Name: immunofluorescence analysis of stress granule formation after bacterial challenge of mammalian cells
Uploaded: 2017-07-03T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Immunofluorescence Analysis of Stress Granule Formation After Bacterial Challenge of Mammalian Cells at JoVE.com

PS är mottagare av Bill och Melinda Gates Grand Challenge Grant OPP1141322. PV stöddes av ett schweiziskt National Science Foundation Early Postdoc Mobility fellesskap och ett Roux-Cantarini postdoktoralt gemenskap. PJS stöds av ett HHMI-bidrag och ERC-2013-ADG 339579-Decrypt.

1. Framställning av bakterier och värdceller <ol><li> Överför 12 eller 14 mm glasskyddsplattor i respektive 24- eller 12-brunnsplattor, med sterila pincett, räkna en brunn per experimentellt tillstånd. Sterilisera dessa genom UV-behandling i en vävnadskulturhuvud i 15 minuter. OBS: Inkludera kontrollbrunnar för bakteriell utmaning och för SG-induktion genom exogena spänningar. </li><li> För en 24-brunnsplatta med 12 mm täckglas, frö 1 x 10 5 däggdjursceller ( t.ex. HeLa-celler)...

<ol>
	<li>Reineke, L. C., Lloyd, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diversion+of+stress+granules+and+P-bodies+during+viral+infection.">Diversion of stress granules and P-bodies during viral infection.</a> Virology. 436 (2), 255-267 (2013).</li><li>Kedersha, N., Ivanov, P., Anderson, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stress+granules+and+cell+signaling:+more+than+just+a+passing+phase.">Stress granules and cell signaling: more than just a passing phase.</a> Trends Biochem Sci. 38 (10), 494-506 (2013).</li><li>Vonaesch, P., Campbell-Valois, F. -. X., Dufour, A., Sansonetti, P. J., Schnupf, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shigella+flexneri+modulates+stress+granule+composition+and+inhibits+stress+granule+aggregation.">Shigella flexneri modulates stress granule composition and inhibits stress granule aggregation.</a> Cell Microbiol. 18 (7), 982-997 (2016).</li><li>Kolobova, E., Efimov, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microtubule-dependent+association+of+AKAP350A+and+CCAR1+with+RNA+stress+granules.">Microtubule-dependent association of AKAP350A and CCAR1 with RNA stress granules.</a> Exp Cell Res. 315 (3), 542-555 (2009).</li><li>Anderson, P., Kedersha, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stress+granules:+the+Tao+of+RNA+triage.">Stress granules: the Tao of RNA triage.</a> Trends in biochemical sciences. 33 (3), 141-150 (2008).</li><li>Anderson, P., Kedersha, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stressful+initiations.">Stressful initiations.</a> J Cell Sci. 115, 3227-3234 (2002).</li><li>Mohr, I., Sonenberg, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Host+translation+at+the+nexus+of+infection+and+immunity.">Host translation at the nexus of infection and immunity.</a> Cell Host Microbe. 12 (4), 470-483 (2012).</li><li>Hu, S., Claud, E. C., Musch, M. W., Chang, E. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stress+granule+formation+mediates+the+inhibition+of+colonic+Hsp70+translation+by+interferon-+and+tumor+necrosis+factor.">Stress granule formation mediates the inhibition of colonic Hsp70 translation by interferon- and tumor necrosis factor.</a> Am J Physiol Gastointest Liver Physiol. 298 (4), 481-492 (2010).</li><li>Barry, E. M., Pasetti, M. F., Sztein, M. B., Fasano, A., Kotloff, K. L., Levine, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progress+and+pitfalls+in+Shigella+vaccine+research.">Progress and pitfalls in Shigella vaccine research.</a> Nat Rev Gastroenterol Hepatol. 10 (4), 245-255 (2013).</li><li>Lanata, C. F., Fischer-Walker, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+Causes+of+Diarrheal+Disease+Mortality+in+Children.">Global Causes of Diarrheal Disease Mortality in Children.</a> PloS One. 8 (9), 72788 (2013).</li><li>Ashida, H., Ogawa, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shigella+deploy+multiple+countermeasures+against+host+innate+immune+responses.">Shigella deploy multiple countermeasures against host innate immune responses.</a> Curr Opin Microbiol. 14 (1), 16-23 (2011).</li><li>Ashida, H., Ogawa, M., Mimuro, H., Kobayashi, T., Sanada, T., Sasakawa, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shigella+are+versatile+mucosal+pathogens+that+circumvent+the+host+innate+immune+system.">Shigella are versatile mucosal pathogens that circumvent the host innate immune system.</a> Curr Opin Immunol. 23 (4), 448-455 (2011).</li><li>Kedersha, N., Anderson, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mammalian+stress+granules+and+processing+bodies.">Mammalian stress granules and processing bodies.</a> Methods Enzymol. 431, 61-81 (2007).</li><li>Ray, K., Marteyn, B., Sansonetti, P. J., Tang, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Life+on+the+inside:+the+intracellular+lifestyle+of+cytosolic+bacteria.">Life on the inside: the intracellular lifestyle of cytosolic bacteria.</a> Nat Re. Micro. 7 (5), 333-340 (2009).</li></ol>

Protokollet som beskrivs här beskriver induktion, lokalisering och analys av SG i icke-infekterade celler och celler infekterade med cytosolisk patogen S. flexneri i närvaro eller frånvaro av exogen stress. Med hjälp av fri bildhanteringsprogramvara möjliggör protokollerna den exakta kvalitativa och kvantitativa analysen av SG-bildning för att identifiera och statistiskt adressera skillnader i givna fenotyper. Det finns flera kritiska steg inom protokollet för infektionen, S...

Visualisering av värd-patogen interaktioner på cellulär nivå är en kraftfull metod för att få insikter i patogena strategier och för att identifiera viktiga cellulära vägar. Faktum är att patogener kan användas som verktyg för att identifiera viktiga cellulära mål eller strukturer, eftersom patogener har utvecklats för att undergräva centrala cellulära processer som en strategi för egen överlevnad eller förökning. Visualisering av cellulära komponenter kan uppnås genom rekombinant uttryck av fluorescensmärkta värdproteiner. Medan detta tillåter sanntidsanalys är genereringen av cellinjer med specifikt märkta värdproteiner mycket mödosam och kan resultera i oönskade bieffekter. Mer praktiskt är detekteringen av cellulära faktorer med användning av specifika antikroppar, eftersom flera värdfaktorer kan analyseras samtidigt och en är inte begränsad till en viss celltyp. En nackdel är att endast en statisk vy kan fångas eftersom immunofluorescensanalysen kräver värdcellfixatJon. En viktig fördel med immunfluorescensavbildning är emellertid att det lätt lutar sig åt både kvalitativ och kvantitativ analys. Detta kan i sin tur användas för att få statistiskt signifikanta skillnader för att ge nya insikter i värd-patogen interaktioner. Fluorescerande bildanalysprogram är kraftfulla analysverktyg för att utföra 3D- och 4D-analys. Men den höga kostnaden för programvara och dess underhåll gör metoder som bygger på fri öppen källkodsprogram mer attraktiv. Noggrann bildanalys med bioanalysprogramvara är värdefull eftersom den underbygger visuell analys och vid tilldelning av statistiska signifikanser ökar förtroendet för korrektheten hos en given fenotyp. Tidigare har SGs analyserats med hjälp av den fria ImageJ-mjukvaran, vilket kräver att man manuellt identifierar enskilda SG 4 . Här tillhandahåller vi ett protokoll för induktion och analys av cellulär SG-bildning i samband med bacTeriella infektioner med hjälp av den kostnadsfria open source bio-image-analysprogrammet ICY (http://icy.bioimageanalysis.org). Bio-image-analysprogrammet har ett inbyggt spotdetektorprogram som är mycket lämpligt för SG-analys. Det gör det möjligt att finjustera den automatiska detekteringsprocessen i specificerade intresseområden (ROI). Detta övervinner behovet av manuell analys av enskilda SG och avlägsnar provtagningsförskjutning. Många miljöbelastningar inducerar bildandet av SG, vilka är fas-täta cytosoliska, icke-membranösa strukturer med en diameter av 0,2 - 5 um i diameter 5 , 6 . Detta cellulära svar är evolutionärt konserverat i jäst, växter och däggdjur och uppträder när global proteinöversättning inhiberas. Det involverar aggregering av stoppade translationsinitieringskomplex i SG, vilka anses vara hållplatser för translationellt inaktiva mRNA, vilket möjliggör selektiv translation av en delmängd av cellulära mRNA.Vid avlägsnande av stress upplöses SG och globala hastigheter för proteinsyntesresume. SG är sammansatta av translationsförlängningsinitieringsfaktorer, proteiner som är involverade i RNA-metabolism, RNA-bindande proteiner, samt ställningsproteiner och faktorer som är involverade i värdcellsignalering 2 , fastän den exakta kompositionen kan variera beroende på den pålagda spänningen. Miljöfaktorer som inducerar SG-bildning innefattar aminosyrasvältning, UV-bestrålning, värmeschock, osmotisk chock, endoplasmisk retikulastress, hypoxi och virusinfektion 2 , 7 , 8 . Många framsteg har gjorts för att förstå hur virus inducerar och subventionerar även SG-bildning, medan lite fortfarande är känt om hur andra patogener, såsom bakteriella, svamp- eller protozoa patogener, påverkar detta cellulära stressrespons 1 , 7 . ShigeLla flexneri är en gram-negativ fakultativ cytosolisk patogen hos människor och orsakssambandet till allvarlig diarré eller shigellos. Shigellosis är en stor folkhälsobördan och leder till 28 000 dödsfall årligen hos barn under 5 år 9 , 10 år . S. flexneri infekterar kolonepitelet och sprider cell till cell genom kapning av värdens cytoskeletalkomponenter 11 , 12 . Infektion av epitelet stöder replikationen av S. flexneri inom cytosolen, men infekterade makrofager dör genom en inflammatorisk celldödsprocess som kallas pyroptos. Infektion leder till en massiv rekrytering av neutrofiler och svår inflammation som åtföljs av värme, oxidativ stress och vävnadsförstöring. Således, medan infekterade celler utsätts för interna spänningar som induceras av infektion, såsom Golgi-störning, genotoxisk stress och cytoskeletala omläggningS, infekterade celler utsätts också för miljöbelastningar på grund av inflammatorisk process. Karakterisering av effekten av S. flexneri- infektion på cellernas förmåga att reagera på miljöbelastningar med användning av ett antal SG-markörer har visat att infektion leder till kvalitativa och kvantitativa skillnader i SG-sammansättning 3 . Lite är dock känt om andra bakteriella patogener. Här beskriver vi en metod för infektion av värdceller med cytosolisk patogen S. flexneri , stressen av celler med olika miljöbelastningar, märkningen av SG-komponenter och den kvalitativa och kvantitativa analysen av SG-bildning och komposition i samband med infekterade Och icke-infekterade celler. Denna metod är allmänt tillämplig på andra bakteriepatogener. Dessutom kan bildanalysen av SG-bildningen användas för infektioner av virus eller andra patogener. Det kan användas för att analysera SGBildning vid infektion eller effekten av infektion på SG-bildning som svar på exogena spänningar.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1191">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:232px;">Primary Antibodies</td>
			<td style="width:211px;"></td>
			<td style="width:76px;"></td>
			<td style="width:672px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">eIF3b (N20), origin goat </td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>sc-16377</td>
			<td>Robust and widely used SG marker. Cytosolic staining allows cell delineation. Dilution 1 in 300</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">eIF3b (A20), origin goat </td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>sc-16378</td>
			<td>Same target as eIF3b (N20) and in our hands was identical to eIF3b (N20). Dilution 1 in 300</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">eIF3A (D51F4), origin rabbit (MC: monoclonal)</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>3411</td>
			<td>Part of multiprotein eIF3 complex with eIF3b . Dilution 1 in 800</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">eIF4AI, origin goat </td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>sc-14211</td>
			<td>Recommended by (Ref # 13). Dilution 1 in 200</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">eIF4B, origin rabbit</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab186856</td>
			<td>Good stress granule marker in our hands. Dilution 1 in 300</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">eIF4B, origin rabbit</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>3592</td>
			<td>Recommended by Ref # 13. Dilution 1 in 100</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">eIF4G, origin rabbit</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>sc-11373</td>
			<td>Widely used SG marker. (Ref # 13): may not work well in mouse cell lines. Dilution 1 in 300</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">G3BP1, origin rabbit (MC: monoclonal)</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>611126</td>
			<td>Widely used SG marker. Dilution 1 in 300</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tia-1, origin goat </td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>sc-1751</td>
			<td>Widely used SG marker. Can also be found in P bodies when SG are present (Ref # 13). Dilution 1 in 300</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td colspan="2" height="21" style="height:21px;">Alexa-conjugated Secondary Antibodies</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">A488 anti-goat , origin donkey</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>A-11055</td>
			<td>Cross absorbed. Dilution 1 in 500</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">A568 anti-goat, origin donkey</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>A-11057</td>
			<td>Cross absorbed. Dilution 1 in 500</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">A488 anti-mouse, origin donkey</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>A-21202</td>
			<td>Dilution 1 in 500</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">A568 anti-mouse, origin donkey</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>A10037</td>
			<td>Dilution 1 in 500</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">A647 anti-mouse, origin donkey</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>A31571</td>
			<td>Dilution 1 in 500</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">A488 anti-rabbit, origin donkey</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>A-21206</td>
			<td>Dilution 1 in 500</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">A568 anti-rabbit, origin donkey</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>A10042</td>
			<td>Dilution 1 in 500</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Other Reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Shigella flexneri</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Available from various laboratories by request</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tryptone Casein Soya (TCS) broth</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>211825</td>
			<td>Standard growth medium for Shigella, application - bacterial growth</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">TCS agar</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>236950</td>
			<td>Standard growth agar for Shigella, application - bacterial growth</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Congo red</td>
			<td>SERVA Electrophoresis GmbH</td>
			<td>27215.01</td>
			<td>Distrimination tool for Shigell that have lost the virulence plasmid, application - bacterial growth</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Poly L lysine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P1274</td>
			<td>Useful to coating bacteria to increase infection, application - infection</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Gentamicin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G1397</td>
			<td>Selective killing of extracellular but not cytosolic bacteria, application - infection</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">HEPES</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15630-056</td>
			<td>PH buffer useful when cells are incubated at room-temperature, application - cell culture</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DMEM</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>31885</td>
			<td>Standard culture medium for HeLa cells, application - cell culture</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fetal calf serum</td>
			<td>Biowest</td>
			<td>S1810-100</td>
			<td>5% supplementation used for HeLa cell culture medium, application - cell culture</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Non-essential amino acids</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11140</td>
			<td>1/100 dilution used for HeLa cell culture medium, application - cell culture</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DMSO</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D2650</td>
			<td>Reagent diluent, application - cell culture</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium arsenite</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S7400</td>
			<td>Potent stress granule inducer (Note: highly toxic, special handling and disposal required), application - stress inducer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Clotrimazole</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C6019</td>
			<td>Potent stress granule inducer (Note:health hazard, special handling and disposal required), application - stress inducer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PFA</td>
			<td>Electron Microscopy Scences</td>
			<td>15714</td>
			<td>4% PFA is used for standard fixation of cells, application - fixation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T8787</td>
			<td>Used at 0.03% for permeabilizationof host cells before immunofluorescent staining, application - permeabilization</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">A647-phalloidin</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>A22287</td>
			<td>Dilution is at 1/40, best added during 2ary antibody staining, application - staining</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DAPI</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D9542</td>
			<td>Nucleid acid stain used to visualize both the host nucleus and bacteria, application - staining</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Parafilm</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>BR701501</td>
			<td>Paraffin film useful for immunofluorescent staining of coverslips, application - staining</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Prolong Gold</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>36930</td>
			<td>Robust mounting medium that works well for most fluorophores , application - mounting</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Mowiol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>81381</td>
			<td>Cheap and robust mounting medium that works well for most fluorophores, application - mounting</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">24-well cell culture plate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>CLS3527</td>
			<td>Standard tissue culture plates, application - cell culture</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">12-mm glass coverslips</td>
			<td>NeuVitro</td>
			<td>1001/12</td>
			<td>Cell culture support for immunofluorescent applications, application - cell support</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">forceps</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>81381</td>
			<td>Cheap and obust mounting medium that works well for most fluorophores, application - mounting</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Programs and Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Prism</td>
			<td>GraphPad Software</td>
			<td></td>
			<td>Data analysisand graphing program with robust statistical test options, application - data analysis</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Leica SP5</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td></td>
			<td>Confocal microsope, application - image acquisition</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Imaris</td>
			<td>Bitplane</td>
			<td></td>
			<td>Professional image analysis program, application - data analysis</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Excel</td>
			<td>Microsoft</td>
			<td></td>
			<td>Data analysis and graphing program, application - data analysis</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

immunofluorescence analysis of stress granule formation after bacterial challenge of mammalian cells

Fluorescerande avbildning av cellulära komponenter är ett effektivt verktyg för att undersöka värd-patogen interaktioner. Patogener kan påverka många olika särdrag hos infekterade celler, inklusive organellens ultrastruktur, cytoskeletala nätverksorganisation, liksom cellulära processer som Stress Granule (SG) -bildning. Karakteriseringen av hur patogener undergräver värdprocesser är en viktig och integrerad del av patogenesens område. Medan variabla fenotyper kan vara lätt synliga är den exakta analysen av de kvalitativa och kvantitativa skillnaderna i de cellulära strukturerna inducerad genom patogenutmaning väsentlig för att definiera statistiskt signifikanta skillnader mellan experimentella och kontrollprover. SG-bildning är ett evolutionärt konserverat stressrespons som leder till antivirala reaktioner och har länge undersökts med hjälp av virusinfektioner 1 . SG-bildning påverkar också signalkaskader och kan ha andra fortfarande okända konseqUences 2 . Karakteriseringen av detta stressrespons på andra patogener än virus, såsom bakteriepatogener, är för närvarande ett framväxande forskningsområde 3 . För närvarande är kvantitativ och kvalitativ analys av SG-bildning ännu inte rutinmässigt använd, även i virussystemen. Här beskriver vi en enkel metod för att framkalla och karakterisera SG-bildning i oinfekterade celler och i celler infekterade med en cytosolisk bakteriell patogen, vilken påverkar bildandet av SG som svar på olika exogena spänningar. Analys av SG-bildning och komposition uppnås genom användning av ett antal olika SG-markörer och pluggdetektorinplikatorn för ICY, ett open source-bildanalysverktyg.

För att förklara och demonstrera protokollet som beskrivs i detta manuskript karakteriserade vi bilden av klotrimazol-inducerad SG i HeLa-celler infekterade eller ej med cytosolisk patogen S. flexneri . En skiss av proceduren presenteras i figur 1 och innehåller virulenta och avirulenta S. flexneri- streckade på Kongo-röda plattor, bakterieberedning, infektion, tillsats av miljöbelastning, provfixering och färgning, provbildning och ...

Watch this Scientific Journal Video about Immunofluorescence Analysis of Stress Granule Formation After Bacterial Challenge of Mammalian Cells at JoVE.com

Immunofluorescence Analysis of Stress Granule Formation After Bacterial Challenge of Mammalian Cells

Vi beskriver en metod för kvalitativ och kvantitativ analys av spänningsgranulbildning i däggdjursceller efter att cellerna utmanas med bakterier och ett antal olika spänningar. Detta protokoll kan appliceras för att undersöka det cellulära stressgranule-svaret i ett brett spektrum av värd-bakteriella interaktioner.

Immunofluorescensanalys av stresskristallbildning efter bakteriell utmaning av däggdjursceller

Fluorescent imaging of cellular components is an effective tool to investigate host-pathogen interactions. Pathogens can affect many different features of ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Invasion of Human Cells by a Bacterial Pathogen

Invasion av mänskliga celler genom en bakteriell patogen

Here we will describe how we study the invasion of human endothelial cells by bacterial pathogen Staphylococcus aureus . The general protocol can be ...

In Vitro Assay of Bacterial Adhesion onto Mammalian Epithelial Cells

In Vitro Assay of Bacterial Adhesion onto Mammalian Epithelial Cells

In vitro-analys av bakteriell vidhäftning på däggdjur epitelceller

To cause infections, bacteria must colonize their host. Bacterial pathogens express various molecules or structures able to promote attachment to host ...

Introducing Shear Stress in the Study of Bacterial Adhesion

Introduktion Shear stress i studien av bakteriell vidhäftning

During bacterial infections a sequence of interactions occur between the pathogen and its host. Bacterial adhesion to the host cell surface is often the ...

Following Cell-fate in E. coli After Infection by Phage Lambda

Following Cell-fate in E. coli After Infection by Phage Lambda

Efter Cell-öde i<em&gt; E. E. coli</em&gt; Efter infektion av fag lambda

The system comprising bacteriophage (phage) lambda and the bacterium E. coli has long served as a paradigm for cell-fate determination1,2. Following the ...

Assessing Somatic Hypermutation in Ramos B Cells after Overexpression or Knockdown of Specific Genes

Bedöma Somatisk Hypermutation i Ramos B-celler efter överuttryck eller Knockdown av specifika gener

B cells start their life with low affinity antibodies generated by V(D)J recombination.  However, upon detecting a pathogen, the variable (V) region of an ...

Fluorescence Microscopy Methods for Determining the Viability of Bacteria in Association with Mammalian Cells

Fluorescensmikroskopi Metoder för att fastställa livskraft bakterier i föreningen med däggdjursceller

Central to the field of bacterial pathogenesis is the ability to define if and how microbes survive after exposure to eukaryotic cells. Current protocols ...

Electroporation of Functional Bacterial Effectors into Mammalian Cells

Elektroporation av funktionella Bakteriella Effektorer i däggdjursceller

The study of protein interactions in the context of living cells can generate critical information about localization, dynamics, and interacting partners. ...

Generation and Multi-phenotypic High-content Screening of Coxiella burnetii Transposon Mutants

Generation and Multi-phenotypic High-content Screening of Coxiella burnetii Transposon Mutants

Generation och multi fenotypisk Hög halt Screening av<em&gt; Coxiella burnetii</em&gt; Transposon Mutanter

Invasion and colonization of host cells by bacterial pathogens depend on the activity of a large number of prokaryotic proteins, defined as virulence ...

Methods to Inhibit Bacterial Pyomelanin Production and Determine the Corresponding Increase in Sensitivity to Oxidative Stress

Metoder för att inhibera bakteriell Pyomelanin Produktion och Bestäm motsvarande ökning i känslighet för oxidativ stress

Pyomelanin is an extracellular red-brown pigment produced by several bacterial and fungal species. This pigment is derived from the tyrosine catabolism ...

Implementation of a Permeable Membrane Insert-based Infection System to Study the Effects of Secreted Bacterial Toxins on Mammalian Host Cells

Genomförande av ett permeabelt membran Insert-baserade Infection System för att studera effekterna av utsöndrade bakteriella toxiner på däggdjursvärdceller

Many bacterial pathogens secrete potent toxins to aid in the destruction of host tissue, to initiate signaling changes in host cells or to manipulate ...