Name: single molecule analysis of laser localized psoralen adducts
Uploaded: 2017-04-20T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Single Molecule Analysis of Laser Localized Psoralen Adducts at JoVE.com

Это исследование было поддержано частично исследовательской программы Intramural НИЗ Национального института по проблемам старения (Z01 AG000746-08) и Фонд исследований Фанкони.

1. Получение Dig-TMP <ol><li> Смешайте 50 мг (0,18 ммоль) 4&#39;-хлорметил-4,5&#39; , 8-trimethylpsoralen и 590 мг (2,7 ммоль) 4,7,10-триокса-1,13-tridecanedi-амина в сухом 25 - мл круглодонную -bottom колбу в атмосфере азота. Добавляют 10 мл толуола и обратным холодильником в течение 12 ч. Растворитель уд?...

<ol>
	<li>Lindahl, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Intrinsic+Fragility+of+DNA+(Nobel+Lecture).">The Intrinsic Fragility of DNA (Nobel Lecture).</a> Angew. Chem. Int. Ed Engl. 55 (30), 8528-8534 (2016).</li><li>Sirbu, B. M., Cortez, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+damage+response:+three+levels+of+DNA+repair+regulation.">DNA damage response: three levels of DNA repair regulation.</a> Cold Spring Harb. Perspect. Biol. 5, a01272 (2013).</li><li>Berkovich, E., Monnat, R. J., Kastan, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+of+protein+dynamics+and+DNA+repair+following+generation+of+DNA+double-strand+breaks+at+defined+genomic+sites.">Assessment of protein dynamics and DNA repair following generation of DNA double-strand breaks at defined genomic sites.</a> Nat. Protoc. 3 (5), 915-922 (2008).</li><li>Rogakou, E. P., Boon, C., Redon, C., Bonner, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Megabase+chromatin+domains+involved+in+DNA+double-strand+breaks+in+vivo.">Megabase chromatin domains involved in DNA double-strand breaks in vivo.</a> J. Cell Biol. 146, 905-916 (1999).</li><li>Lan, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+analysis+of+repair+processes+for+oxidative+DNA+damage+in+mammalian+cells.">In situ analysis of repair processes for oxidative DNA damage in mammalian cells.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 13738-13743 (2004).</li><li>Reynolds, P., Botchway, S. W., Parker, A. W., O'Neill, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatiotemporal+dynamics+of+DNA+repair+proteins+following+laser+microbeam+induced+DNA+damage+-+when+is+a+DSB+not+a+DSB?.">Spatiotemporal dynamics of DNA repair proteins following laser microbeam induced DNA damage - when is a DSB not a DSB?.</a> Mutat. Res. 756, 14-20 (2013).</li><li>Vilenchik, M. M., Knudson, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endogenous+DNA+double-strand+breaks:+production,+fidelity+of+repair,+and+induction+of+cancer.">Endogenous DNA double-strand breaks: production, fidelity of repair, and induction of cancer.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100, 12871-12876 (2003).</li><li>Vilenchik, M. M., Knudson, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Radiation+dose-rate+effects,+endogenous+DNA+damage,+and+signaling+resonance.">Radiation dose-rate effects, endogenous DNA damage, and signaling resonance.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103, 17874-17879 (2006).</li><li>Aguilera, A., Garcia-Muse, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Causes+of+genome+instability.">Causes of genome instability.</a> Annu. Rev. Genet. 47, 1-32 (2013).</li><li>Swenberg, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endogenous+versus+exogenous+DNA+adducts:+their+role+in+carcinogenesis,+epidemiology,+and+risk+assessment.">Endogenous versus exogenous DNA adducts: their role in carcinogenesis, epidemiology, and risk assessment.</a> Toxicol. Sci. 120 (1), S130-S145 (2011).</li><li>Eichman, B. F., Mooers, B. H., Alberti, M., Hearst, J. E., Ho, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+crystal+structures+of+psoralen+cross-linked+DNAs:+drug-dependent+formation+of+holliday+junctions.">The crystal structures of psoralen cross-linked DNAs: drug-dependent formation of holliday junctions.</a> J. Mol. Biol. 308, 15-26 (2001).</li><li>Lai, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+analysis+of+DNA+interstrand+cross-links+and+monoadducts+formed+in+human+cells+induced+by+psoralens+and+UVA+irradiation.">Quantitative analysis of DNA interstrand cross-links and monoadducts formed in human cells induced by psoralens and UVA irradiation.</a> Anal. Chem. 80, 8790-8798 (2008).</li><li>Thazhathveetil, A. K., Liu, S. T., Indig, F. E., Seidman, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Psoralen+conjugates+for+visualization+of+genomic+interstrand+cross-links+localized+by+laser+photoactivation.">Psoralen conjugates for visualization of genomic interstrand cross-links localized by laser photoactivation.</a> Bioconjug. Chem. 18, 431-437 (2007).</li><li>Muniandy, P. A., Thapa, D., Thazhathveetil, A. K., Liu, S. T., Seidman, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Repair+of+laser-localized+DNA+interstrand+cross-links+in+G1+phase+mammalian+cells.">Repair of laser-localized DNA interstrand cross-links in G1 phase mammalian cells.</a> J Biol. Chem. 284 (41), 27908-27917 (2009).</li><li>Nowsheen, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accumulation+of+oxidatively+induced+clustered+DNA+lesions+in+human+tumor+tissues.">Accumulation of oxidatively induced clustered DNA lesions in human tumor tissues.</a> Mutat. Res. 674, 131-136 (2009).</li><li>Meyer, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clustered+DNA+damage+induces+pan-nuclear+H2AX+phosphorylation+mediated+by+ATM+and+DNA-PK.">Clustered DNA damage induces pan-nuclear H2AX phosphorylation mediated by ATM and DNA-PK.</a> Nucl Acids Res. 41, 6109-6118 (2013).</li><li>Schwab, R. A., Niedzwiedz, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+DNA+replication+in+the+vertebrate+model+system+DT40+using+the+DNA+fiber+technique.">Visualization of DNA replication in the vertebrate model system DT40 using the DNA fiber technique.</a> J Vis. Exp. (56), e3255 (2011).</li><li>Kad, N. M., Wang, H., Kennedy, G. G., Warshaw, D. M., Van, H. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Collaborative+dynamic+DNA+scanning+by+nucleotide+excision+repair+proteins+investigated+by+single-+molecule+imaging+of+quantum-dot-labeled+proteins.">Collaborative dynamic DNA scanning by nucleotide excision repair proteins investigated by single- molecule imaging of quantum-dot-labeled proteins.</a> Mol. Cell. 37 (5), 702-713 (2010).</li><li>Spielmann, H. P., Sastry, S. S., Hearst, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+the+large-scale+synthesis+of+psoralen+furan-side+monoadducts+and+diadducts.">Methods for the large-scale synthesis of psoralen furan-side monoadducts and diadducts.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89 (10), 4514-4518 (1992).</li><li>Huang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+DNA+translocase+FANCM/MHF+promotes+replication+traverse+of+DNA+interstrand+crosslinks.">The DNA translocase FANCM/MHF promotes replication traverse of DNA interstrand crosslinks.</a> Mol. Cell. 52, 434-446 (2013).</li><li>Huang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+Molecule+Analysis+of+Laser+Localized+Interstrand+Crosslinks.">Single Molecule Analysis of Laser Localized Interstrand Crosslinks.</a> Front Genet. 7, 84 (2016).</li><li>Ciccia, A., Elledge, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+DNA+damage+response:+making+it+safe+to+play+with+knives.">The DNA damage response: making it safe to play with knives.</a> Mol. Cell. 40, 179-204 (2010).</li><li>Mori, T., Matsunaga, T., Hirose, T., Nikaido, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+a+monoclonal+antibody+recognizing+ultraviolet+light-induced+(6-4)+photoproducts.">Establishment of a monoclonal antibody recognizing ultraviolet light-induced (6-4) photoproducts.</a> Mutat. Res. 194, 263-270 (1988).</li><li>Poirier, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antisera+specific+for+carcinogen-DNA+adducts+and+carcinogen-modified+DNA:+applications+for+detection+of+xenobiotics+in+biological+samples.">Antisera specific for carcinogen-DNA adducts and carcinogen-modified DNA: applications for detection of xenobiotics in biological samples.</a> Mutat. Res. 288, 31-38 (1993).</li><li>Henderson, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+G-quadruplex+DNA+in+mammalian+cells.">Detection of G-quadruplex DNA in mammalian cells.</a> Nucleic Acids Res. 42, 860-869 (2014).</li></ol>

Технология лазерной локализации требует использования адгезивных клеток с ядрами, которые видны при ярком микроскопии. Мы попытались прикрепить неадгезированных клетки, такие как первичные лимфоциты, или свободно присоединенные культивируемые клетки, такие как AD293, к стеклянной пов?...

ДНК находится под постоянным нападением от экзогенных агентов, таких как облучение ультрафиолетового света,, токсины окружающей среды, продукты сгорания и т.д. Кроме того, он также атакован эндогенными радикальных частицами, полученных путем окислительного метаболизма. Все они имеют потенциал , чтобы химически или физически нарушить целостность ДНК 1. Возмущения в геноме может активировать ДНК Damage Response (DDR), а набор и пост трансляционной модификации каскада с сотнями, если не тысячи, белков и микроРНК, участвующих в репарации повреждений, регуляции клеточного цикла, апоптоза, старении и воспалительных путей 2. Большая часть нашей информации о DDR в исследованиях с DSBs. Это в значительной степени из - за наличие технологий для внедрения брейков, включая последовательность конкретных разрывы, в геномной ДНК в живых клетках 3. Кроме того, propensitу обрывов, чтобы вызвать фокусы DDR белков, которые могут быть отображены с помощью иммунофлуоресценции, было очень полезно для определения кинетики и требований реагирующих белков. Одной из ключевых технологий для изучения DDR был представлен Боннэр и коллегами, которые использовали лазерный луч направить полосу DSBs в «области интереса» (ROI) в ядрах живых клеток 4. В сущности, они создали длинный фокус, в котором белки DDR могут быть определены с помощью иммунофлюоресценции. Это было проиллюстрировано их демонстрацией сильной полосы фосфорилированного гистона H2AX (γ-H2AX) в лазерном воздействии клеток. С тех пор лазерный подход был использован в многочисленных исследованиях DDR, индуцированных DSBs. Хотя мощный и популярный, и источник драматических образов иммунофлюоресценции, следует отметить, что в большинстве опытов интенсивности лазерного излучения регулируют таким образом, чтобы наблюдаемые результаты, не заботясь о личности поражения,плотность, или промежуток. На самом деле, это может быть трудно сделать эти оценки. Таким образом , они в значительной степени игнорируются, несмотря на множественность поражений , введенных в ДНК с помощью лазеров 5. Это способствует много противоречий в литературе 6. В отличие от DSBs, большинство химических модификаций ДНК не стимулируют образование дискретных очагов DDR белков. Это очень важно в свете современного понимания частоты поражения. Было подсчитано , что человеческие клетки в культуре несут целых 50 DSBs за клеточный цикл, сформированных в основном во время S фазы 7, 8, 9. Меньшее образуются в не пролиферирующих клеток. Это контрастирует с количеством потерь нуклеотидных или модификации событий, которые в десятки тысяч на клетку / день 1, 10. Таким образом, мы знаем больше всегоДДР индуцируется событиями, которые являются относительно редких, и гораздо меньше о тех, индуцированных спирали искажая поражения, которые в совокупности являются гораздо более распространенным явлением. Для решения вопросов о клеточном ответе на ковалентные модификации геномной ДНК, мы хотели работать с спиралью искажая ДНК аддукта, который имел присущую DDR индукции активности. Кроме того, для облегчения опытно-конструкторских и интерпретации мы были заинтересованы в структуре которого введение можно контролировать по времени и был поддается визуализации. Соответственно, мы разработали стратегию, основанную на псоралене. Псоралено хорошо охарактеризованы светочувствительные интеркаляторы ДНК, благоприятствующие 5&#39; TA: AT сайтов. В отличии от других сшивающих агентов, таких как азот горчица и митомицин C (MMC) они не являются ДНК-реактивными, если не подвергаются воздействию длинноволнового ультрафиолетового (УФ) света. Интеркалированные молекулы реагируют с основаниями тимина на противоположных нити для производства спирали искажая interstrand сшивок (ICL,) 11. С триметили псорально , используемые в наших экспериментах большинство продуктов ICLS, относительно мало monoadducts генерируется (менее 10%) 12 и intrastrand сшивки между соседними основаниями на одной нити не образуются. Поскольку они являются мощными блоками для репликации и транскрипции, псорально и других сшивающих агентов, как цис-платина и MMC, которые обычно используется в химиотерапии. Таким образом, псорально включено исследование, которые следовали за активацию DDR с помощью спиральной искажающей структуры, а также обеспечили понимание клеточного ответ на соединение с клинической значимостью. Мы синтезировали реагент, в котором триметил псорален был связан с дигоксигенином (Dig), растительный стерин не найден в клетках млекопитающих и часто используется в качестве immunotag. Требование фотоактивации позволяет локализацию с помощью лазерного света (365 нм) псорален ICL, в определенной ROI в ядрах в живых клетках. Они могут быть отображены IMMunofluorescence против тега Dig. Репарации ДНК и белки DDR появились в полосах лазера локализованных ICLS 13, 14. DDR активируется с помощью лазера высокой интенсивности , используемой для производства DSBs может быть связан с изолированным или кластерным повреждением 15, 16. Следовательно, актуальность результатов этих экспериментов в природе поражения, присутствующие в значительно меньшей концентрации, является неопределенным. Для решения подобных вопросов о псоралена частоте аддукта и расстоянии в ДНК, мы воспользовались ДНК волоконной технологии 17 и immunoquantum точек. Квантовые точки намного ярче, чем флуоресцентные красители и не отбеливают под воздействием света. Таким образом , они часто используются для визуализации одной молекулы 18, приложение , для которого флуоресцентные красители являются недостаточно яркими. Отдельные волокна ДНК могут быть растянуты на гLass слайды и могут быть отображены с помощью иммунофлуоресценции против аналогов нуклеозидов, включенных во инкубационных перед клеточным урожаем. Мы обрабатывали клетки с Dig-псораленом и разоблачили ROI для лазерной микро-облучения. Волокна были получены из клеток и отдельных Dig-псорален аддуктов могут быть визуализированы с immunoquantum точками. Воздействие на клетки аналогам нуклеозидов в течение относительно короткого времени (20-60 мин) позволяет отображать трактов репликации в непосредственной близости от лазера локализуется МКСТ.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Digoxigenin NHS ester</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>11333054001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloro-psoralen</td>
			<td>Berry and Associates</td>
			<td>PS 5000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>diaminoglycol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>369519</td>
			<td>4,7,10-Trioxa-1,13-tridecanediamine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>423550040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A4524</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>5002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TLC plates</td>
			<td>Analtech, Inc.</td>
			<td>P02511</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flass glass column 24/40, 100ml</td>
			<td>Chemglass Life Sciences</td>
			<td>CG-1196-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon T2000_E2 spinning disk confocal microscope, equipped with automated stage and environmental control chamber and plate holder</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td></td>
			<td>With Volocity Software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropoint Galvo&#160;</td>
			<td>Andor Technologies</td>
			<td></td>
			<td>with a Nitrogen pulsed laser&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dye cell</td>
			<td>Andor Technologies</td>
			<td>MP-2250-2-365</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>365 dye</td>
			<td>Andor Technologies</td>
			<td>MP-27-365-DYE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IdU&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>17125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35mm glass botomm plates 1.5 coverslip, 10mm glass diameter, uncoated</td>
			<td>Matek</td>
			<td>P35G-1.5-10-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>microscope slides</td>
			<td>New Comer Supply</td>
			<td>Part # 5070</td>
			<td>New Silane Slides</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti BrdU antibody (IdU)</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>347580</td>
			<td>1 in 40</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat anti BrdU Antibody (CldU)</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab6326</td>
			<td>1 in 200&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti Dig antibody</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>710019</td>
			<td>1 in 200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Q-dot 655 goat anti Rabbit IgG</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>Q-11421MP</td>
			<td>1 in 5000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AF647- goat anti Rat IgG</td>
			<td>Jackson Immunoresearch</td>
			<td>112-605-167</td>
			<td>1 in 100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AF488-goat anti mouse IgG</td>
			<td>Jackson Immunoresearch</td>
			<td>115-545-166</td>
			<td>1 in 100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss epifluorescent microscope A200</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>&#160;with Axiovision software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Q-dot 655 filter</td>
			<td>Chroma</td>
			<td>39107</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

single molecule analysis of laser localized psoralen adducts

Повреждение ДНК реагирование (РДР) было широко охарактеризовано в исследованиях двойных разрывов ДНК (DSBs), индуцированных лазерный микро облучением пучка в живых клетках. DDR, чтобы спираль искажая ковалентные модификации ДНК, в том числе interstrand сшивок ДНК (МКСТ), не так хорошо определены. Мы изучали DDR стимулируются ICL, локализованных с помощью лазерной фотоактивации immunotagged псораленов, в ядрах живых клеток. Для решения фундаментальных вопросов о распределении аддукта и вилка репликации столкновениях, мы совместили локализацию лазера с двумя другими технологиями. ДНК-волокна часто используются для отображения хода вилки репликации с помощью иммунофлуоресценции аналогов нуклеозидов, включенных в течение коротких импульсов. Immunoquantum точка была широко использована для одного изображения молекулы. В новом подходе, ДНК-волокна из клеток, несущих лазерные локализованы ICLS распространяются на предметные стекла микроскопа. В помеченном МКСТЕ отображается immunoquantum точек и йе между поражением расстояние определяется. Репликация вилочные столкновения с ICL, можно визуализировать и различные модели сталкиваются с идентифицированы и количественно.

Лазерные локализованные Диг-ТМП (Фигура 1А) ICLS могут быть отображены с помощью иммунофлуоресценции против DIG-тега , связанного с псорален. Несмотря на то, лазер может быть направлена ​​на удар в зоне любого контура, полосы не являются «естественной» формой в к...

Watch this Scientific Journal Video about Single Molecule Analysis of Laser Localized Psoralen Adducts at JoVE.com

Single Molecule Analysis of Laser Localized Psoralen Adducts

Лазеры часто используются в исследованиях клеточного ответа на повреждение ДНК. Тем не менее, они генерируют повреждения которых расстояние, частоту и столкновения с вилками репликации редко характеризуются. Здесь мы описываем подход, который позволяет определить эти параметры с лазерными локализованы interstrand сшивок.

Одно Молекула Анализ лазерных локализованные псоральны аддукты

The DNA Damage Response (DDR) has been extensively characterized in studies of double strand breaks (DSBs) induced by laser micro beam irradiation in live ...

Research

JoVE Journal

Genetics

Laser-assisted Cytoplasmic Microinjection in Livestock Zygotes

Помощью лазера цитоплазматических микроинъекции в животноводстве зиготы

Cytoplasmic microinjection into one-cell embryos is a very powerful technique. As an example, it enables the delivery of genome editing tools that can ...

Metagenomic Analysis of Silage

Метагеномной Анализ силос

Metagenomics is defined as the direct analysis of deoxyribonucleic acid (DNA) purified from environmental samples and enables taxonomic identification of ...

Detection of Copy Number Alterations Using Single Cell Sequencing

Обнаружение Copy Number Изменений Использование Single Cell Секвенирование

Detection of genomic changes at single cell resolution is important for characterizing genetic heterogeneity and evolution in normal tissues, cancers, and ...

Mapping RNA-RNA Interactions Globally Using Biotinylated Psoralen

Сопоставление взаимодействия РНК-РНК в глобальном масштабе с использованием биотинилированного псоралена

Knowing how RNAs interact with themselves and with others is key to understanding RNA based gene regulation in the cell. While examples of RNA-RNA ...

Laser Microirradiation to Study In Vivo Cellular Responses to Simple and Complex DNA Damage

Laser Microirradiation to Study In Vivo Cellular Responses to Simple and Complex DNA Damage

Лазерная Microirradiation учиться в Vivo клеточных реакций на повреждение ДНК простых и сложных

DNA damage induces specific signaling and repair responses in the cell, which is critical for protection of genome integrity. Laser microirradiation ...

Real-time Analysis of Transcription Factor Binding, Transcription, Translation, and Turnover to Display Global Events During Cellular Activation

Анализ в реальном времени транскрипционного фактора привязки, транскрипция, перевод и оборот для отображения глобальных событий в процессе активации клеточного

Upon activation, cells rapidly change their functional programs and, thereby, their gene expression profile. Massive changes in gene expression occur, for ...

Investigation of Protein Recruitment to DNA Lesions Using 405 Nm Laser Micro-irradiation

Расследование белка вербовки для поражения ДНК с помощью 405 нм лазер микро облучения

The DNA Damage Response (DDR) uses a plethora of proteins to detect, signal, and repair DNA lesions. Delineating this response is critical to understand ...

Single Molecule Fluorescence In Situ Hybridization (smFISH) Analysis in Budding Yeast Vegetative Growth and Meiosis

Single Molecule Fluorescence In Situ Hybridization smFISH Analysis in Budding Yeast Vegetative Growth and Meiosis

Одной молекулы флуоресценции In Situ гибридизация (smFISH) анализ многообещающий вегетативного роста дрожжей и мейоз

Single molecule fluorescence in situ hybridization (smFISH) is a powerful technique to study gene expression in single cells due to its ability to detect ...

Using In Vitro and In-cell SHAPE to Investigate Small Molecule Induced Pre-mRNA Structural Changes

Использование в пробирке и в клеток форму расследовать малые молекулы индуцированной пре мРНК структурные изменения

In the process of drug development of RNA-targeting small molecules, elucidating the structural changes upon their interactions with target RNA sequences ...