomerase aktivitet; En Yin og Yang av Cell Senescence

Telomeres  are repeating DNA sequences at the tip ends of the chromosomes that are diverse  in length and in humans can reach a length of 15,000 base ...

Advanced Confocal Microscopy Techniques to Study Protein-protein Interactions and Kinetics at DNA Lesions

Avanserte AC Confocal mikroskopi teknikker for å studere Protein-protein interaksjoner og Kinetics på DNA lesjoner

Local microirradiation with lasers represents a useful tool for studies of DNA-repair-related processes in live cells. Here, we describe a methodological ...

Simple and Effective Administration and Visualization of Microparticles in the Circulatory System of Small Fishes Using Kidney Injection

Enkel og effektiv administrasjon og visualisering av Microparticles i sirkulasjonssystemet av små fisk med nyre injeksjon

The systemic administration of micro-size particles into a living organism can be applied for vasculature visualization, drug and vaccine delivery, ...

Nasal Potential Difference to Quantify Trans-epithelial Ion Transport in Mice

Nasal potensiell forskjell å kvantifisere Trans-epitelial Ion Transport i mus

The nasal potential difference test has been used for almost three decades to assist in the diagnosis of cystic fibrosis (CF). It has proven to be helpful ...

Applications of Spatio-temporal Mapping and Particle Analysis Techniques to Quantify Intracellular Ca2+ Signaling In Situ

Applications of Spatio-temporal Mapping and Particle Analysis Techniques to Quantify Intracellular Ca2+ Signaling In Situ

Programmer Spatio-temporale kartlegging og partikkel analyseteknikker for å kvantifisere intracellulær Ca2 + signalering i Situ

Ca2+ imaging of isolated cells or specific types of cells within intact tissues often reveals complex patterns of Ca2+ signaling. This activity requires ...