Name: techniques to induce and quantify cellular senescence
Uploaded: 2017-05-01T11:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Techniques to Induce and Quantify Cellular Senescence at JoVE.com

Este estudo foi apoiado pelo Programa de Pesquisa Intramural dos Institutos Nacionais de Saúde, Instituto Nacional sobre Envelhecimento. Os autores agradecem a Myriam Gorospe e Kotb Abdelmohsen para muitas discussões úteis sobre senescência e Kotb Abdelmohsen para também leitura crítica do manuscrito. Agradecemos também a nossos membros de laboratório, especialmente Douglas Dluzen pela leitura crítica do manuscrito.

1. Indução replicativa Senescence <ol><li> De baixa passagem fibroblastos diplóides humanos descongelamento (por exemplo, WI-38 e células IMR-90) ou outras linhas celulares. NOTA: Aqui, foram utilizados fibroblastos diplóides humanos, mas estes protocolos podem ser utilizados para avaliar a senescência em outros tipos de células, tais como endoteliais, epiteliais, ou células estaminais mesenquimais. As condições de cultura podem ser optimizados para os diferentes tipos celulares utilizadas de...

Aqui, nós descrevemos métodos para replicativa e a DNA-danos senesccia induzida utilizando fibroblastos diplóides humanos. Além disso, as técnicas para quantificar os níveis de mRNA de várias proteínas associadas com a senescência proteína e estão incluídos, bem como a coloração para SA-β-gal e para a ADN-danos marcador γ-H2AX. Estes protocolos podem ser amplamente utilizada para avaliar os fenótipos senescentes tanto in vitro como in vivo, embora existam muitas advertências para a ca...

Mais de meio século atrás, Hayflick e colegas descreveram como células não transformadas proliferar em cultura, mas apenas por um período limitado de tempo 1. cultura de longo prazo de fibroblastos humanos causado as células para parar a proliferar; no entanto, eles foram metabolicamente ativo, e este foi chamado senescência celular. Senescência pode ser benéfica para inibir tumorigênese, mas também pode ser prejudicial, como é pensado para contribuir para a perda de capacidade de regeneração que ocorre com o envelhecimento 2, 3. As células senescentes foram mostrados a acumular-se em tecidos como os seres humanos 4 anos de idade e têm sido implicadas num certo número de processos biológicos, incluindo o desenvolvimento embrionário, a cicatrização de feridas, reparação de tecidos, e inflamação relacionada com a idade 2. passagem contínua de células em cultura induz a senescência replicativa, que tem sido associadapara telômero atrito e instabilidade genômica. Várias tensões de células, incluindo danos no DNA e oncogenes, pode também causar a senescência 3. Senescência causada por outros que o atrito dos telómeros factores é muitas vezes chamado induzida pelo stress ou senescência prematura e geralmente depende da INK4A p16 / Rb via da 5. Embora a proliferação, as células não transformadas geralmente aparecem eixo em forma, as células senescentes pode ser identificado como tendo certas características, incluindo um, grande morfologia plana e aumento da actividade β-galactosidase associada à senescência (SA-β-gal) (Figuras 1 e 2). As células senescentes também acumular marcadores de dano de ADN, incluindo γ-H2AX (Figura 3) 6, e, potencialmente, associada à senescência heterocromatina focos (SAHF) (Figura 4) 7. As células senescentes tem níveis mais elevados de reguladores do ciclo celular, incluindo p<html> 16 (INK4A p16) e / ou p21 e p53 (Figura 5) 8, 9. Além disso, dados recentes têm mostrado que as células senescentes pode ter efeitos não autónomos através da secreção de uma série de citoquinas pró-inflamatórias e quimiocinas chamado o associada à senescência secretora fenótipo (SASP) 10. Embora este fenómeno SASP pode variar de tipo de célula para tipo de célula, em geral, é demonstrado por um aumento da interleucina-6 (IL-6), IL-8, factor de estimulação de colónias de granulócitos-macrófagos (GM-CSF), growth- α regulado oncogene (GRO-α), e GRO-β, entre outros (Figura 6). O esforço particular ou danos que induz senescência também pode influenciar o fenótipo secretor 11, 12, 13. SASP pode ser detectada através da medição dos níveis de proteínas segregadas utilizando ELISA ou matrizes de citoquinas / proteínass = &quot;xref&quot;&gt; 10, 14. Apesar de mecanismos de pós-transcricional pode regular os níveis de proteína SASP 11, 15, 16, 17, as alterações nos níveis de ARNm pode também ser detectada em muitos casos. Estas alterações são, geralmente, mais sensível e mais fácil de quantificar do que as medições de nível de proteína. Outros marcadores senescentes também pode ser avaliada, incluindo danos no DNA focos nuclear persistente, chamados segmentos de ADN com alterações na cromatina de reforço senescência (ADN-CICATRIZES) 18, e vários outros marcadores de 3, 19, 20. Aqui, nós descrevemos técnicas comuns para induzir a senescência em células em cultura e também para a medição de vários marcadores de senescência, incluindo SA-β-Gal, γ-H2AX, SAHF, e a proteína e ARNm de senescemoléculas dno-associado.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>16% Tris-glycine gels</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td colspan="2">XP00160BOX</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acid-Phenol ChCl3</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM9720</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa-Fluor 568 goat anti-mouse antibody</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11031</td>
			<td>1:300 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell lifters</td>
			<td>Corning Inc.</td>
			<td>3008</td>
			<td>Cell scraper</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ECL anti-mouse HRP linked antibody</td>
			<td>Amersham</td>
			<td>NA931V</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ECL Plus Western Blotting Substrate</td>
			<td>Pierce</td>
			<td>32132</td>
			<td>ECL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Molecular Probes</td>
			<td>MP01306</td>
			<td>stock 5 mg/ml in dH2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GAPDH antibody</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>sc-32233</td>
			<td>1:1,000-5,000 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlycoBlue</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM9515</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Histone H3 dimethyl K9 monoclonal antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>1220</td>
			<td>1:500 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human IL-6 Quantikine ELISA assay</td>
			<td>R&#38;D systems</td>
			<td>D6050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human IL-8 Quantikine ELISA assay</td>
			<td>R&#38;D systems</td>
			<td>D8000C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human GROa Quantikine ELISA assay</td>
			<td>R&#38;D systems</td>
			<td>DRG00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-N-dimethylformamide&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D4551</td>
			<td>DMF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p16 monoclonal antibody</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>51-1325gr</td>
			<td>1:500 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p21 monoclonal antibody</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>05-345</td>
			<td>1:750 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p53 monoclonal antibody</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>sc-126</td>
			<td>1:500 dilution clone DO-1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>phospho-H2AX (Ser139) FITC conjugate antibody</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>9719</td>
			<td>1:2000 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>POWER SYBR-green PCR master mix&#160;</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>4367659</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pre-stained molecular weight markers</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>161-0374</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProLong Gold Antifade&#160;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>P36930</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PVDF membrane&#160;</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>88518</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Senescence b-Galactosidase Staining Kit</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>9860</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRIzol</td>
			<td>Ambion/Life Tech</td>
			<td>10296028</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

techniques to induce and quantify cellular senescence

Em resposta ao stress celular ou dano, as células em proliferação podem induzir um programa específico que inicia um estado de paragem do ciclo celular a longo prazo, denominado senescência celular. A acumulação de células senescentes ocorre com o envelhecimento do organismo e por meio de cultura contínua in vitro. As células senescentes influenciam diversos processos biológicos, incluindo o desenvolvimento embrionário, reparação e regeneração de tecidos, supressão de tumores, e o envelhecimento. Características das células senescentes incluem, mas não estão limitados a, um aumento da actividade β-galactosidase associada à senescência (SA-β-gal); p16 ink4a, p53, e p21 níveis; níveis mais elevados de danos no ADN, incluindo γ-H2AX; a formação de senesccia associada Heterocromatina Focos (SAHF); e a aquisição de um associado com a senescência secretora Fenótipo (SASP), um fenómeno caracterizado pela secreção de um número de citocinas pró-inflamatórias e as moléculas de sinalização. Aqui, descrevemos os protocolos tanto para replicativo esenescência danificam o ADN induzida em células de cultura. Além disso, podemos destacar as técnicas de controlo do fenótipo senescente utilizando vários marcadores associada com a senescência, incluindo SA-β-gal, γ-H2AX e coloração SAHF, e para quantificar os níveis de proteína e ARNm de reguladores do ciclo celular e factores de SASP. Estes métodos podem ser aplicados para a avaliação da senescência em vários modelos e tecidos.

As Figuras 2-6 mostram resultados representativos de colorao SA-β-gal; coloração para γ-H2AX e SAHF; avaliação dos níveis de proteína de INK4A p16, p21, e p53; e o ARNm e os níveis proteicos de moléculas senescentes-associado. O aumento da coloração SA-β-gal ocorre com replicativo e ADN senesccia induzida por danos. Além disso, observe as alterações morfológicas que ocorrem com a senescência. As células tornam-se alargada e plana em relaçã...

Watch this Scientific Journal Video about Techniques to Induce and Quantify Cellular Senescence at JoVE.com

Techniques to Induce and Quantify Cellular Senescence

A senescência celular, o estado irreversível de paragem do ciclo celular, pode ser induzida por vários stresses celulares. Aqui, descrevemos os protocolos para induzir a senescência e métodos celular para avaliar marcadores de senescência.

Técnicas para induzir e quantificar a senescência celular

In response to cellular stress or damage, proliferating cells can induce a specific program that initiates a state of long-term cell-cycle arrest, termed ...

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Molecular Biology

Biology

Unit 2

Cell Proliferation

SCIENTISTS IN ACTION

BioMEMS and Cellular Biology: Perspectives and Applications

BioMEMS e Biologia Celular: Perspectivas e Aplicações

The ability to culture cells has revolutionized hypothesis testing in basic cell and molecular biology research. It has become a standard methodology in ...

Biologia

Microinjection Techniques for Studying Mitosis in the Drosophila melanogaster Syncytial Embryo

Microinjection Techniques for Studying Mitosis in the Drosophila melanogaster Syncytial Embryo

Técnicas de microinjeção para estudar na Mitose Drosophila melanogaster Embrião Sincicial

This protocol describes the use of the Drosophila melanogaster syncytial embryo  for studying mitosis1.  Drosophila has useful genetics with a sequenced ...

Imaging Mismatch Repair and Cellular Responses to DNA Damage in Bacillus subtilis

Imaging Mismatch Repair and Cellular Responses to DNA Damage in Bacillus subtilis

Mismatch Repair imagem e respostas celulares a danos no DNA em Bacillus subtilis</em

Both prokaryotes and eukaryotes respond to DNA damage through a complex set of physiological changes. Alterations in gene expression, the redistribution ...

Aseptic Laboratory Techniques: Plating Methods

Assépticas Técnicas de Laboratório: Métodos Plating

Microorganisms are present on all inanimate surfaces creating ubiquitous sources of possible contamination in the laboratory. Experimental success relies ...

RNAi Screening to Identify Postembryonic Phenotypes in C. elegans

RNAi Screening to Identify Postembryonic Phenotypes in C. elegans

RNAi de triagem para identificar fenótipos pós-embrionário em C. elegans</em

C. elegans has proven to be a valuable model system for the discovery and functional characterization of many genes and gene pathways1. More sophisticated ...

Telomere Length and Telomerase Activity; A Yin and Yang of Cell Senescence

Comprimento dos telômeros e da telomerase atividade; Um Yin e Yang da senescência celular

Telomeres  are repeating DNA sequences at the tip ends of the chromosomes that are diverse  in length and in humans can reach a length of 15,000 base ...

Advanced Confocal Microscopy Techniques to Study Protein-protein Interactions and Kinetics at DNA Lesions

Avançadas técnicas de microscopia Confocal para estudar interações da proteína-proteína e cinética de lesões do ADN

Local microirradiation with lasers represents a useful tool for studies of DNA-repair-related processes in live cells. Here, we describe a methodological ...

Simple and Effective Administration and Visualization of Microparticles in the Circulatory System of Small Fishes Using Kidney Injection

Administração simples e eficaz e visualização de micropartículas no sistema circulatório de peixes pequenos usando injeção de rim

The systemic administration of micro-size particles into a living organism can be applied for vasculature visualization, drug and vaccine delivery, ...

Nasal Potential Difference to Quantify Trans-epithelial Ion Transport in Mice

Diferença de potencial nasal para quantificar o transporte do íon Trans-epitelial em ratos

The nasal potential difference test has been used for almost three decades to assist in the diagnosis of cystic fibrosis (CF). It has proven to be helpful ...

Applications of Spatio-temporal Mapping and Particle Analysis Techniques to Quantify Intracellular Ca2+ Signaling In Situ

Applications of Spatio-temporal Mapping and Particle Analysis Techniques to Quantify Intracellular Ca2+ Signaling In Situ

Aplicações de mapeamento de espaço-temporal e técnicas de análise de partículas para quantificar intracelular Ca2 + sinalização em Situ

Ca2+ imaging of isolated cells or specific types of cells within intact tissues often reveals complex patterns of Ca2+ signaling. This activity requires ...