Name: immunofluorescence analysis of stress granule formation after bacterial challenge of mammalian cells
Uploaded: 2017-07-03T13:00:00
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PS는 Bill and Melinda Gates 그랜드 챌린지 그랜트 OPP1141322의 수령자입니다. PV는 스위스 국립 과학 재단 Early Postdoc Mobility 펠로우쉽과 Roux-Cantarini 박사후 연구원의 후원으로 지원되었습니다. PJS는 HHMI 보조금 및 ERC-2013-ADG 339579-Decrypt에서 지원됩니다.

1. 박테리아 및 숙주 세포의 제조 <ol><li> 실험 조건 당 1 개의 우물을 세는 무균 핀셋으로 24 또는 12-well 플레이트에서 12 또는 14 mm 유리 커버 슬립을 각각 옮깁니다. 15 분 동안 조직 배양 후드에서 자외선 처리로 이들을 소독하십시오. 참고 : 외인성 스트레스에 의한 박테리아 감염 및 SG 유도에 대한 대조구를 포함하십시오. </li><li> 12mm coverslips가있는 24-well plate의 경우 coverslips에 1 x 10 5</sup...

<ol>
	<li>Reineke, L. C., Lloyd, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diversion+of+stress+granules+and+P-bodies+during+viral+infection.">Diversion of stress granules and P-bodies during viral infection.</a> Virology. 436 (2), 255-267 (2013).</li><li>Kedersha, N., Ivanov, P., Anderson, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stress+granules+and+cell+signaling:+more+than+just+a+passing+phase.">Stress granules and cell signaling: more than just a passing phase.</a> Trends Biochem Sci. 38 (10), 494-506 (2013).</li><li>Vonaesch, P., Campbell-Valois, F. -. X., Dufour, A., Sansonetti, P. J., Schnupf, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shigella+flexneri+modulates+stress+granule+composition+and+inhibits+stress+granule+aggregation.">Shigella flexneri modulates stress granule composition and inhibits stress granule aggregation.</a> Cell Microbiol. 18 (7), 982-997 (2016).</li><li>Kolobova, E., Efimov, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microtubule-dependent+association+of+AKAP350A+and+CCAR1+with+RNA+stress+granules.">Microtubule-dependent association of AKAP350A and CCAR1 with RNA stress granules.</a> Exp Cell Res. 315 (3), 542-555 (2009).</li><li>Anderson, P., Kedersha, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stress+granules:+the+Tao+of+RNA+triage.">Stress granules: the Tao of RNA triage.</a> Trends in biochemical sciences. 33 (3), 141-150 (2008).</li><li>Anderson, P., Kedersha, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stressful+initiations.">Stressful initiations.</a> J Cell Sci. 115, 3227-3234 (2002).</li><li>Mohr, I., Sonenberg, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Host+translation+at+the+nexus+of+infection+and+immunity.">Host translation at the nexus of infection and immunity.</a> Cell Host Microbe. 12 (4), 470-483 (2012).</li><li>Hu, S., Claud, E. C., Musch, M. W., Chang, E. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stress+granule+formation+mediates+the+inhibition+of+colonic+Hsp70+translation+by+interferon-+and+tumor+necrosis+factor.">Stress granule formation mediates the inhibition of colonic Hsp70 translation by interferon- and tumor necrosis factor.</a> Am J Physiol Gastointest Liver Physiol. 298 (4), 481-492 (2010).</li><li>Barry, E. M., Pasetti, M. F., Sztein, M. B., Fasano, A., Kotloff, K. L., Levine, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progress+and+pitfalls+in+Shigella+vaccine+research.">Progress and pitfalls in Shigella vaccine research.</a> Nat Rev Gastroenterol Hepatol. 10 (4), 245-255 (2013).</li><li>Lanata, C. F., Fischer-Walker, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+Causes+of+Diarrheal+Disease+Mortality+in+Children.">Global Causes of Diarrheal Disease Mortality in Children.</a> PloS One. 8 (9), 72788 (2013).</li><li>Ashida, H., Ogawa, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shigella+deploy+multiple+countermeasures+against+host+innate+immune+responses.">Shigella deploy multiple countermeasures against host innate immune responses.</a> Curr Opin Microbiol. 14 (1), 16-23 (2011).</li><li>Ashida, H., Ogawa, M., Mimuro, H., Kobayashi, T., Sanada, T., Sasakawa, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shigella+are+versatile+mucosal+pathogens+that+circumvent+the+host+innate+immune+system.">Shigella are versatile mucosal pathogens that circumvent the host innate immune system.</a> Curr Opin Immunol. 23 (4), 448-455 (2011).</li><li>Kedersha, N., Anderson, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mammalian+stress+granules+and+processing+bodies.">Mammalian stress granules and processing bodies.</a> Methods Enzymol. 431, 61-81 (2007).</li><li>Ray, K., Marteyn, B., Sansonetti, P. J., Tang, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Life+on+the+inside:+the+intracellular+lifestyle+of+cytosolic+bacteria.">Life on the inside: the intracellular lifestyle of cytosolic bacteria.</a> Nat Re. Micro. 7 (5), 333-340 (2009).</li></ol>

여기에 설명 된 프로토콜은 외인성 스트레스의 존재 또는 부재 하에서 cytosolic 병원체 S. flexneri 에 감염된 세포 및 감염되지 않은 세포에서 SG의 유도, 국소화 및 분석을 설명합니다. 자유 이미징 소프트웨어를 사용하여 프로토콜은 주어진 phenotypes의 차이를 식별하고 통계적으로 처리하기 위해 SG 형성에 대한 정확한 질적 및 양적 분석을 허용합니다. 감염, SG 유도 및 영...

세포 수준에서 숙주 - 병원체 상호 작용을 시각화하는 것은 병원성 전략에 대한 통찰력을 얻고 주요 세포 경로를 확인하는 강력한 방법입니다. 사실 병원균은 중요한 세포 표적이나 구조를 정확히 찾아내는 도구로 사용될 수 있습니다. 병원균은 생존이나 번식을위한 전략으로 중앙 세포 과정을 파괴하기 위해 진화했습니다. 형광 성분을 가진 숙주 단백질을 재조합 적으로 발현시킴으로써 세포 성분의 시각화를 달성 할 수 있습니다. 이것은 실시간 분석을 가능하게하지만, 특이 적으로 표지 된 숙주 단백질을 갖는 세포주의 생성은 매우 힘들고 바람직하지 않은 부작용을 초래할 수있다. 다중 항원 인자를 동시에 분석 할 수 있고 특정 세포 유형에만 국한되지 않기 때문에 특정 항체를 사용하여 세포 인자를 검출하는 것이 더 편리합니다. 단점은 immunofluorescence 분석은 숙주 세포 고정을 필요로하기 때문에 고정보기 만 캡처 할 수 있다는 것입니다이온. 그러나, immunofluorescence 이미징의 중요한 장점은 쉽게 질적 및 양적 분석 모두에 도움이된다는 것입니다. 이것은 차례로 호스트 - 병원체 상호 작용에 대한 새로운 통찰력을 제공하기 위해 통계적으로 중요한 차이를 얻는 데 사용될 수 있습니다. 형광 이미지 분석 프로그램은 3D 및 4D 분석을 수행하는 강력한 분석 도구입니다. 그러나 소프트웨어 및 유지 보수 비용이 높기 때문에 무료 오픈 소스 소프트웨어를 기반으로 한 방법이 더 널리 알려집니다. 생체 분석 소프트웨어를 사용하여 신중한 이미지 분석은 시각적 분석을 실체화하고 통계적 유의성을 부여 할 때 주어진 표현형의 정확성에 대한 신뢰도를 높이기 때문에 가치가 있습니다. 이전에는 SG가 무료 ImageJ 소프트웨어를 사용하여 분석되었으므로 개별 SG를 수동으로 식별해야했습니다 4 . 여기에 우리는 bac의 맥락에서 세포 SG 형성의 유도와 분석을위한 프로토콜을 제공한다.(http://icy.bioimageanalysis.org)를 사용하여 테리아 (terial) 감염을 예방할 수 있습니다. 바이오 이미지 분석 소프트웨어에는 SG 분석에 매우 적합한 스팟 디텍터 프로그램이 내장되어 있습니다. 지정된 관심 영역 (ROI)에서 자동화 된 탐지 프로세스를 미세 조정할 수 있습니다. 이는 개별 SG에 대한 수동 분석의 필요성을 극복하고 샘플링 편차를 제거합니다. 많은 환경 적 스트레스는 직경이 0.2 - 5 μm 인 상 고밀도 세포질, 비막 성 구조 인 SGs의 형성을 유도한다. 이 세포 반응은 효모, 식물 및 포유 동물에서 진화 적으로 보존되며 전 세계 단백질 번역이 금지 될 때 발생합니다. SG 로의 stalled translation initiation complex의 응집을 포함하며, SG는 translationally-inactive mRNA의 보유 장소로 간주되어 세포 mRNA의 일부를 선택적으로 번역 할 수있다.스트레스를 제거하면 SG가 분해되고 단백질 합성의 전체 속도가 재개됩니다. SG는 정확한 신랄한 구성이 적용되는 응력에 따라 달라질 수 있지만 번역 신생 개시 인자, RNA 대사에 관여하는 단백질, RNA 결합 단백질, 그리고 스 캐 폴딩 단백질 및 숙주 세포 신호 전달에 관련된 인자로 구성된다. SG 형성을 유도하는 환경 요인으로는 아미노산 결핍, 자외선 조사, 열 쇼크, 삼투압 쇼크, 소포체 세균 스트레스, 저산소증 및 바이러스 감염 2 , 7 , 8이있다 . 박테리아, 곰팡이 또는 원충 병원체와 같은 다른 병원체가이 세포 성 스트레스 반응에 어떻게 영향을 미치는지에 대해서는 아직 거의 알려지지 않았지만 바이러스가 유도하는 방법과 SG 형성을 파괴하는 방법에 대한 많은 진전이있었습니다. 시게lla flexneri는 사람의 그람 음성 음성 매개 성 세포질 병원체이며 심한 설사 또는 세균성 경화증의 원인균이다. 이질균증은 주요 공중 보건 부담이며 5 세, 9 세 이하의 어린이에서 매년 2 만 8 천명의 사망자를 발생시킵니다. S. flexneri 는 결장 상피를 감염시키고 숙주의 세포 골격 구성 요소 11 , 12 를 하이재킹하여 세포 대 세포를 퍼집니다. 상피의 감염은 세포질 내에서의 플레 서 네리 ( flexneri) 의 복제를지지하지만, 감염된 대식 세포는 열광 증 (pyroptosis)이라 불리는 염증 세포 사멸 과정을 통해 사망한다. 감염은 호중구와 열, 산화 스트레스 및 조직 파괴를 동반하는 심한 염증의 대규모 모집으로 이어집니다. 따라서, 감염된 세포는 골지사 파괴, 유전 독성 스트레스 및 세포 골격 재 배열과 같은 감염에 의해 유도 된 내부 스트레스를받는 반면감염된 세포는 또한 염증 과정으로 인해 환경 스트레스를받습니다. 다수의 SG 마커를 사용하여 환경 스트레스에 반응하는 세포의 능력에 대한 S. flexneri 감염의 특성화는 감염이 SG 조성 3의 질적 및 양적 차이를 유도한다는 것을 입증했다. 그러나 다른 박테리아 병원균에 대해서는 알려진 바가 거의 없습니다. 여기에서 우리는 cytosolic 병원체 S. flexneri , 다른 환경 스트레스와 세포의 스트레스, SG 구성 요소의 표시 및 감염의 맥락에서 SG 형성과 구성의 질적 및 정량 분석과 숙주 세포의 감염에 대한 방법론을 설명합니다 및 비 감염 세포. 이 방법은 다른 세균 병원균에 널리 적용 할 수 있습니다. 또한, SG 형성의 이미지 분석은 바이러스 또는 다른 병원균에 의한 감염에 사용될 수있다. SG를 분석하는 데 사용할 수 있습니다.감염시의 형성 또는 외인성 응력에 대한 SG 형성에 대한 감염의 효과.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1191">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:232px;">Primary Antibodies</td>
			<td style="width:211px;"></td>
			<td style="width:76px;"></td>
			<td style="width:672px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">eIF3b (N20), origin goat </td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>sc-16377</td>
			<td>Robust and widely used SG marker. Cytosolic staining allows cell delineation. Dilution 1 in 300</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">eIF3b (A20), origin goat </td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>sc-16378</td>
			<td>Same target as eIF3b (N20) and in our hands was identical to eIF3b (N20). Dilution 1 in 300</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">eIF3A (D51F4), origin rabbit (MC: monoclonal)</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>3411</td>
			<td>Part of multiprotein eIF3 complex with eIF3b . Dilution 1 in 800</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">eIF4AI, origin goat </td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>sc-14211</td>
			<td>Recommended by (Ref # 13). Dilution 1 in 200</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">eIF4B, origin rabbit</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab186856</td>
			<td>Good stress granule marker in our hands. Dilution 1 in 300</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">eIF4B, origin rabbit</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>3592</td>
			<td>Recommended by Ref # 13. Dilution 1 in 100</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">eIF4G, origin rabbit</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>sc-11373</td>
			<td>Widely used SG marker. (Ref # 13): may not work well in mouse cell lines. Dilution 1 in 300</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">G3BP1, origin rabbit (MC: monoclonal)</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>611126</td>
			<td>Widely used SG marker. Dilution 1 in 300</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tia-1, origin goat </td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>sc-1751</td>
			<td>Widely used SG marker. Can also be found in P bodies when SG are present (Ref # 13). Dilution 1 in 300</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td colspan="2" height="21" style="height:21px;">Alexa-conjugated Secondary Antibodies</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">A488 anti-goat , origin donkey</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>A-11055</td>
			<td>Cross absorbed. Dilution 1 in 500</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">A568 anti-goat, origin donkey</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>A-11057</td>
			<td>Cross absorbed. Dilution 1 in 500</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">A488 anti-mouse, origin donkey</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>A-21202</td>
			<td>Dilution 1 in 500</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">A568 anti-mouse, origin donkey</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>A10037</td>
			<td>Dilution 1 in 500</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">A647 anti-mouse, origin donkey</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>A31571</td>
			<td>Dilution 1 in 500</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">A488 anti-rabbit, origin donkey</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>A-21206</td>
			<td>Dilution 1 in 500</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">A568 anti-rabbit, origin donkey</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>A10042</td>
			<td>Dilution 1 in 500</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Other Reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Shigella flexneri</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Available from various laboratories by request</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tryptone Casein Soya (TCS) broth</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>211825</td>
			<td>Standard growth medium for Shigella, application - bacterial growth</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">TCS agar</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>236950</td>
			<td>Standard growth agar for Shigella, application - bacterial growth</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Congo red</td>
			<td>SERVA Electrophoresis GmbH</td>
			<td>27215.01</td>
			<td>Distrimination tool for Shigell that have lost the virulence plasmid, application - bacterial growth</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Poly L lysine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P1274</td>
			<td>Useful to coating bacteria to increase infection, application - infection</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Gentamicin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G1397</td>
			<td>Selective killing of extracellular but not cytosolic bacteria, application - infection</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">HEPES</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15630-056</td>
			<td>PH buffer useful when cells are incubated at room-temperature, application - cell culture</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DMEM</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>31885</td>
			<td>Standard culture medium for HeLa cells, application - cell culture</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fetal calf serum</td>
			<td>Biowest</td>
			<td>S1810-100</td>
			<td>5% supplementation used for HeLa cell culture medium, application - cell culture</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Non-essential amino acids</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11140</td>
			<td>1/100 dilution used for HeLa cell culture medium, application - cell culture</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DMSO</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D2650</td>
			<td>Reagent diluent, application - cell culture</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium arsenite</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S7400</td>
			<td>Potent stress granule inducer (Note: highly toxic, special handling and disposal required), application - stress inducer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Clotrimazole</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C6019</td>
			<td>Potent stress granule inducer (Note:health hazard, special handling and disposal required), application - stress inducer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PFA</td>
			<td>Electron Microscopy Scences</td>
			<td>15714</td>
			<td>4% PFA is used for standard fixation of cells, application - fixation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T8787</td>
			<td>Used at 0.03% for permeabilizationof host cells before immunofluorescent staining, application - permeabilization</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">A647-phalloidin</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>A22287</td>
			<td>Dilution is at 1/40, best added during 2ary antibody staining, application - staining</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DAPI</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D9542</td>
			<td>Nucleid acid stain used to visualize both the host nucleus and bacteria, application - staining</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Parafilm</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>BR701501</td>
			<td>Paraffin film useful for immunofluorescent staining of coverslips, application - staining</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Prolong Gold</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>36930</td>
			<td>Robust mounting medium that works well for most fluorophores , application - mounting</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Mowiol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>81381</td>
			<td>Cheap and robust mounting medium that works well for most fluorophores, application - mounting</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">24-well cell culture plate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>CLS3527</td>
			<td>Standard tissue culture plates, application - cell culture</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">12-mm glass coverslips</td>
			<td>NeuVitro</td>
			<td>1001/12</td>
			<td>Cell culture support for immunofluorescent applications, application - cell support</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">forceps</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>81381</td>
			<td>Cheap and obust mounting medium that works well for most fluorophores, application - mounting</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Programs and Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Prism</td>
			<td>GraphPad Software</td>
			<td></td>
			<td>Data analysisand graphing program with robust statistical test options, application - data analysis</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Leica SP5</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td></td>
			<td>Confocal microsope, application - image acquisition</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Imaris</td>
			<td>Bitplane</td>
			<td></td>
			<td>Professional image analysis program, application - data analysis</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Excel</td>
			<td>Microsoft</td>
			<td></td>
			<td>Data analysis and graphing program, application - data analysis</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

immunofluorescence analysis of stress granule formation after bacterial challenge of mammalian cells

세포 구성 요소의 형광 이미징은 숙주 - 병원체 상호 작용을 조사하는 효과적인 도구입니다. 병원균은 세포 소기관의 초 미세 구조, 세포 골격 네트워크 조직 및 스트레스 과립 (SG) 형성과 같은 세포 과정을 포함하여 감염된 세포의 다양한 특성에 영향을 줄 수 있습니다. 어떻게 병원균이 숙주 과정을 파괴하는지에 대한 특성 규명은 발병 기전의 중요하고 필수적인 부분이다. 다양한 표현형이 쉽게 볼 수 있지만, 병원균 공격에 의해 유발 된 세포 구조의 질적 및 양적 차이에 대한 정확한 분석은 실험 및 대조군 시료간에 통계적으로 중요한 차이를 정의하는 데 필수적입니다. SG 형성은 항 바이러스 반응을 유도하는 진화론 적으로 보전 된 스트레스 반응이며, 바이러스 감염을 이용하여 오랫동안 연구되어왔다. SG 형성은 또한 신호 계통에 영향을 미치고 다른 아직 알려지지 않은 conseq2 . 박테리아 병원균과 같은 바이러스 이외의 병원균에 대한 스트레스 반응의 특성화는 현재 연구의 새로운 영역 3 입니다. 현재 바이러스 성 시스템에서도 SG 형성에 대한 정량 분석과 정성 분석은 아직 일상적으로 사용되지 않고 있습니다. 여기서 우리는 다양한 외인성 응력에 대응하여 SGs의 형성에 영향을주는 세포 독성 세균 병원체에 감염된 세포 및 감염되지 않은 세포에서 SG 형성을 유도하고 특징 화하기위한 간단한 방법을 기술한다. SG 생성 및 구성 분석은 다양한 SG 마커와 오픈 소스 이미지 분석 도구 인 ICY의 스팟 디텍터 플러그인을 사용하여 이루어집니다.

이 원고에 설명 된 프로토콜을 설명하고 설명하기 위해 우리는 세포질 병원체 S. flexneri에 감염되었거나 감염되지 않은 HeLa 세포에서 clotrimazole 유도 된 SG의 이미지를 특징으로했습니다. 이 절차의 개요는 그림 1 에 나와 있으며 콩고 레드 플레이트에 박혀 있는 독성과 무해한 S. flexneri , 박테리아 준비, 감염, 환경 스트레스 추가, ?...

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Immunofluorescence Analysis of Stress Granule Formation After Bacterial Challenge of Mammalian Cells

우리는 세포가 박테리아와 여러 가지 스트레스에 도전을받은 후 포유류 세포에서 스트레스 과립 형성의 정성 및 정량 분석 ​​방법을 설명합니다. 이 프로토콜은 광범위한 호스트 - 박테리아 상호 작용에서 세포 스트레스 과립 반응을 조사하는 데 적용 할 수 있습니다.

포유류 세포의 박테리아 감염 후 스트레스 과립 형성의 면역 형광 분석

Fluorescent imaging of cellular components is an effective tool to investigate host-pathogen interactions. Pathogens can affect many different features of ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Invasion of Human Cells by a Bacterial Pathogen

세균성 병원체에 의해 인간의 세포의 침략

Here we will describe how we study the invasion of human endothelial cells by bacterial pathogen Staphylococcus aureus . The general protocol can be ...

연구

면역학 및 감염병학

In Vitro Assay of Bacterial Adhesion onto Mammalian Epithelial Cells

In Vitro Assay of Bacterial Adhesion onto Mammalian Epithelial Cells

포유류의 상피 세포에 박테리아의 접착 시험 관내 분석

To cause infections, bacteria must colonize their host. Bacterial pathogens express various molecules or structures able to promote attachment to host ...

Introducing Shear Stress in the Study of Bacterial Adhesion

세균성 접착 연구에 전단 응력을 소개합니다

During bacterial infections a sequence of interactions occur between the pathogen and its host. Bacterial adhesion to the host cell surface is often the ...

Following Cell-fate in E. coli After Infection by Phage Lambda

Following Cell-fate in E. coli After Infection by Phage Lambda

에 셀 운명을 따라<em&gt; E. 대장균</em&gt; 파지 람다에 의해 감염 후

The system comprising bacteriophage (phage) lambda and the bacterium E. coli has long served as a paradigm for cell-fate determination1,2. Following the ...

Assessing Somatic Hypermutation in Ramos B Cells after Overexpression or Knockdown of Specific Genes

특정 유전자의 Overexpression 또는 최저 후 라모스의 B 세포에서 체세포 Hypermutation을 평가

B cells start their life with low affinity antibodies generated by V(D)J recombination.  However, upon detecting a pathogen, the variable (V) region of an ...

Fluorescence Microscopy Methods for Determining the Viability of Bacteria in Association with Mammalian Cells

포유 동물 세포와 관련있는 박테리아의 생존을 확인하는 방법에 대한 형광 현미경 방법

Central to the field of bacterial pathogenesis is the ability to define if and how microbes survive after exposure to eukaryotic cells. Current protocols ...

Electroporation of Functional Bacterial Effectors into Mammalian Cells

포유 동물 세포에 기능 세균 이펙터의 전기

The study of protein interactions in the context of living cells can generate critical information about localization, dynamics, and interacting partners. ...

Generation and Multi-phenotypic High-content Screening of Coxiella burnetii Transposon Mutants

Generation and Multi-phenotypic High-content Screening of Coxiella burnetii Transposon Mutants

세대와의 멀티 표현형 높은 콘텐츠 상영<em&gt; Coxiella burnetii의</em&gt; 트랜스포존 돌연변이

Invasion and colonization of host cells by bacterial pathogens depend on the activity of a large number of prokaryotic proteins, defined as virulence ...

Methods to Inhibit Bacterial Pyomelanin Production and Determine the Corresponding Increase in Sensitivity to Oxidative Stress

방법은 세균 Pyomelanin 생산을 억제하고 산화 스트레스에 감도에 대응 증가를 확인하는 방법

Pyomelanin is an extracellular red-brown pigment produced by several bacterial and fungal species. This pigment is derived from the tyrosine catabolism ...

Implementation of a Permeable Membrane Insert-based Infection System to Study the Effects of Secreted Bacterial Toxins on Mammalian Host Cells

투과성 막 삽입 기반 감염 시스템의 구현은 포유 동물 숙주 세포에서 분비 세균 독소의 효과를 연구하기

Many bacterial pathogens secrete potent toxins to aid in the destruction of host tissue, to initiate signaling changes in host cells or to manipulate ...