Name: immunofluorescence analysis of stress granule formation after bacterial challenge of mammalian cells
Uploaded: 2017-07-03T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Immunofluorescence Analysis of Stress Granule Formation After Bacterial Challenge of Mammalian Cells at JoVE.com

PS является получателем гранта Гран-при Билла и Мелинды Гейтс OPP1141322. PV был поддержан стипендией Швейцарского национального научного фонда «Early postdoc Mobility» и постдокторской стипендией Ру-Кантарини. PJS поддерживается грантом HHMI и ERC-2013-ADG 339579-Decrypt.

1. Подготовка бактерий и клеток-хозяев <ol><li> Передача стеклянной крышки на 12 или 14 мм соскальзывает в 24-или 12-луночные планшеты, соответственно, стерильным пинцетом, считая одну лунку на экспериментальное состояние. Стерилизовать их путем УФ-обработки в капюшоне для тканевой культуры в...

<ol>
	<li>Reineke, L. C., Lloyd, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diversion+of+stress+granules+and+P-bodies+during+viral+infection.">Diversion of stress granules and P-bodies during viral infection.</a> Virology. 436 (2), 255-267 (2013).</li><li>Kedersha, N., Ivanov, P., Anderson, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stress+granules+and+cell+signaling:+more+than+just+a+passing+phase.">Stress granules and cell signaling: more than just a passing phase.</a> Trends Biochem Sci. 38 (10), 494-506 (2013).</li><li>Vonaesch, P., Campbell-Valois, F. -. X., Dufour, A., Sansonetti, P. J., Schnupf, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shigella+flexneri+modulates+stress+granule+composition+and+inhibits+stress+granule+aggregation.">Shigella flexneri modulates stress granule composition and inhibits stress granule aggregation.</a> Cell Microbiol. 18 (7), 982-997 (2016).</li><li>Kolobova, E., Efimov, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microtubule-dependent+association+of+AKAP350A+and+CCAR1+with+RNA+stress+granules.">Microtubule-dependent association of AKAP350A and CCAR1 with RNA stress granules.</a> Exp Cell Res. 315 (3), 542-555 (2009).</li><li>Anderson, P., Kedersha, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stress+granules:+the+Tao+of+RNA+triage.">Stress granules: the Tao of RNA triage.</a> Trends in biochemical sciences. 33 (3), 141-150 (2008).</li><li>Anderson, P., Kedersha, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stressful+initiations.">Stressful initiations.</a> J Cell Sci. 115, 3227-3234 (2002).</li><li>Mohr, I., Sonenberg, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Host+translation+at+the+nexus+of+infection+and+immunity.">Host translation at the nexus of infection and immunity.</a> Cell Host Microbe. 12 (4), 470-483 (2012).</li><li>Hu, S., Claud, E. C., Musch, M. W., Chang, E. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stress+granule+formation+mediates+the+inhibition+of+colonic+Hsp70+translation+by+interferon-+and+tumor+necrosis+factor.">Stress granule formation mediates the inhibition of colonic Hsp70 translation by interferon- and tumor necrosis factor.</a> Am J Physiol Gastointest Liver Physiol. 298 (4), 481-492 (2010).</li><li>Barry, E. M., Pasetti, M. F., Sztein, M. B., Fasano, A., Kotloff, K. L., Levine, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progress+and+pitfalls+in+Shigella+vaccine+research.">Progress and pitfalls in Shigella vaccine research.</a> Nat Rev Gastroenterol Hepatol. 10 (4), 245-255 (2013).</li><li>Lanata, C. F., Fischer-Walker, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+Causes+of+Diarrheal+Disease+Mortality+in+Children.">Global Causes of Diarrheal Disease Mortality in Children.</a> PloS One. 8 (9), 72788 (2013).</li><li>Ashida, H., Ogawa, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shigella+deploy+multiple+countermeasures+against+host+innate+immune+responses.">Shigella deploy multiple countermeasures against host innate immune responses.</a> Curr Opin Microbiol. 14 (1), 16-23 (2011).</li><li>Ashida, H., Ogawa, M., Mimuro, H., Kobayashi, T., Sanada, T., Sasakawa, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shigella+are+versatile+mucosal+pathogens+that+circumvent+the+host+innate+immune+system.">Shigella are versatile mucosal pathogens that circumvent the host innate immune system.</a> Curr Opin Immunol. 23 (4), 448-455 (2011).</li><li>Kedersha, N., Anderson, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mammalian+stress+granules+and+processing+bodies.">Mammalian stress granules and processing bodies.</a> Methods Enzymol. 431, 61-81 (2007).</li><li>Ray, K., Marteyn, B., Sansonetti, P. J., Tang, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Life+on+the+inside:+the+intracellular+lifestyle+of+cytosolic+bacteria.">Life on the inside: the intracellular lifestyle of cytosolic bacteria.</a> Nat Re. Micro. 7 (5), 333-340 (2009).</li></ol>

Описанный здесь протокол описывает индукцию, локализацию и анализ СГ в неинфицированных клетках и клетках, инфицированных цитозольным патогеном S. flexneri, в присутствии или отсутствии экзогенного стресса. Используя бесплатное программное обеспечение для обработки изображений, пр?...

Визуализация взаимодействия хозяин-патоген на клеточном уровне является мощным методом получения информации о патогенных стратегиях и идентификации ключевых клеточных путей. Действительно, патогены могут использоваться в качестве инструментов для определения важных клеточных целей или структур, поскольку патогены развились, чтобы разрушить центральные клеточные процессы как стратегию их собственного выживания или распространения. Визуализация клеточных компонентов может быть достигнута путем рекомбинантного экспрессии флуоресцентно-меченых белков-хозяев. Хотя это позволяет проводить анализ в реальном времени, генерация клеточных линий с специфически меченными протеинами хозяина очень трудоемка и может привести к нежелательным побочным эффектам. Более удобным является обнаружение клеточных факторов с использованием специфических антител, поскольку одновременно можно проанализировать несколько факторов хозяина, и один из них не ограничивается конкретным типом клеток. Недостатком является то, что только статический вид может быть захвачен, поскольку анализ иммунофлуоресценции требует фиксации клетки-хозяинаион. Однако важным преимуществом иммунофлюоресцентной визуализации является то, что она легко поддается количественному и качественному анализу. Это, в свою очередь, может быть использовано для получения статистически значимых различий, чтобы дать новое представление о взаимодействиях хозяина-патогена. Программы анализа флуоресцентного изображения являются мощными аналитическими инструментами для выполнения 3D и 4D-анализа. Однако высокая стоимость программного обеспечения и его обслуживание делают методы, основанные на бесплатном ПО с открытым исходным кодом, более привлекательными. Тщательный анализ изображений с использованием программного обеспечения для биоанализа ценен, поскольку он обосновывает визуальный анализ и при присвоении статистических значений повышает уверенность в правильности данного фенотипа. Ранее SGs анализировались с использованием бесплатного программного обеспечения ImageJ, что требует ручной идентификации отдельных SG 4 . Здесь мы предлагаем протокол для индукции и анализа клеточного SG-образования в контексте bacС использованием бесплатного программного обеспечения для анализа биоизображений с открытым исходным кодом ICY (http://icy.bioimageanalysis.org). Программное обеспечение для анализа биоизображения имеет встроенную программу обнаружения пятен, которая очень подходит для анализа SG. Он позволяет осуществлять точную настройку процесса автоматического обнаружения в определенных регионах интереса (ROI). Это устраняет необходимость в ручном анализе отдельных SG и устраняет смещение выборки. Многие экологические стрессы вызывают образование SG, которые представляют собой фазовые плотные цитозольные, непембранные структуры диаметром от 0,2 до 5 мкм в диаметре 5,6 . Этот клеточный ответ эволюционно сохраняется у дрожжей, растений и млекопитающих и возникает, когда глобальный перенос белка ингибируется. Он включает в себя агрегацию застопоренных комплексов инициации трансляции в SGs, которые считаются местами для трансляционно-неактивных мРНК, позволяя избирательный перевод подмножества клеточных мРНК.При удалении стресса растворы SGs и глобальные показатели синтеза белка возобновляются. SG состоят из факторов инициации трансляции элонгации, белков, участвующих в метаболизме РНК, РНК-связывающих белков, а также белков и факторов леса, участвующих в передаче сигналов хозяина 2 , хотя точная композиция может варьироваться в зависимости от применяемого напряжения. Факторы окружающей среды, которые индуцируют образование SG, включают в себя голодное голодание, ультрафиолетовое облучение, тепловой шок, осмотический шок, стресс эндоплазматического ретикулума, гипоксию и вирусную инфекцию 2 , 7 , 8 . Значительный прогресс был достигнут в понимании того, как вирусы индуцируют, а также разрушают образование SG, в то время как мало известно о том, как другие патогены, такие как бактериальные, грибковые или простейшие патогены, влияют на этот ответ на клеточный стресс 1 , 7 . ShigeLla flexneri - грамотрицательный факультативный цитозольный патоген человека и возбудитель тяжелой диареи или шигеллеза. Шигеллез является основным бременем общественного здравоохранения и ежегодно приводит к 28 000 смертей среди детей в возрасте до 5 лет 9 , 10 . S. flexneri заражает кишечный эпителий и распространяет клетку-клетку путем захвата цитоскелетных компонентов хозяина 11 , 12 . Инфекция эпителия поддерживает репликацию S. flexneri в цитозоле, но инфицированные макрофаги умирают в результате процесса воспаления клеточной смерти, называемого пироптозом. Инфекция приводит к массивному набору нейтрофилов и сильному воспалению, которое сопровождается теплом, окислительным стрессом и разрушением тканей. Таким образом, в то время как инфицированные клетки подвержены внутренним стрессам, вызванным инфекцией, такими как нарушение Гольджи, генотоксический стресс и перекрестная цитоскелетная перегруппировкаС, инфицированные клетки также подвергаются воздействию окружающей среды из-за воспалительного процесса. Характеристика влияния инфекции S. flexneri на способность клеток реагировать на стрессы окружающей среды с использованием ряда маркеров SG продемонстрировала, что инфекция приводит к качественным и количественным различиям в составе SG 3 . Однако мало известно о других бактериальных патогенах. Здесь мы опишем методологию заражения клеток-хозяев цитозольным патогеном S. flexneri , стресс клеток с различными воздействиями окружающей среды, маркировку компонентов SG и качественный и количественный анализ формирования и состава SG в контексте инфицированных И неинфицированные клетки. Этот метод широко применим к другим бактериальным патогенам. Кроме того, анализ изображений SG-образования может быть использован для инфицирования вирусами или другими патогенами. Он может использоваться для анализа SGОбразование при инфицировании или влияние инфекции на образование SG в ответ на экзогенные стрессы.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1191">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:232px;">Primary Antibodies</td>
			<td style="width:211px;"></td>
			<td style="width:76px;"></td>
			<td style="width:672px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">eIF3b (N20), origin goat </td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>sc-16377</td>
			<td>Robust and widely used SG marker. Cytosolic staining allows cell delineation. Dilution 1 in 300</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">eIF3b (A20), origin goat </td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>sc-16378</td>
			<td>Same target as eIF3b (N20) and in our hands was identical to eIF3b (N20). Dilution 1 in 300</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">eIF3A (D51F4), origin rabbit (MC: monoclonal)</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>3411</td>
			<td>Part of multiprotein eIF3 complex with eIF3b . Dilution 1 in 800</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">eIF4AI, origin goat </td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>sc-14211</td>
			<td>Recommended by (Ref # 13). Dilution 1 in 200</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">eIF4B, origin rabbit</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab186856</td>
			<td>Good stress granule marker in our hands. Dilution 1 in 300</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">eIF4B, origin rabbit</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>3592</td>
			<td>Recommended by Ref # 13. Dilution 1 in 100</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">eIF4G, origin rabbit</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>sc-11373</td>
			<td>Widely used SG marker. (Ref # 13): may not work well in mouse cell lines. Dilution 1 in 300</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">G3BP1, origin rabbit (MC: monoclonal)</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>611126</td>
			<td>Widely used SG marker. Dilution 1 in 300</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tia-1, origin goat </td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>sc-1751</td>
			<td>Widely used SG marker. Can also be found in P bodies when SG are present (Ref # 13). Dilution 1 in 300</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td colspan="2" height="21" style="height:21px;">Alexa-conjugated Secondary Antibodies</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">A488 anti-goat , origin donkey</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>A-11055</td>
			<td>Cross absorbed. Dilution 1 in 500</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">A568 anti-goat, origin donkey</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>A-11057</td>
			<td>Cross absorbed. Dilution 1 in 500</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">A488 anti-mouse, origin donkey</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>A-21202</td>
			<td>Dilution 1 in 500</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">A568 anti-mouse, origin donkey</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>A10037</td>
			<td>Dilution 1 in 500</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">A647 anti-mouse, origin donkey</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>A31571</td>
			<td>Dilution 1 in 500</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">A488 anti-rabbit, origin donkey</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>A-21206</td>
			<td>Dilution 1 in 500</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">A568 anti-rabbit, origin donkey</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>A10042</td>
			<td>Dilution 1 in 500</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Other Reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Shigella flexneri</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Available from various laboratories by request</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tryptone Casein Soya (TCS) broth</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>211825</td>
			<td>Standard growth medium for Shigella, application - bacterial growth</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">TCS agar</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>236950</td>
			<td>Standard growth agar for Shigella, application - bacterial growth</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Congo red</td>
			<td>SERVA Electrophoresis GmbH</td>
			<td>27215.01</td>
			<td>Distrimination tool for Shigell that have lost the virulence plasmid, application - bacterial growth</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Poly L lysine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P1274</td>
			<td>Useful to coating bacteria to increase infection, application - infection</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Gentamicin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G1397</td>
			<td>Selective killing of extracellular but not cytosolic bacteria, application - infection</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">HEPES</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15630-056</td>
			<td>PH buffer useful when cells are incubated at room-temperature, application - cell culture</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DMEM</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>31885</td>
			<td>Standard culture medium for HeLa cells, application - cell culture</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fetal calf serum</td>
			<td>Biowest</td>
			<td>S1810-100</td>
			<td>5% supplementation used for HeLa cell culture medium, application - cell culture</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Non-essential amino acids</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11140</td>
			<td>1/100 dilution used for HeLa cell culture medium, application - cell culture</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DMSO</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D2650</td>
			<td>Reagent diluent, application - cell culture</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium arsenite</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S7400</td>
			<td>Potent stress granule inducer (Note: highly toxic, special handling and disposal required), application - stress inducer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Clotrimazole</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C6019</td>
			<td>Potent stress granule inducer (Note:health hazard, special handling and disposal required), application - stress inducer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PFA</td>
			<td>Electron Microscopy Scences</td>
			<td>15714</td>
			<td>4% PFA is used for standard fixation of cells, application - fixation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T8787</td>
			<td>Used at 0.03% for permeabilizationof host cells before immunofluorescent staining, application - permeabilization</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">A647-phalloidin</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>A22287</td>
			<td>Dilution is at 1/40, best added during 2ary antibody staining, application - staining</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DAPI</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D9542</td>
			<td>Nucleid acid stain used to visualize both the host nucleus and bacteria, application - staining</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Parafilm</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>BR701501</td>
			<td>Paraffin film useful for immunofluorescent staining of coverslips, application - staining</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Prolong Gold</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>36930</td>
			<td>Robust mounting medium that works well for most fluorophores , application - mounting</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Mowiol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>81381</td>
			<td>Cheap and robust mounting medium that works well for most fluorophores, application - mounting</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">24-well cell culture plate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>CLS3527</td>
			<td>Standard tissue culture plates, application - cell culture</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">12-mm glass coverslips</td>
			<td>NeuVitro</td>
			<td>1001/12</td>
			<td>Cell culture support for immunofluorescent applications, application - cell support</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">forceps</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>81381</td>
			<td>Cheap and obust mounting medium that works well for most fluorophores, application - mounting</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Programs and Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Prism</td>
			<td>GraphPad Software</td>
			<td></td>
			<td>Data analysisand graphing program with robust statistical test options, application - data analysis</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Leica SP5</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td></td>
			<td>Confocal microsope, application - image acquisition</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Imaris</td>
			<td>Bitplane</td>
			<td></td>
			<td>Professional image analysis program, application - data analysis</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Excel</td>
			<td>Microsoft</td>
			<td></td>
			<td>Data analysis and graphing program, application - data analysis</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

immunofluorescence analysis of stress granule formation after bacterial challenge of mammalian cells

Флуоресцентная визуализация клеточных компонентов является эффективным инструментом для исследования взаимодействия хозяев-патогенов. Патогены могут влиять на многие различные особенности инфицированных клеток, включая ультраструктуру органелл, организацию цитоскелетной сети, а также клеточные процессы, такие как образование стресс-гранулы (SG). Характеристика того, как патогенные процессы разрушают хост-процессы, является важной и неотъемлемой частью поля патогенеза. Хотя переменные фенотипы могут быть легко видны, точный анализ качественных и количественных различий в клеточных структурах, вызванных проблемой патогенов, необходим для определения статистически значимых различий между экспериментальными и контрольными образцами. Образование SG является эволюционно консервативным стрессовым ответом, который приводит к антивирусным ответам и уже давно изучается с использованием вирусных инфекций 1 . SG также влияет на сигнальные каскады и может иметь другой, еще неизвестный консек2 . Характеристика этой реакции стресса на патогены, отличные от вирусов, такие как бактериальные патогены, в настоящее время является новой областью исследований 3 . На данный момент количественный и качественный анализ образования СГ еще не используется обычно даже в вирусных системах. Здесь мы опишем простой способ индуцирования и характеризации образования SG в неинфицированных клетках и в клетках, инфицированных цитозольным бактериальным возбудителем, который влияет на образование СГ в ответ на различные экзогенные стрессы. Анализ формирования и состава SG достигается с использованием ряда различных маркеров SG и плагина детектора детектирования ICY, инструмента анализа изображений с открытым исходным кодом.

Чтобы объяснить и продемонстрировать протокол, описанный в этой рукописи, мы охарактеризовали изображение индуцированных клотримазолом SGs в клетках HeLa, инфицированных или не имеющих цитозольного патогена S. flexneri . Схема схемы представлена ​​на рисун...

Watch this Scientific Journal Video about Immunofluorescence Analysis of Stress Granule Formation After Bacterial Challenge of Mammalian Cells at JoVE.com

Immunofluorescence Analysis of Stress Granule Formation After Bacterial Challenge of Mammalian Cells

Описывается метод качественного и количественного анализа образования гранулятов стенок в клетках млекопитающих после того, как клетки заражены бактериями и рядом различных стрессов. Этот протокол может быть применен для исследования реакции гранулы клеточного стресса в широком диапазоне хост-бактериальных взаимодействий.

Иммунофлуоресцентный анализ образования гранулята после бактериальной выделения клеток млекопитающих

Fluorescent imaging of cellular components is an effective tool to investigate host-pathogen interactions. Pathogens can affect many different features of ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Invasion of Human Cells by a Bacterial Pathogen

Вторжение клеток человека от бактериальных патогенов

Here we will describe how we study the invasion of human endothelial cells by bacterial pathogen Staphylococcus aureus . The general protocol can be ...

In Vitro Assay of Bacterial Adhesion onto Mammalian Epithelial Cells

In Vitro Assay of Bacterial Adhesion onto Mammalian Epithelial Cells

In Vitro Пробирной бактериальной адгезии на эпителиальных клетках млекопитающих

To cause infections, bacteria must colonize their host. Bacterial pathogens express various molecules or structures able to promote attachment to host ...

Introducing Shear Stress in the Study of Bacterial Adhesion

Представляем напряжения сдвига в изучении бактериальной адгезии

During bacterial infections a sequence of interactions occur between the pathogen and its host. Bacterial adhesion to the host cell surface is often the ...

Following Cell-fate in E. coli After Infection by Phage Lambda

Following Cell-fate in E. coli After Infection by Phage Lambda

После Cell-судьба<em&gt; E. палочки</em&gt; После заражения фагом лямбда

The system comprising bacteriophage (phage) lambda and the bacterium E. coli has long served as a paradigm for cell-fate determination1,2. Following the ...

Assessing Somatic Hypermutation in Ramos B Cells after Overexpression or Knockdown of Specific Genes

Оценка соматических Hypermutation в Рамос-клеток после Сверхэкспрессия или Нокдаун специфических генов

B cells start their life with low affinity antibodies generated by V(D)J recombination.  However, upon detecting a pathogen, the variable (V) region of an ...

Fluorescence Microscopy Methods for Determining the Viability of Bacteria in Association with Mammalian Cells

Флуоресцентной микроскопии Методы определения жизнеспособности бактерий в ассоциации с клетках млекопитающих

Central to the field of bacterial pathogenesis is the ability to define if and how microbes survive after exposure to eukaryotic cells. Current protocols ...

Electroporation of Functional Bacterial Effectors into Mammalian Cells

Электропорация функциональных бактериальных эффекторов в клетках млекопитающих

The study of protein interactions in the context of living cells can generate critical information about localization, dynamics, and interacting partners. ...

Generation and Multi-phenotypic High-content Screening of Coxiella burnetii Transposon Mutants

Generation and Multi-phenotypic High-content Screening of Coxiella burnetii Transposon Mutants

Генерация и нескольких фенотипическая Скрининг высокого содержания<em&gt; Coxiella burnetii</em&gt; транспозонов мутанты

Invasion and colonization of host cells by bacterial pathogens depend on the activity of a large number of prokaryotic proteins, defined as virulence ...

Methods to Inhibit Bacterial Pyomelanin Production and Determine the Corresponding Increase in Sensitivity to Oxidative Stress

Методы подавления бактериального Pyomelanin Производство и определить соответствующую увеличению чувствительности к окислительному стрессу

Pyomelanin is an extracellular red-brown pigment produced by several bacterial and fungal species. This pigment is derived from the tyrosine catabolism ...

Implementation of a Permeable Membrane Insert-based Infection System to Study the Effects of Secreted Bacterial Toxins on Mammalian Host Cells

Внедрение системы инфекционного проницаемой мембраны Вставка на основе для изучения влияния секретируемых бактериальными токсинами на млекопитающих клеток-хозяев

Many bacterial pathogens secrete potent toxins to aid in the destruction of host tissue, to initiate signaling changes in host cells or to manipulate ...