Name: single molecule analysis of laser localized psoralen adducts
Uploaded: 2017-04-20T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Single Molecule Analysis of Laser Localized Psoralen Adducts at JoVE.com

Denne forskning blev delvist understøttet af den Intramural forskningsprogram for NIH, National Institute on Aging (Z01 AG000746-08) og fanconis anæmi Research Fund.

1. Fremstilling af Dig-TMP <ol><li> Bland 50 mg (0,18 mmol) 4&#39;-chlormethyl-4,5&#39; , 8-trimethylpsoralen og 590 mg (2,7 mmol) af 4,7,10-trioxa-1,13-tridecanedi-amin i en tør 25 ml runde Bunden kolbe under nitrogen. Tilsættes 10 ml toluen og tilbagesvaling i 12 timer. Fjernelse af opløsningsmiddel i en rotationsfordamper under reduceret tryk. <ol><li> Remanensen renses ved flashsøjlekromatografi over silicagel. Søjlen elueres med chloroform, methanol og 28% ammoniakopløsning (9: 1: 0,5). Opl...

<ol>
	<li>Lindahl, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Intrinsic+Fragility+of+DNA+(Nobel+Lecture).">The Intrinsic Fragility of DNA (Nobel Lecture).</a> Angew. Chem. Int. Ed Engl. 55 (30), 8528-8534 (2016).</li><li>Sirbu, B. M., Cortez, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+damage+response:+three+levels+of+DNA+repair+regulation.">DNA damage response: three levels of DNA repair regulation.</a> Cold Spring Harb. Perspect. Biol. 5, a01272 (2013).</li><li>Berkovich, E., Monnat, R. J., Kastan, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+of+protein+dynamics+and+DNA+repair+following+generation+of+DNA+double-strand+breaks+at+defined+genomic+sites.">Assessment of protein dynamics and DNA repair following generation of DNA double-strand breaks at defined genomic sites.</a> Nat. Protoc. 3 (5), 915-922 (2008).</li><li>Rogakou, E. P., Boon, C., Redon, C., Bonner, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Megabase+chromatin+domains+involved+in+DNA+double-strand+breaks+in+vivo.">Megabase chromatin domains involved in DNA double-strand breaks in vivo.</a> J. Cell Biol. 146, 905-916 (1999).</li><li>Lan, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+analysis+of+repair+processes+for+oxidative+DNA+damage+in+mammalian+cells.">In situ analysis of repair processes for oxidative DNA damage in mammalian cells.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 13738-13743 (2004).</li><li>Reynolds, P., Botchway, S. W., Parker, A. W., O'Neill, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatiotemporal+dynamics+of+DNA+repair+proteins+following+laser+microbeam+induced+DNA+damage+-+when+is+a+DSB+not+a+DSB?.">Spatiotemporal dynamics of DNA repair proteins following laser microbeam induced DNA damage - when is a DSB not a DSB?.</a> Mutat. Res. 756, 14-20 (2013).</li><li>Vilenchik, M. M., Knudson, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endogenous+DNA+double-strand+breaks:+production,+fidelity+of+repair,+and+induction+of+cancer.">Endogenous DNA double-strand breaks: production, fidelity of repair, and induction of cancer.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100, 12871-12876 (2003).</li><li>Vilenchik, M. M., Knudson, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Radiation+dose-rate+effects,+endogenous+DNA+damage,+and+signaling+resonance.">Radiation dose-rate effects, endogenous DNA damage, and signaling resonance.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103, 17874-17879 (2006).</li><li>Aguilera, A., Garcia-Muse, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Causes+of+genome+instability.">Causes of genome instability.</a> Annu. Rev. Genet. 47, 1-32 (2013).</li><li>Swenberg, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endogenous+versus+exogenous+DNA+adducts:+their+role+in+carcinogenesis,+epidemiology,+and+risk+assessment.">Endogenous versus exogenous DNA adducts: their role in carcinogenesis, epidemiology, and risk assessment.</a> Toxicol. Sci. 120 (1), S130-S145 (2011).</li><li>Eichman, B. F., Mooers, B. H., Alberti, M., Hearst, J. E., Ho, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+crystal+structures+of+psoralen+cross-linked+DNAs:+drug-dependent+formation+of+holliday+junctions.">The crystal structures of psoralen cross-linked DNAs: drug-dependent formation of holliday junctions.</a> J. Mol. Biol. 308, 15-26 (2001).</li><li>Lai, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+analysis+of+DNA+interstrand+cross-links+and+monoadducts+formed+in+human+cells+induced+by+psoralens+and+UVA+irradiation.">Quantitative analysis of DNA interstrand cross-links and monoadducts formed in human cells induced by psoralens and UVA irradiation.</a> Anal. Chem. 80, 8790-8798 (2008).</li><li>Thazhathveetil, A. K., Liu, S. T., Indig, F. E., Seidman, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Psoralen+conjugates+for+visualization+of+genomic+interstrand+cross-links+localized+by+laser+photoactivation.">Psoralen conjugates for visualization of genomic interstrand cross-links localized by laser photoactivation.</a> Bioconjug. Chem. 18, 431-437 (2007).</li><li>Muniandy, P. A., Thapa, D., Thazhathveetil, A. K., Liu, S. T., Seidman, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Repair+of+laser-localized+DNA+interstrand+cross-links+in+G1+phase+mammalian+cells.">Repair of laser-localized DNA interstrand cross-links in G1 phase mammalian cells.</a> J Biol. Chem. 284 (41), 27908-27917 (2009).</li><li>Nowsheen, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accumulation+of+oxidatively+induced+clustered+DNA+lesions+in+human+tumor+tissues.">Accumulation of oxidatively induced clustered DNA lesions in human tumor tissues.</a> Mutat. Res. 674, 131-136 (2009).</li><li>Meyer, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clustered+DNA+damage+induces+pan-nuclear+H2AX+phosphorylation+mediated+by+ATM+and+DNA-PK.">Clustered DNA damage induces pan-nuclear H2AX phosphorylation mediated by ATM and DNA-PK.</a> Nucl Acids Res. 41, 6109-6118 (2013).</li><li>Schwab, R. A., Niedzwiedz, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+DNA+replication+in+the+vertebrate+model+system+DT40+using+the+DNA+fiber+technique.">Visualization of DNA replication in the vertebrate model system DT40 using the DNA fiber technique.</a> J Vis. Exp. (56), e3255 (2011).</li><li>Kad, N. M., Wang, H., Kennedy, G. G., Warshaw, D. M., Van, H. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Collaborative+dynamic+DNA+scanning+by+nucleotide+excision+repair+proteins+investigated+by+single-+molecule+imaging+of+quantum-dot-labeled+proteins.">Collaborative dynamic DNA scanning by nucleotide excision repair proteins investigated by single- molecule imaging of quantum-dot-labeled proteins.</a> Mol. Cell. 37 (5), 702-713 (2010).</li><li>Spielmann, H. P., Sastry, S. S., Hearst, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+the+large-scale+synthesis+of+psoralen+furan-side+monoadducts+and+diadducts.">Methods for the large-scale synthesis of psoralen furan-side monoadducts and diadducts.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89 (10), 4514-4518 (1992).</li><li>Huang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+DNA+translocase+FANCM/MHF+promotes+replication+traverse+of+DNA+interstrand+crosslinks.">The DNA translocase FANCM/MHF promotes replication traverse of DNA interstrand crosslinks.</a> Mol. Cell. 52, 434-446 (2013).</li><li>Huang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+Molecule+Analysis+of+Laser+Localized+Interstrand+Crosslinks.">Single Molecule Analysis of Laser Localized Interstrand Crosslinks.</a> Front Genet. 7, 84 (2016).</li><li>Ciccia, A., Elledge, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+DNA+damage+response:+making+it+safe+to+play+with+knives.">The DNA damage response: making it safe to play with knives.</a> Mol. Cell. 40, 179-204 (2010).</li><li>Mori, T., Matsunaga, T., Hirose, T., Nikaido, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+a+monoclonal+antibody+recognizing+ultraviolet+light-induced+(6-4)+photoproducts.">Establishment of a monoclonal antibody recognizing ultraviolet light-induced (6-4) photoproducts.</a> Mutat. Res. 194, 263-270 (1988).</li><li>Poirier, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antisera+specific+for+carcinogen-DNA+adducts+and+carcinogen-modified+DNA:+applications+for+detection+of+xenobiotics+in+biological+samples.">Antisera specific for carcinogen-DNA adducts and carcinogen-modified DNA: applications for detection of xenobiotics in biological samples.</a> Mutat. Res. 288, 31-38 (1993).</li><li>Henderson, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+G-quadruplex+DNA+in+mammalian+cells.">Detection of G-quadruplex DNA in mammalian cells.</a> Nucleic Acids Res. 42, 860-869 (2014).</li></ol>

Laseren lokalisering teknologi kræver anvendelse af adhærerende celler med kerner, der er synlige i lysfeltmikroskopi. Vi har forsøgt at vedhæfte vedhæftede celler, såsom primære lymfocytter eller løst adhærerende dyrkede celler, såsom AD293, til glasoverfladen med celleadhæsive præparater, såsom polylysin eller kollagen, eller mere komplekse blandinger. Selv om disse behandlinger kan binde cellerne til overfladen, finder vi, at de generelt forblive afrundet gør det meget vanskeligt at fokusere ind i kerne...

DNA er under konstant angreb fra eksogene midler såsom stråling, ultraviolet lys, miljømæssige toksiner, forbrændingsprodukter, etc. Endvidere er det også angrebet af endogene radikaler produceret af oxidativ metabolisme. Alle disse har potentiale til kemisk eller fysisk forstyrre integriteten af DNA 1. Forstyrrelser i genomet kan aktivere DNA Damage Response (DDR), en rekruttering og posttranslationel modifikation kaskade med hundredvis, hvis ikke tusinder, af proteiner og microRNA involveret i læsion reparation, regulering af cellecyklussen, apoptose, fremadskridende alderdom og inflammatoriske pathways 2. De fleste af vores information om DDR, kommer fra studier med DSBs. Dette er i vid udstrækning på grund af tilgængeligheden af teknologier til indføring pauser, herunder sekvensspecifikke pauser, i genomisk DNA i levende celler 3. Desuden propensity af pauser til at inducere foci af DDR-proteiner, som kan vises ved hjælp af immunfluorescens, har været meget nyttigt til identifikation af kinetikken og krav i responderende proteiner. En af de vigtigste teknologier til at studere DDR blev introduceret af Bonner og kolleger, der brugte en laserstråle til at lede en stribe af DSBs i en &quot;Region of Interest&quot; (ROI) i kerner af levende celler 4. I realiteten skabte de en langvarig fokus, hvor proteiner af DDR kunne identificeres ved immunfluorescens. Dette blev illustreret ved deres demonstration af stærk stribe af phosphoryleret histon H2AX (γ-H2AX) i laser eksponerede celler. Siden da har laser fremgangsmåde været anvendt i talrige undersøgelser af DDR induceret af DSB&#39;er. Selvom kraftfulde og populære, og kilden til dramatiske immunofluorescens billeder, skal det bemærkes, at laseren intensitet i de fleste forsøg er justeret således at producere observerbare resultater, uden bekymring for læsion identitet,densitet, eller indbyrdes afstand. Faktisk kan det være vanskeligt at foretage disse skøn. De er således stort set ignoreret, trods de mange læsioner indført i DNA ved lasere 5. Dette bidrager til de mange modsætninger i litteraturen 6. I modsætning til DSBs, de fleste kemiske modifikationer af DNA ikke stimulere dannelsen af ​​diskrete foci af DDR-proteiner. Dette er vigtigt i lyset af vores nuværende forståelse af læsion frekvenser. Det er blevet anslået, at humane celler i kultur pådrage så mange som 50 DSB&#39;er per celle cyklus, der dannes i høj grad under S-fasen 7, 8, 9. Færre dannes i ikke-prolifererende celler. Dette står i modsætning til antallet af nucleobase tab eller modifikation begivenheder, som i titusindvis per celle / dag 1, 10. Således ved vi mest omDDR fremkaldt af begivenheder, der er relativt sjældne, og meget mindre om dem fremkaldt af helix forvridende læsioner, som tilsammen er langt mere almindelige. For at afhjælpe spørgsmål om det cellulære respons på kovalente modifikationer af genomisk DNA, vi ønskede at arbejde med en helix fordreje DNA addukt, havde iboende DDR induktionsaktivitet. Desuden for at lette eksperimentelle design og fortolkning vi var interesserede i en struktur, hvis introduktion kan kontrolleres med hensyn til tid og var modtagelig for visualisering. Derfor udviklede vi en strategi baseret på psoralen. Psoralener er velkarakteriserede fotoaktive DNA-interkalatorer favoriserer 5&#39;TA: AT sites. I modsætning til andre tværbindingsmidler såsom nitrogensennepper og mitomycin C (MMC) de er ikke DNA reaktive medmindre udsat for langbølget UV (UVA) lys. De indskudte molekyler reagerer med thyminbaser på modsatte strenge at producere helix fordreje interstrengstværbindinger (ICLS) 11. Med trimethyl psoralen anvendt i vores eksperimenter fleste produkter er ICLS, relativt få monoadducts genereres (mindre end 10%) 12 og intrastreng tværbindinger mellem tilstødende baser på én streng er ikke dannet. Fordi de er stærke blokke til replikation og transkription, psoralen og andre tværbindingsmidler, ligesom cis-platin og MMC, er almindeligt anvendt i kemoterapi. Således psoralen aktiveret undersøgelser, der fulgte aktiveringen af ​​DDR ved en helix fordreje struktur, og også leveret indsigt i den cellulære reaktion til en forbindelse med klinisk betydning. Syntetiserede vi et reagens, hvori trimethyl psoralen var knyttet til digoxigenin (DIG), en plantesterol ikke findes i pattedyrceller og anvendes hyppigt som et immunotag. Kravet om fotoaktivering tillader lokalisering af laserlys (365 nm) af psoralen ICLS i definerede ROI i kerner i levende celler. Disse kan vises ved immunofluorescence mod Dig tag. DNA-reparation og DDR-proteinerne syntes i striberne af laser lokaliserede ICLS 13, 14. DDR aktiveres ved de høje laser intensiteter anvendes til fremstilling af DSB&#39;er kunne skyldes isoleret eller grupperet skade 15, 16. Følgelig til relevansen af ​​resultater fra disse forsøg naturligt forekommende læsioner, til stede i meget lavere koncentration, er usikker. For at løse lignende spørgsmål om psoralen addukt frekvens og afstand i DNA, tog vi fordel af DNA fiberteknologi 17 og immunoquantum prikker. Kvantepunkter er meget lysere end fluorescerende farvestoffer og er ikke bleget af udsættelse for lys. De er således ofte til enkelt molekyle billeddannelse 18, en ansøgning, som fluorescerende farvestoffer er tilstrækkeligt lyse. Individuelle DNA fibre kan strækkes på glass rutschebaner og kan vises ved immunofluorescens mod nukleosidanaloger inkorporeret under inkubationer før cellehøst. Vi behandlede celler med Dig-psoralen og udsat ROI for laser micro bestråling. Fibre blev fremstillet fra cellerne og individuelle Dig-psoralen addukter kunne visualiseres med immunoquantum prikker. Udsættelse af cellerne for nukleosidanaloger for relativt korte tidsrum (20-60 min) tillader visningen af ​​replikations skrifter i nærheden af ​​laser lokaliseret ICLS.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Digoxigenin NHS ester</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>11333054001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloro-psoralen</td>
			<td>Berry and Associates</td>
			<td>PS 5000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>diaminoglycol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>369519</td>
			<td>4,7,10-Trioxa-1,13-tridecanediamine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>423550040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A4524</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>5002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TLC plates</td>
			<td>Analtech, Inc.</td>
			<td>P02511</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flass glass column 24/40, 100ml</td>
			<td>Chemglass Life Sciences</td>
			<td>CG-1196-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon T2000_E2 spinning disk confocal microscope, equipped with automated stage and environmental control chamber and plate holder</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td></td>
			<td>With Volocity Software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropoint Galvo&#160;</td>
			<td>Andor Technologies</td>
			<td></td>
			<td>with a Nitrogen pulsed laser&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dye cell</td>
			<td>Andor Technologies</td>
			<td>MP-2250-2-365</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>365 dye</td>
			<td>Andor Technologies</td>
			<td>MP-27-365-DYE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IdU&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>17125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35mm glass botomm plates 1.5 coverslip, 10mm glass diameter, uncoated</td>
			<td>Matek</td>
			<td>P35G-1.5-10-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>microscope slides</td>
			<td>New Comer Supply</td>
			<td>Part # 5070</td>
			<td>New Silane Slides</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti BrdU antibody (IdU)</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>347580</td>
			<td>1 in 40</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat anti BrdU Antibody (CldU)</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab6326</td>
			<td>1 in 200&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti Dig antibody</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>710019</td>
			<td>1 in 200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Q-dot 655 goat anti Rabbit IgG</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>Q-11421MP</td>
			<td>1 in 5000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AF647- goat anti Rat IgG</td>
			<td>Jackson Immunoresearch</td>
			<td>112-605-167</td>
			<td>1 in 100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AF488-goat anti mouse IgG</td>
			<td>Jackson Immunoresearch</td>
			<td>115-545-166</td>
			<td>1 in 100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss epifluorescent microscope A200</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>&#160;with Axiovision software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Q-dot 655 filter</td>
			<td>Chroma</td>
			<td>39107</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

single molecule analysis of laser localized psoralen adducts

DNA Damage Response (DDR) er blevet grundigt karakteriseret i undersøgelser af dobbeltstrengsbrud (DSB&#39;er) induceret af laser micro bestrålingen i levende celler. DDR til helix fordreje covalente DNA modifikationer, herunder interstrengs DNA tværbindinger (ICLS), er ikke så veldefinerede. Vi har undersøgt DDR stimuleret af ICLS, lokaliseret ved hjælp af laser fotoaktivering af immunotagged psoralener, i kerner af levende celler. For at løse fundamentale spørgsmål om addukt distribution og replikationsgaffel møder, vi kombineret laser lokalisering med to andre teknologier. DNA fibre ofte bruges til at vise forløbet af replikationsforgreninger ved immunfluorescens af nukleosidanaloger inkorporeret under korte impulser. Immunoquantum prikker er ofte blevet anvendt til enkelt molekyle billeddannelse. I den nye fremgangsmåde er DNA fibre fra celler, der bærer laser lokaliserede ICLS spredes på mikroskopobjektglas. De mærkede ICLS vises med immunoquantum prikker og the inter-læsion afstande bestemt. Replikationsgaffel sammenstød med ICLS kan visualiseres og forskellige støder mønstre identificeres og kvantificeres.

Laser lokaliserede Dig-TMP (figur 1A) ICLS kan vises ved immunofluorescens mod Dig-mærket knyttet til psoralen. Selvom laseren kan rettes til at slå i et område af enhver kontur, striber er ikke &quot;naturlige&quot; former i celler, og legitime signaler kan let skelnes fra artefakter på grund af ikke-specifik binding med primære eller sekundære antistoffer. Denne funktion er nyttig, når du bruger antistoffer af mindre end perfekt specificitet. Et eksempel på den...

Watch this Scientific Journal Video about Single Molecule Analysis of Laser Localized Psoralen Adducts at JoVE.com

Single Molecule Analysis of Laser Localized Psoralen Adducts

Lasere anvendes ofte i studier af det cellulære respons på DNA beskadigelse. Men de generere læsioner, hvis afstand, hyppighed, og kollisioner med replikationsgafler sjældent karakteriseret. Her beskriver vi en fremgangsmåde, der muliggør bestemmelse af disse parametre med laser lokaliseret interstrengstværbindinger.

Single Molecule Analyse af Laser Lokaliserede Psoralen Adducts

The DNA Damage Response (DDR) has been extensively characterized in studies of double strand breaks (DSBs) induced by laser micro beam irradiation in live ...

Research

JoVE Journal

Genetics

Laser-assisted Cytoplasmic Microinjection in Livestock Zygotes

Laser-assisteret Cytoplasmatisk Mikroinjektion i Livestock Zygoter

Cytoplasmic microinjection into one-cell embryos is a very powerful technique. As an example, it enables the delivery of genome editing tools that can ...

Metagenomic Analysis of Silage

Metagenomisk Analyse af ensilage

Metagenomics is defined as the direct analysis of deoxyribonucleic acid (DNA) purified from environmental samples and enables taxonomic identification of ...

Detection of Copy Number Alterations Using Single Cell Sequencing

Påvisning af Copy Number Ændringer Brug Single Cell Sequencing

Detection of genomic changes at single cell resolution is important for characterizing genetic heterogeneity and evolution in normal tissues, cancers, and ...

Mapping RNA-RNA Interactions Globally Using Biotinylated Psoralen

Kortlægning af RNA-RNA-interaktioner globalt ved anvendelse af biotinyleret psoralen

Knowing how RNAs interact with themselves and with others is key to understanding RNA based gene regulation in the cell. While examples of RNA-RNA ...

Laser Microirradiation to Study In Vivo Cellular Responses to Simple and Complex DNA Damage

Laser Microirradiation to Study In Vivo Cellular Responses to Simple and Complex DNA Damage

Laser Microirradiation at studere In Vivo cellulære svar til Simple og komplekse DNA-skader

DNA damage induces specific signaling and repair responses in the cell, which is critical for protection of genome integrity. Laser microirradiation ...

Real-time Analysis of Transcription Factor Binding, Transcription, Translation, and Turnover to Display Global Events During Cellular Activation

Real-time analyse af transskription faktor bindende, transskription, Translation og omsætning skal vises Global begivenheder under aktivering af cellulære

Upon activation, cells rapidly change their functional programs and, thereby, their gene expression profile. Massive changes in gene expression occur, for ...

Investigation of Protein Recruitment to DNA Lesions Using 405 Nm Laser Micro-irradiation

Undersøgelse af Protein rekruttering til DNA læsioner ved hjælp af 405 Nm Laser mikro-bestråling

The DNA Damage Response (DDR) uses a plethora of proteins to detect, signal, and repair DNA lesions. Delineating this response is critical to understand ...

Single Molecule Fluorescence In Situ Hybridization (smFISH) Analysis in Budding Yeast Vegetative Growth and Meiosis

Single Molecule Fluorescence In Situ Hybridization smFISH Analysis in Budding Yeast Vegetative Growth and Meiosis

Enkelt molekyle fluorescens In Situ hybridisering (smFISH) analyser i spirende gær vegetativ vækst og meiose

Single molecule fluorescence in situ hybridization (smFISH) is a powerful technique to study gene expression in single cells due to its ability to detect ...

Using In Vitro and In-cell SHAPE to Investigate Small Molecule Induced Pre-mRNA Structural Changes

Ved hjælp af in Vitro og i celler form at undersøge lille molekyle induceret Pre-mRNA strukturelle ændringer

In the process of drug development of RNA-targeting small molecules, elucidating the structural changes upon their interactions with target RNA sequences ...