Name: techniques to induce and quantify cellular senescence
Uploaded: 2017-05-01T11:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Techniques to Induce and Quantify Cellular Senescence at JoVE.com

Это исследование было поддержано исследовательской программой Intramural Национальных институтов здравоохранения, Национальный институт по проблемам старения. Авторы хотели бы поблагодарить Мириам Горосп и Котб Абдельмохсен за полезные дискуссии о старении и Котб Абдельмохсна для также критически чтения рукописи. Мы также благодарим наших лабораторных членов, особенно Дуглас Длузен для критически чтении рукописи.

1. побуждающих Репликативного Старение <ol><li> Оттаивания низкого прохода фибробласты диплоидного человека (например, WI-38 и IMR-90) или другие клеточные линии. Примечание: В данном случае были использованы диплоидные фибробласты человека, но эти протоколы могут быть использованы д...

Здесь мы описали способы репликативной и ДНК-повреждений, вызванных старением с использованием диплоидных фибробластов человека. Кроме того, методы для количественного определения белка и уровни мРНК различных стареющих-ассоциированных белков включены, а также для окрашивания SA-бет...

Более полувека назад, Хейфлик и его коллеги описали , как нетрансформированный клетки пролиферируют в культуре, но только в течение ограниченного периода времени 1. Долгосрочное культивирование человеческих фибробластов вызвало клетку, чтобы остановить пролиферирующие; однако, они были метаболически активными, и это называлось клеточное старение. Старение может быть полезным для ингибирования онкогенеза, но она также может быть вредно, так как это , как полагают, способствуют потере регенерационной способности , что происходит со старением 2, 3. Стареющие клетки , как были показаны, накапливается в тканях , как люди возраст 4 и участвуют в ряде биологических процессов, в том числе эмбрионального развития, заживления ран, восстановления тканей, а также связанные с возрастом воспаления 2. Постоянные пассажи клеток в культуре индуцирует репликативное старение, который был связанна теломер истощение и нестабильность генома. Различные напряжения клеток, в том числе повреждения ДНК и онкогенов, могут также вызвать старение 3. Старение вызвано другими , чем теломер истощение факторов часто называют стрессом-индуцированным или преждевременным старением и , как правило , зависит от р16 Ink4a / Rb пути 5. Несмотря на то, пролиферирующих, нетрансформированные клетки обычно появляются шпиндель в форме, стареющие клетки могут быть идентифицированы как имеющие определенные характеристики, в том числе плоскую, большую морфологию и повышенную старении-ассоциированной β-галактозидазы (SA-β-гал) (фиг.1 и 2). Стареющие клетки также накапливаются маркеры повреждения ДНК, в том числе гамма-H2AX (рисунок 3) 6, и, потенциально, Старение-ассоциированные гетерохроматина очаги (SAHF) (Рисунок 4) 7. Стареющие клетки имеют более высокие уровни регуляторов клеточного цикла, в том числе р<html> 16 (р16 INK4A) и / или р21 и р53 (рисунок 5) 8, 9. Кроме того, недавние данные показали , что стареющие клетки могут иметь неавтономных эффекты, секретирующие ряд про-воспалительных цитокинов и хемокинов называется Старение-ассоциированный секреторной фенотип (SASP) 10. Хотя это явление SASP может варьироваться в зависимости от типа клеток типа клеток, в общем, это свидетельствует увеличение интерлейкина-6 (ИЛ-6), ИЛ-8, гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор (GM-CSF), growth- регулируемый онкогена α (GRO-α), а также GRO-β, среди других (рисунок 6). Частности , стресс или повреждение , которое вызывает старение может также влиять на секреторную фенотип 11, 12, 13. SASP может быть обнаружен путем измерения уровней секретируемых белков с помощью ELISA, или цитокина / белковых массивовs = &quot;Xref&quot;&gt; 10, 14. Хотя пост-транскрипционные механизмы могут регулировать уровни белка SASP 11, 15, 16, 17, изменения в уровне мРНК также могут быть обнаружены во многих случаях. Эти изменения, как правило, более чувствительны и проще, чем для количественного измерения уровня белка. Другие стареющие маркеры также могут быть оценены, включая стойкие повреждения ДНК ядерных очаги, называемые сегменты ДНК с хроматином изменениями армирующих старения (ДНК-Рубцы) 18, а также различных другими маркерами 3, 19, 20. Здесь мы опишем общие методы для индукции старении в клетках в культуре, а также для измерения нескольких маркеров старения, включая SA-бета-Gal, гамма-H2AX, SAHF, и белок и мРНК стареютсть-ассоциированных молекул.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>16% Tris-glycine gels</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td colspan="2">XP00160BOX</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acid-Phenol ChCl3</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM9720</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa-Fluor 568 goat anti-mouse antibody</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11031</td>
			<td>1:300 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell lifters</td>
			<td>Corning Inc.</td>
			<td>3008</td>
			<td>Cell scraper</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ECL anti-mouse HRP linked antibody</td>
			<td>Amersham</td>
			<td>NA931V</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ECL Plus Western Blotting Substrate</td>
			<td>Pierce</td>
			<td>32132</td>
			<td>ECL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Molecular Probes</td>
			<td>MP01306</td>
			<td>stock 5 mg/ml in dH2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GAPDH antibody</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>sc-32233</td>
			<td>1:1,000-5,000 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlycoBlue</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM9515</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Histone H3 dimethyl K9 monoclonal antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>1220</td>
			<td>1:500 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human IL-6 Quantikine ELISA assay</td>
			<td>R&#38;D systems</td>
			<td>D6050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human IL-8 Quantikine ELISA assay</td>
			<td>R&#38;D systems</td>
			<td>D8000C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human GROa Quantikine ELISA assay</td>
			<td>R&#38;D systems</td>
			<td>DRG00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-N-dimethylformamide&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D4551</td>
			<td>DMF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p16 monoclonal antibody</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>51-1325gr</td>
			<td>1:500 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p21 monoclonal antibody</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>05-345</td>
			<td>1:750 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p53 monoclonal antibody</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>sc-126</td>
			<td>1:500 dilution clone DO-1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>phospho-H2AX (Ser139) FITC conjugate antibody</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>9719</td>
			<td>1:2000 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>POWER SYBR-green PCR master mix&#160;</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>4367659</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pre-stained molecular weight markers</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>161-0374</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProLong Gold Antifade&#160;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>P36930</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PVDF membrane&#160;</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>88518</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Senescence b-Galactosidase Staining Kit</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>9860</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRIzol</td>
			<td>Ambion/Life Tech</td>
			<td>10296028</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

techniques to induce and quantify cellular senescence

В ответ на клеточный стресс или повреждения, пролиферирующие клетки могут вызвать определенную программу, которая инициирует состояние долгосрочной остановки клеточного цикла, называемую клеточным старение. Накопление стареющих клеток происходит с организменном старения и за счет непрерывного культивирования в пробирке. Стареющие клетки влияют на многие биологические процессы, в том числе эмбрионального развития, ремонта и регенерации тканей, подавление опухоли, и старение. Клейма стареющие клетки включают в себя, но не ограничиваются ими, увеличилась Старение-ассоциированные β-галактозидазы (SA-бета-гал); р16 Ink4a, p53, p21 и уровней; более высокие уровни повреждений ДНК, в том числе гамма-H2AX; формирование Старение-ассоциированного гетерохроматина очагах (SAHF); и приобретение старении-ассоциированной секреторного фенотипа (SASP), явление, характеризующееся секреции ряда провоспалительных цитокинов и сигнальных молекул. Здесь мы описываем протоколы для обоих репликативной иПовреждения ДНК-индуцированное старение в культивируемых клетках. Кроме того, мы выделим методу для мониторинга стареющего фенотипа с использованием несколько старения-ассоциированными маркеров, включая SA-бету-гала, гамма-H2AX и SAHF окрашивание и количественную оценку уровней белка и мРНК регуляторов клеточного цикла и SASP факторов. Эти методы могут быть применены к оценке старения в различных моделях и тканях.

На рисунках 2 - 6 показывают репрезентативные результаты от SA-β-гал окрашивания; окрашивания для гамма-H2AX и SAHF; оценка уровней белка р16, р21 Ink4a и р53; и мРНК и уровни белка стареющих-ассоциированных молекул. Увеличение SA-β-гал окрашивание происходит с реплик?...

Watch this Scientific Journal Video about Techniques to Induce and Quantify Cellular Senescence at JoVE.com

Techniques to Induce and Quantify Cellular Senescence

Клеточное старение, необратимое состояние остановки клеточного цикла, может быть вызвано различными клеточными напряжениями. Здесь мы описываем протоколы для индукции клеточного старения и методов оценки маркеров старения.

Методы индуцируют и Quantify Cellular Старение

In response to cellular stress or damage, proliferating cells can induce a specific program that initiates a state of long-term cell-cycle arrest, termed ...

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Molecular Biology

Biology

Unit 2

Cell Proliferation

SCIENTISTS IN ACTION

BioMEMS and Cellular Biology: Perspectives and Applications

BioMEMS и клеточной биологии: перспективы и приложения

The ability to culture cells has revolutionized hypothesis testing in basic cell and molecular biology research. It has become a standard methodology in ...

Microinjection Techniques for Studying Mitosis in the Drosophila melanogaster Syncytial Embryo

Microinjection Techniques for Studying Mitosis in the Drosophila melanogaster Syncytial Embryo

Микроинъекция методы для изучения митоза в Дрозофилы Синцитиальный эмбрионов

This protocol describes the use of the Drosophila melanogaster syncytial embryo  for studying mitosis1.  Drosophila has useful genetics with a sequenced ...

Imaging Mismatch Repair and Cellular Responses to DNA Damage in Bacillus subtilis

Imaging Mismatch Repair and Cellular Responses to DNA Damage in Bacillus subtilis

Несоответствие изображений Ремонт и клеточных реакций на повреждение ДНК в Сенная Bacillus</em

Both prokaryotes and eukaryotes respond to DNA damage through a complex set of physiological changes. Alterations in gene expression, the redistribution ...

Aseptic Laboratory Techniques: Plating Methods

Асептики лаборатории: Покрытие методы

Microorganisms are present on all inanimate surfaces creating ubiquitous sources of possible contamination in the laboratory. Experimental success relies ...

RNAi Screening to Identify Postembryonic Phenotypes in C. elegans

RNAi Screening to Identify Postembryonic Phenotypes in C. elegans

RNAi скрининга для выявления Постэмбриональное фенотипы в С. Элеганс</em

C. elegans has proven to be a valuable model system for the discovery and functional characterization of many genes and gene pathways1. More sophisticated ...

Telomere Length and Telomerase Activity; A Yin and Yang of Cell Senescence

Длиной теломер и теломеразы, Инь и Ян клеточного старения

Telomeres  are repeating DNA sequences at the tip ends of the chromosomes that are diverse  in length and in humans can reach a length of 15,000 base ...

Advanced Confocal Microscopy Techniques to Study Protein-protein Interactions and Kinetics at DNA Lesions

Передовые методы Confocal микроскопии для изучения кинетики в повреждения ДНК и белок белковых взаимодействий

Local microirradiation with lasers represents a useful tool for studies of DNA-repair-related processes in live cells. Here, we describe a methodological ...

Simple and Effective Administration and Visualization of Microparticles in the Circulatory System of Small Fishes Using Kidney Injection

Простое и эффективное управление и визуализация микрочастиц в системе кровообращения малых рыб с помощью инъекций почек

The systemic administration of micro-size particles into a living organism can be applied for vasculature visualization, drug and vaccine delivery, ...

Nasal Potential Difference to Quantify Trans-epithelial Ion Transport in Mice

Носовые разности потенциалов для количественного определения транс эпителиальных ионный транспорт в мышей

The nasal potential difference test has been used for almost three decades to assist in the diagnosis of cystic fibrosis (CF). It has proven to be helpful ...

Applications of Spatio-temporal Mapping and Particle Analysis Techniques to Quantify Intracellular Ca2+ Signaling In Situ

Applications of Spatio-temporal Mapping and Particle Analysis Techniques to Quantify Intracellular Ca2+ Signaling In Situ

Приложения пространственно временных карт и методы анализа частиц для количественного определения внутриклеточных Ca2 + сигнализации в Situ

Ca2+ imaging of isolated cells or specific types of cells within intact tissues often reveals complex patterns of Ca2+ signaling. This activity requires ...