Name: single molecule analysis of laser localized psoralen adducts
Uploaded: 2017-04-20T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Single Molecule Analysis of Laser Localized Psoralen Adducts at JoVE.com

Denne forskningen ble støttet delvis av egenutført Research Program fra NIH, National Institute on Aging (Z01 AG000746-08) og Fanconi Anemi forskningsfond.

1. Fremstilling av Dig-TMP <ol><li> Bland 50 mg (0,18 mmol) 4&#39;-klormetyl-4,5&#39; , 8-trimethylpsoralen og 590 mg (2,7 mmol) av 4,7,10-trioksa-1,13-tridecanedi-amin i en tørr 25 ml rund -bottom kolbe under nitrogen. Tilsett 10 ml toluen og tilbakeløpskjøling i 12 timer. Fjern løsningsmidlet i en rotasjonsfordamper under redusert trykk. <ol><li> Rens residuet ved flash-kolonnekromatografi over silicagel. Kolonnen ble eluert med kloroform, metanol og 28% ammoniakkløsning (9: 1: 0,5). Fordamp l?...

<ol>
	<li>Lindahl, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Intrinsic+Fragility+of+DNA+(Nobel+Lecture).">The Intrinsic Fragility of DNA (Nobel Lecture).</a> Angew. Chem. Int. Ed Engl. 55 (30), 8528-8534 (2016).</li><li>Sirbu, B. M., Cortez, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+damage+response:+three+levels+of+DNA+repair+regulation.">DNA damage response: three levels of DNA repair regulation.</a> Cold Spring Harb. Perspect. Biol. 5, a01272 (2013).</li><li>Berkovich, E., Monnat, R. J., Kastan, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+of+protein+dynamics+and+DNA+repair+following+generation+of+DNA+double-strand+breaks+at+defined+genomic+sites.">Assessment of protein dynamics and DNA repair following generation of DNA double-strand breaks at defined genomic sites.</a> Nat. Protoc. 3 (5), 915-922 (2008).</li><li>Rogakou, E. P., Boon, C., Redon, C., Bonner, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Megabase+chromatin+domains+involved+in+DNA+double-strand+breaks+in+vivo.">Megabase chromatin domains involved in DNA double-strand breaks in vivo.</a> J. Cell Biol. 146, 905-916 (1999).</li><li>Lan, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+analysis+of+repair+processes+for+oxidative+DNA+damage+in+mammalian+cells.">In situ analysis of repair processes for oxidative DNA damage in mammalian cells.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 13738-13743 (2004).</li><li>Reynolds, P., Botchway, S. W., Parker, A. W., O'Neill, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatiotemporal+dynamics+of+DNA+repair+proteins+following+laser+microbeam+induced+DNA+damage+-+when+is+a+DSB+not+a+DSB?.">Spatiotemporal dynamics of DNA repair proteins following laser microbeam induced DNA damage - when is a DSB not a DSB?.</a> Mutat. Res. 756, 14-20 (2013).</li><li>Vilenchik, M. M., Knudson, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endogenous+DNA+double-strand+breaks:+production,+fidelity+of+repair,+and+induction+of+cancer.">Endogenous DNA double-strand breaks: production, fidelity of repair, and induction of cancer.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100, 12871-12876 (2003).</li><li>Vilenchik, M. M., Knudson, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Radiation+dose-rate+effects,+endogenous+DNA+damage,+and+signaling+resonance.">Radiation dose-rate effects, endogenous DNA damage, and signaling resonance.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103, 17874-17879 (2006).</li><li>Aguilera, A., Garcia-Muse, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Causes+of+genome+instability.">Causes of genome instability.</a> Annu. Rev. Genet. 47, 1-32 (2013).</li><li>Swenberg, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endogenous+versus+exogenous+DNA+adducts:+their+role+in+carcinogenesis,+epidemiology,+and+risk+assessment.">Endogenous versus exogenous DNA adducts: their role in carcinogenesis, epidemiology, and risk assessment.</a> Toxicol. Sci. 120 (1), S130-S145 (2011).</li><li>Eichman, B. F., Mooers, B. H., Alberti, M., Hearst, J. E., Ho, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+crystal+structures+of+psoralen+cross-linked+DNAs:+drug-dependent+formation+of+holliday+junctions.">The crystal structures of psoralen cross-linked DNAs: drug-dependent formation of holliday junctions.</a> J. Mol. Biol. 308, 15-26 (2001).</li><li>Lai, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+analysis+of+DNA+interstrand+cross-links+and+monoadducts+formed+in+human+cells+induced+by+psoralens+and+UVA+irradiation.">Quantitative analysis of DNA interstrand cross-links and monoadducts formed in human cells induced by psoralens and UVA irradiation.</a> Anal. Chem. 80, 8790-8798 (2008).</li><li>Thazhathveetil, A. K., Liu, S. T., Indig, F. E., Seidman, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Psoralen+conjugates+for+visualization+of+genomic+interstrand+cross-links+localized+by+laser+photoactivation.">Psoralen conjugates for visualization of genomic interstrand cross-links localized by laser photoactivation.</a> Bioconjug. Chem. 18, 431-437 (2007).</li><li>Muniandy, P. A., Thapa, D., Thazhathveetil, A. K., Liu, S. T., Seidman, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Repair+of+laser-localized+DNA+interstrand+cross-links+in+G1+phase+mammalian+cells.">Repair of laser-localized DNA interstrand cross-links in G1 phase mammalian cells.</a> J Biol. Chem. 284 (41), 27908-27917 (2009).</li><li>Nowsheen, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accumulation+of+oxidatively+induced+clustered+DNA+lesions+in+human+tumor+tissues.">Accumulation of oxidatively induced clustered DNA lesions in human tumor tissues.</a> Mutat. Res. 674, 131-136 (2009).</li><li>Meyer, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clustered+DNA+damage+induces+pan-nuclear+H2AX+phosphorylation+mediated+by+ATM+and+DNA-PK.">Clustered DNA damage induces pan-nuclear H2AX phosphorylation mediated by ATM and DNA-PK.</a> Nucl Acids Res. 41, 6109-6118 (2013).</li><li>Schwab, R. A., Niedzwiedz, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+DNA+replication+in+the+vertebrate+model+system+DT40+using+the+DNA+fiber+technique.">Visualization of DNA replication in the vertebrate model system DT40 using the DNA fiber technique.</a> J Vis. Exp. (56), e3255 (2011).</li><li>Kad, N. M., Wang, H., Kennedy, G. G., Warshaw, D. M., Van, H. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Collaborative+dynamic+DNA+scanning+by+nucleotide+excision+repair+proteins+investigated+by+single-+molecule+imaging+of+quantum-dot-labeled+proteins.">Collaborative dynamic DNA scanning by nucleotide excision repair proteins investigated by single- molecule imaging of quantum-dot-labeled proteins.</a> Mol. Cell. 37 (5), 702-713 (2010).</li><li>Spielmann, H. P., Sastry, S. S., Hearst, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+the+large-scale+synthesis+of+psoralen+furan-side+monoadducts+and+diadducts.">Methods for the large-scale synthesis of psoralen furan-side monoadducts and diadducts.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89 (10), 4514-4518 (1992).</li><li>Huang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+DNA+translocase+FANCM/MHF+promotes+replication+traverse+of+DNA+interstrand+crosslinks.">The DNA translocase FANCM/MHF promotes replication traverse of DNA interstrand crosslinks.</a> Mol. Cell. 52, 434-446 (2013).</li><li>Huang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+Molecule+Analysis+of+Laser+Localized+Interstrand+Crosslinks.">Single Molecule Analysis of Laser Localized Interstrand Crosslinks.</a> Front Genet. 7, 84 (2016).</li><li>Ciccia, A., Elledge, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+DNA+damage+response:+making+it+safe+to+play+with+knives.">The DNA damage response: making it safe to play with knives.</a> Mol. Cell. 40, 179-204 (2010).</li><li>Mori, T., Matsunaga, T., Hirose, T., Nikaido, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+a+monoclonal+antibody+recognizing+ultraviolet+light-induced+(6-4)+photoproducts.">Establishment of a monoclonal antibody recognizing ultraviolet light-induced (6-4) photoproducts.</a> Mutat. Res. 194, 263-270 (1988).</li><li>Poirier, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antisera+specific+for+carcinogen-DNA+adducts+and+carcinogen-modified+DNA:+applications+for+detection+of+xenobiotics+in+biological+samples.">Antisera specific for carcinogen-DNA adducts and carcinogen-modified DNA: applications for detection of xenobiotics in biological samples.</a> Mutat. Res. 288, 31-38 (1993).</li><li>Henderson, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+G-quadruplex+DNA+in+mammalian+cells.">Detection of G-quadruplex DNA in mammalian cells.</a> Nucleic Acids Res. 42, 860-869 (2014).</li></ol>

Laseren lokaliseringsteknologi krever bruk av adherente celler med kjerner som er synlige i lysfelt-mikroskopi. Vi har forsøkt å feste ikke-adherente celler, så som primære lymfocytter, eller løs klebrig dyrkede celler slik som AD293, med glassoverflaten med celle adhesive preparater, så som polylysin eller kollagen, eller mer komplekse blandinger. Selv om disse behandlingene kan binde cellene til overflaten, finner vi at de som regel bli avrundet noe som gjør det svært vanskelig å fokusere på kjernen. Videre ...

DNA er under konstant angrep fra eksogene midler slik som stråling, ultrafiolett lys, miljøgifter, forbrenningsprodukter, etc. I tillegg er det også angrepet av endogene radikal-forbindelser fremstilt ved oksidativ metabolisme. Alle disse har potensial til å kjemisk eller fysisk å bryte integriteten av DNA-1. Forstyrrelser i genomet kan aktivere DNA skade respons (DDR), en rekruttering og posttranslasjonell modifikasjon kaskade med hundrevis, om ikke tusenvis, av proteiner og microRNAs som er involvert i lesjonen reparasjon, regulering av cellesyklusen, apoptose, begynnende alderdom, og inflammatoriske trasé 2. De fleste av våre informasjon om DDR kommer fra studier med DSB sin. Dette er i stor grad på grunn av tilgjengeligheten av teknologier for innføring av pauser, inkludert sekvensspesifikke pauser, i genomisk DNA i levende celler 3. I tillegg propensity av pauser for å indusere foci av DDR-proteiner, noe som kan vises ved immunfluorescens, har vært svært nyttig for å identifisere de kinetikk og kravene til responderende proteiner. En av de viktigste teknologiene for å studere DDR ble introdusert av Bonner og kolleger, som brukte en laserstråle til å lede en stripe av DSB sin i en &quot;Region of Interest&quot; (ROI) i kjernen av levende celler 4. I praksis, skapte de en lang fokus hvori proteinene ifølge DDR kunne identifiseres ved immunfluorescens. Dette ble vist ved deres demonstrasjon av den sterke stripe av fosforylert histon H2AX (γ-H2AX) i laser eksponerte celler. Siden den gang har laseren fremgangsmåte blitt anvendt i mange studier av DDR-indusert av DSB. Selv kraftig og populært, og kilden til dramatiske immunfluorescens bilder, bør det bemerkes at i de fleste eksperimenter laser intensiteten justeres slik at det blir observer resultater, uten bekymring for lesjon identitet,tetthet eller avstand. Faktisk kan det være vanskelig å gjøre disse estimatene. Dermed er de i stor grad ignorert, til tross for mangfoldet av lesjoner innført i DNA av lasere 5. Dette bidrar til de mange motsetninger i litteraturen 6. I motsetning til DSB, har de fleste kjemiske modifikasjoner av DNA som ikke stimulere dannelsen av diskrete områder med DDR proteiner. Dette er viktig i lys av vår nåværende forståelse av lesjon frekvenser. Det har blitt anslått at humane celler i kultur medføre så mange som 50 DSB per cellesyklus, dannet hovedsakelig under S-fase 7, 8, 9. Færre er dannet i ikke-prolifererende celler. Dette står i kontrast med det antall nukleobasen tap eller endringshendelser, som er i titusener pr celle / dag 1, 10. Dermed vet vi mest omDDR indusert av hendelser som er forholdsvis sjeldne, og mye mindre om de som fremkalles av heliksen forvrenge lesjoner, som til sammen er langt mer vanlig. For å løse spørsmål om den cellulære responsen overfor kovalente modifikasjoner av genomisk DNA, ønsket vi å arbeide med en helix forvrengt DNA-addukt som hadde iboende DDR induksjonsaktivitet. Videre, for å lette eksperimentell design og tolkning vi var interessert i en struktur hvis innføring kunne kontrolleres med hensyn til tid og var mottagelig for visualisering. Følgelig har vi utviklet en strategi basert på psoralen. Psoralener er godt karakterisert fotoaktive DNA-interkalatorer som begunstiger 5&#39; TA: AT områder. I motsetning til andre tverrbindingsmidler som for eksempel nitrogensenneper og mitomycin C (MMC) de er ikke DNA-reaktive med mindre utsatt for langbølget UV (UVA-lys). De innskutte molekylene reagerer med tymin baser på motsatte tråder for å fremstille spiral forvrengt interkjedede tverrbindinger (ICLs) 11. Med trimetyl psoralen ble benyttet i forsøkene de fleste produkter er ICLs, relativt få monoadducts er generert (mindre enn 10%) 12, og intrakjede tverrbindinger mellom nærliggende baser på den ene tråden blir ikke dannet. Fordi de er kraftige blokker til replikasjon og transkripsjon, psoralen og andre tverrbindingsmidler, slik som cis-platina og MMC, blir ofte brukt i kjemoterapi. Således psoralen aktivert studier som fulgte etter aktivering av DDR med en spiral forvrenge struktur, og også gitt innsikt i den cellulære responsen overfor en forbindelse med klinisk betydning. Vi har syntetisert et reagens hvor trimetyl psoralen var knyttet til digoksigenin (Dig), en plantesterol ikke finnes i pattedyrceller og ofte brukt som en immunotag. Kravet for fotoaktivering tillater lokalisering av laserlys (365 nm) av psoralen ICLs i ROI definert i kjerner i levende celler. Disse kan vises ved immunofluorescence mot Dig tag. DNA-reparasjon og DDR proteinene synes i striper av laser lokaliserte ICLs 13, 14. DDR aktiveres av de høye laserintensitet som anvendes for å fremstille DSB kan skyldes isolert eller gruppert skade 15, 16. Følgelig relevansen av resultatene fra disse forsøkene til naturlig forekommende lesjoner til stede med mye lavere konsentrasjon, er usikkert. For å møte lignende spørsmål om psoralen addukt frekvens og avstand i DNA, vi tok fordel av DNA fiberteknologi 17 og immunoquantum prikker. Kvanteprikker er mye lysere enn fluorescerende fargestoffer og er ikke bleket ved eksponering for lys. Dermed er de ofte brukt for enkelt molekyl avbildning 18, en søknad som fluorescerende fargestoffer er utilstrekkelig lys. Individuelle DNA-fibre kan strekkes på glass lysbilder og kan vises ved immunfluorescens mot nukleosidanaloger innarbeidet under inkubering før celle innhøsting. Vi behandlede celler med Dig-psoralen og eksponert ROI til laseren mikro bestråling. Fibre ble fremstilt fra cellene og enkelte Dig-psoralen-addukter kan bli visualisert med de immunoquantum prikker. Å utsette cellene for nukleosidanaloger for forholdsvis kort tid (20-60 min) tillater visning av replikasjonskanalen i nærheten av laser lokalisert ICLs.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Digoxigenin NHS ester</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>11333054001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloro-psoralen</td>
			<td>Berry and Associates</td>
			<td>PS 5000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>diaminoglycol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>369519</td>
			<td>4,7,10-Trioxa-1,13-tridecanediamine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>423550040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A4524</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>5002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TLC plates</td>
			<td>Analtech, Inc.</td>
			<td>P02511</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flass glass column 24/40, 100ml</td>
			<td>Chemglass Life Sciences</td>
			<td>CG-1196-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon T2000_E2 spinning disk confocal microscope, equipped with automated stage and environmental control chamber and plate holder</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td></td>
			<td>With Volocity Software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropoint Galvo&#160;</td>
			<td>Andor Technologies</td>
			<td></td>
			<td>with a Nitrogen pulsed laser&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dye cell</td>
			<td>Andor Technologies</td>
			<td>MP-2250-2-365</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>365 dye</td>
			<td>Andor Technologies</td>
			<td>MP-27-365-DYE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IdU&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>17125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35mm glass botomm plates 1.5 coverslip, 10mm glass diameter, uncoated</td>
			<td>Matek</td>
			<td>P35G-1.5-10-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>microscope slides</td>
			<td>New Comer Supply</td>
			<td>Part # 5070</td>
			<td>New Silane Slides</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti BrdU antibody (IdU)</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>347580</td>
			<td>1 in 40</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat anti BrdU Antibody (CldU)</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab6326</td>
			<td>1 in 200&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti Dig antibody</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>710019</td>
			<td>1 in 200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Q-dot 655 goat anti Rabbit IgG</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>Q-11421MP</td>
			<td>1 in 5000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AF647- goat anti Rat IgG</td>
			<td>Jackson Immunoresearch</td>
			<td>112-605-167</td>
			<td>1 in 100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AF488-goat anti mouse IgG</td>
			<td>Jackson Immunoresearch</td>
			<td>115-545-166</td>
			<td>1 in 100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss epifluorescent microscope A200</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>&#160;with Axiovision software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Q-dot 655 filter</td>
			<td>Chroma</td>
			<td>39107</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

single molecule analysis of laser localized psoralen adducts

DNA-skade Response (DDR) har blitt grundig karakterisert ved studier av dobbeltstrengbrudd (DSB) indusert ved laserbestråling mikro i levende celler. DDR til helix forvrengt kovalente DNA modifikasjoner, inkludert DNA interkjedede tverrbindinger (ICLs), ikke er så godt definert. Vi har studert DDR stimulert av ICLs, lokalisert ved laser fotoaktivering av immunotagged psoralens, i kjernen av levende celler. For å løse grunnleggende spørsmål om addukt distribusjon og replikasjonsgaffelen møter, kombinert vi laser lokalisering med to andre teknologier. DNA-fibre blir ofte brukt for å vise utviklingen av replikasjonsgafler ved immunofluorescens av nukleosidanaloger innarbeidet under korte pulser. Immunoquantum prikker har blitt mye brukt for enkelt molekyl bildebehandling. I den nye fremgangsmåten blir DNA-fibre fra celler som bærer laser lokalisert ICLs spredd ut på objektglass. De merkede ICLs vises med immunoquantum prikker og the inter-lesjon avstander bestemmes. Replication fork kollisjoner med ICLs kan visualiseres og ulike møter mønstre identifisert og kvantifisert.

Laser lokaliserte Dig-TMP (figur 1A) ICLs kan vises ved immunfluorescens mot Dig-tag koblet til psoralen. Selv om laseren kan rettes for å slå på et område av en hvilken som helst kontur, striper er ikke &quot;naturlige&quot; form i celler, og legitime signaler som lett kan skilles fra artifakter på grunn av ikke-spesifikk binding av primære eller sekundære antistoffer. Denne funksjonen er nyttig når du bruker antistoffer på mindre enn perfekt spesifisitet. Et e...

Watch this Scientific Journal Video about Single Molecule Analysis of Laser Localized Psoralen Adducts at JoVE.com

Single Molecule Analysis of Laser Localized Psoralen Adducts

Lasere blir ofte brukt i studier av den cellulære respons på DNA-skade. Imidlertid genererer de lesjoner hvis avstand, frekvens og kollisjoner med replikasjonsgafler er sjelden karakterisert. Her beskriver vi en tilnærming som gjør det mulig å bestemme disse parametrene med laser lokalisert interkjedede kryssbindinger.

Enkelt Molecule Analyse av Laser Lokalisert psoralen addukter

The DNA Damage Response (DDR) has been extensively characterized in studies of double strand breaks (DSBs) induced by laser micro beam irradiation in live ...

Research

JoVE Journal

Genetics

Laser-assisted Cytoplasmic Microinjection in Livestock Zygotes

Laser-assistert Cytoplasmatiske Mikroinjeksjon i Husdyr zygoter

Cytoplasmic microinjection into one-cell embryos is a very powerful technique. As an example, it enables the delivery of genome editing tools that can ...

Metagenomic Analysis of Silage

Metagenomic Analyse av Silo

Metagenomics is defined as the direct analysis of deoxyribonucleic acid (DNA) purified from environmental samples and enables taxonomic identification of ...

Detection of Copy Number Alterations Using Single Cell Sequencing

Påvisning av Kopier nummer Endringer Bruke enkelt celle Sequencing

Detection of genomic changes at single cell resolution is important for characterizing genetic heterogeneity and evolution in normal tissues, cancers, and ...

Mapping RNA-RNA Interactions Globally Using Biotinylated Psoralen

Kartlegging av RNA-RNA-interaksjoner globalt ved bruk av biotinylert psoralen

Knowing how RNAs interact with themselves and with others is key to understanding RNA based gene regulation in the cell. While examples of RNA-RNA ...

Laser Microirradiation to Study In Vivo Cellular Responses to Simple and Complex DNA Damage

Laser Microirradiation to Study In Vivo Cellular Responses to Simple and Complex DNA Damage

Laser Microirradiation å studere i Vivo mobilnettet Svar å enkle og komplekse DNA skade

DNA damage induces specific signaling and repair responses in the cell, which is critical for protection of genome integrity. Laser microirradiation ...

Real-time Analysis of Transcription Factor Binding, Transcription, Translation, and Turnover to Display Global Events During Cellular Activation

Analyse i sanntid av transkripsjon faktor bindende, transkripsjon, oversettelse og omsetning vise globale hendelser under aktivering

Upon activation, cells rapidly change their functional programs and, thereby, their gene expression profile. Massive changes in gene expression occur, for ...

Investigation of Protein Recruitment to DNA Lesions Using 405 Nm Laser Micro-irradiation

Undersøkelse av Protein rekruttering DNA lesjoner med 405 Nm Laser mikro-bestråling

The DNA Damage Response (DDR) uses a plethora of proteins to detect, signal, and repair DNA lesions. Delineating this response is critical to understand ...

Single Molecule Fluorescence In Situ Hybridization (smFISH) Analysis in Budding Yeast Vegetative Growth and Meiosis

Single Molecule Fluorescence In Situ Hybridization smFISH Analysis in Budding Yeast Vegetative Growth and Meiosis

Ett molekyl fluorescens In Situ hybridisering (smFISH) analyse i spirende gjær vegetativ vekst og meiose

Single molecule fluorescence in situ hybridization (smFISH) is a powerful technique to study gene expression in single cells due to its ability to detect ...

Using In Vitro and In-cell SHAPE to Investigate Small Molecule Induced Pre-mRNA Structural Changes

Bruke i Vitro og i celle form å undersøke små molekyl indusert Pre-mRNA strukturelle endringer

In the process of drug development of RNA-targeting small molecules, elucidating the structural changes upon their interactions with target RNA sequences ...