Name: single molecule analysis of laser localized psoralen adducts
Uploaded: 2017-04-20T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Single Molecule Analysis of Laser Localized Psoralen Adducts at JoVE.com

Denna forskning stöds delvis av Intramural forskningsprogram NIH, National Institute on Aging (Z01 AG000746-08) och fanconis anemi Research Fund.

1. Framställning av Dig-TMP <ol><li> Blanda 50 mg (0,18 mmol) 4&#39;-klormetyl-4,5&#39; , 8-trimetylpsoralen och 590 mg (2,7 mmol) av 4,7,10-trioxa-1,13-tridecanedi-amin i en torr 25 ml rund -bottom kolv under kväve. Lägga 10 ml toluen och återflöde i 12 h. Avlägsna lösningsmedlet i en rotationsindunstare under reducerat tryck. <ol><li> Rena återstoden med flash-kolonnkromatografi över silikagel. Eluera kolonnen med kloroform, metanol och 28% ammoniaklösning (9: 1: 0,5). Indunsta lösningsme...

<ol>
	<li>Lindahl, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Intrinsic+Fragility+of+DNA+(Nobel+Lecture).">The Intrinsic Fragility of DNA (Nobel Lecture).</a> Angew. Chem. Int. Ed Engl. 55 (30), 8528-8534 (2016).</li><li>Sirbu, B. M., Cortez, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+damage+response:+three+levels+of+DNA+repair+regulation.">DNA damage response: three levels of DNA repair regulation.</a> Cold Spring Harb. Perspect. Biol. 5, a01272 (2013).</li><li>Berkovich, E., Monnat, R. J., Kastan, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+of+protein+dynamics+and+DNA+repair+following+generation+of+DNA+double-strand+breaks+at+defined+genomic+sites.">Assessment of protein dynamics and DNA repair following generation of DNA double-strand breaks at defined genomic sites.</a> Nat. Protoc. 3 (5), 915-922 (2008).</li><li>Rogakou, E. P., Boon, C., Redon, C., Bonner, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Megabase+chromatin+domains+involved+in+DNA+double-strand+breaks+in+vivo.">Megabase chromatin domains involved in DNA double-strand breaks in vivo.</a> J. Cell Biol. 146, 905-916 (1999).</li><li>Lan, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+analysis+of+repair+processes+for+oxidative+DNA+damage+in+mammalian+cells.">In situ analysis of repair processes for oxidative DNA damage in mammalian cells.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 13738-13743 (2004).</li><li>Reynolds, P., Botchway, S. W., Parker, A. W., O'Neill, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatiotemporal+dynamics+of+DNA+repair+proteins+following+laser+microbeam+induced+DNA+damage+-+when+is+a+DSB+not+a+DSB?.">Spatiotemporal dynamics of DNA repair proteins following laser microbeam induced DNA damage - when is a DSB not a DSB?.</a> Mutat. Res. 756, 14-20 (2013).</li><li>Vilenchik, M. M., Knudson, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endogenous+DNA+double-strand+breaks:+production,+fidelity+of+repair,+and+induction+of+cancer.">Endogenous DNA double-strand breaks: production, fidelity of repair, and induction of cancer.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100, 12871-12876 (2003).</li><li>Vilenchik, M. M., Knudson, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Radiation+dose-rate+effects,+endogenous+DNA+damage,+and+signaling+resonance.">Radiation dose-rate effects, endogenous DNA damage, and signaling resonance.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103, 17874-17879 (2006).</li><li>Aguilera, A., Garcia-Muse, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Causes+of+genome+instability.">Causes of genome instability.</a> Annu. Rev. Genet. 47, 1-32 (2013).</li><li>Swenberg, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endogenous+versus+exogenous+DNA+adducts:+their+role+in+carcinogenesis,+epidemiology,+and+risk+assessment.">Endogenous versus exogenous DNA adducts: their role in carcinogenesis, epidemiology, and risk assessment.</a> Toxicol. Sci. 120 (1), S130-S145 (2011).</li><li>Eichman, B. F., Mooers, B. H., Alberti, M., Hearst, J. E., Ho, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+crystal+structures+of+psoralen+cross-linked+DNAs:+drug-dependent+formation+of+holliday+junctions.">The crystal structures of psoralen cross-linked DNAs: drug-dependent formation of holliday junctions.</a> J. Mol. Biol. 308, 15-26 (2001).</li><li>Lai, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+analysis+of+DNA+interstrand+cross-links+and+monoadducts+formed+in+human+cells+induced+by+psoralens+and+UVA+irradiation.">Quantitative analysis of DNA interstrand cross-links and monoadducts formed in human cells induced by psoralens and UVA irradiation.</a> Anal. Chem. 80, 8790-8798 (2008).</li><li>Thazhathveetil, A. K., Liu, S. T., Indig, F. E., Seidman, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Psoralen+conjugates+for+visualization+of+genomic+interstrand+cross-links+localized+by+laser+photoactivation.">Psoralen conjugates for visualization of genomic interstrand cross-links localized by laser photoactivation.</a> Bioconjug. Chem. 18, 431-437 (2007).</li><li>Muniandy, P. A., Thapa, D., Thazhathveetil, A. K., Liu, S. T., Seidman, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Repair+of+laser-localized+DNA+interstrand+cross-links+in+G1+phase+mammalian+cells.">Repair of laser-localized DNA interstrand cross-links in G1 phase mammalian cells.</a> J Biol. Chem. 284 (41), 27908-27917 (2009).</li><li>Nowsheen, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accumulation+of+oxidatively+induced+clustered+DNA+lesions+in+human+tumor+tissues.">Accumulation of oxidatively induced clustered DNA lesions in human tumor tissues.</a> Mutat. Res. 674, 131-136 (2009).</li><li>Meyer, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clustered+DNA+damage+induces+pan-nuclear+H2AX+phosphorylation+mediated+by+ATM+and+DNA-PK.">Clustered DNA damage induces pan-nuclear H2AX phosphorylation mediated by ATM and DNA-PK.</a> Nucl Acids Res. 41, 6109-6118 (2013).</li><li>Schwab, R. A., Niedzwiedz, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+DNA+replication+in+the+vertebrate+model+system+DT40+using+the+DNA+fiber+technique.">Visualization of DNA replication in the vertebrate model system DT40 using the DNA fiber technique.</a> J Vis. Exp. (56), e3255 (2011).</li><li>Kad, N. M., Wang, H., Kennedy, G. G., Warshaw, D. M., Van, H. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Collaborative+dynamic+DNA+scanning+by+nucleotide+excision+repair+proteins+investigated+by+single-+molecule+imaging+of+quantum-dot-labeled+proteins.">Collaborative dynamic DNA scanning by nucleotide excision repair proteins investigated by single- molecule imaging of quantum-dot-labeled proteins.</a> Mol. Cell. 37 (5), 702-713 (2010).</li><li>Spielmann, H. P., Sastry, S. S., Hearst, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+the+large-scale+synthesis+of+psoralen+furan-side+monoadducts+and+diadducts.">Methods for the large-scale synthesis of psoralen furan-side monoadducts and diadducts.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89 (10), 4514-4518 (1992).</li><li>Huang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+DNA+translocase+FANCM/MHF+promotes+replication+traverse+of+DNA+interstrand+crosslinks.">The DNA translocase FANCM/MHF promotes replication traverse of DNA interstrand crosslinks.</a> Mol. Cell. 52, 434-446 (2013).</li><li>Huang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+Molecule+Analysis+of+Laser+Localized+Interstrand+Crosslinks.">Single Molecule Analysis of Laser Localized Interstrand Crosslinks.</a> Front Genet. 7, 84 (2016).</li><li>Ciccia, A., Elledge, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+DNA+damage+response:+making+it+safe+to+play+with+knives.">The DNA damage response: making it safe to play with knives.</a> Mol. Cell. 40, 179-204 (2010).</li><li>Mori, T., Matsunaga, T., Hirose, T., Nikaido, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+a+monoclonal+antibody+recognizing+ultraviolet+light-induced+(6-4)+photoproducts.">Establishment of a monoclonal antibody recognizing ultraviolet light-induced (6-4) photoproducts.</a> Mutat. Res. 194, 263-270 (1988).</li><li>Poirier, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antisera+specific+for+carcinogen-DNA+adducts+and+carcinogen-modified+DNA:+applications+for+detection+of+xenobiotics+in+biological+samples.">Antisera specific for carcinogen-DNA adducts and carcinogen-modified DNA: applications for detection of xenobiotics in biological samples.</a> Mutat. Res. 288, 31-38 (1993).</li><li>Henderson, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+G-quadruplex+DNA+in+mammalian+cells.">Detection of G-quadruplex DNA in mammalian cells.</a> Nucleic Acids Res. 42, 860-869 (2014).</li></ol>

Laserlokaliseringsteknik kräver användning av fastsittande celler med kärnor som är synliga i starkt fält mikroskopi. Vi har försökt att fästa icke-adherenta celler, såsom primära lymfocyter, eller löst vidhäftande odlade celler, såsom AD293, vid glasytan med cellklisterberedningar såsom polylysin eller kollagen, eller mer komplexa blandningar. Även om dessa behandlingar kan binda cellerna till ytan, finner vi att de i allmänhet hålla rundade vilket gör det mycket svårt att fokusera i kärnorna. Dessu...

DNA är under konstant angrepp från exogena medel, såsom strålning, ultraviolett ljus, miljögifter, förbränningsprodukter, etc. Dessutom är det också attackeras av endogena radikaler producerade av oxidativ metabolism. Alla dessa har potential att kemiskt eller fysikaliskt störa integriteten av DNA 1. Störningar i genomet kan aktivera DNA-skador Response (DDR), en rekrytering och posttranslationell modifiering kaskad med hundratals, om inte tusentals, proteiner och mikroRNA involverade i lesion reparation, reglering av cellcykeln, apoptos, senescens, och inflammatoriska reaktionsvägar 2. De flesta av våra uppgifter om DDR kommer från studier med DSB. Detta är till stor del på grund av tillgängligheten av teknik för att införa pauser, inklusive sekvensspecifika raster, i genomiskt DNA i levande celler 3. Dessutom, propensity pauser för att framkalla härdar av DDR proteiner, som kan visas genom immunofluorescens, har varit till stor hjälp för att identifiera kinetiken och krav svara proteiner. En av de viktigaste teknikerna för att studera DDR infördes av Bonner och kollegor, som använde en laserstråle för att rikta en rand av DSB i en &quot;Region of Interest&quot; (ROI) i kärnan av levande celler 4. I själva verket skapade de en lång fokus vilka proteiner i DDR kunde identifieras genom immunofluorescens. Detta illustrerades av sin demonstration av den starka rand av fosforylerad histon H2AX (γ-H2AX) i laser exponerade celler. Sedan dess har laser tillvägagångssätt använts i ett flertal studier av DDR inducerade av DSB. Även kraftfulla och populära, och källan till dramatiska immunofluorescens bilder, bör det noteras att laserintensiteten i de flesta experiment justeras för att åstadkomma observer resultat, utan oro för skada identitet,densitet, eller avståndet. I själva verket kan det vara svårt att göra dessa beräkningar. De är således till stor del ignoreras, trots mångfalden av lesioner som införs i DNA genom lasrar 5. Detta bidrar till de många motsägelser i litteraturen 6. I motsats till DSBs, de flesta kemiska modifikationer av DNA som inte stimulera bildandet av diskreta foci av DDR-proteiner. Detta är viktigt med tanke på vår nuvarande förståelse av skada frekvenser. Det har uppskattats att humana celler i odling ådra så många som 50 DSB per cellcykeln, bildade i stort sett under S-fas 7, 8, 9. Färre är formade i icke-prolifererande celler. Detta står i kontrast med antalet nukleobas förluster eller modifierings händelser, som i de tiotusentals per cell / dag 1, 10. Således vet vi mest omDDR induceras av händelser som är relativt sällsynta, och mycket mindre om de som induceras av spiral snedvrida skador som sammanlagt är betydligt vanligare. För att ta itu med frågor om det cellulära svaret på Kovalenta modifieringar av genomiskt DNA, ville vi arbeta med en helix förvränga DNA-addukt som hade inneboende DDR induktionsaktivitet. Dessutom för att underlätta experimentell design och tolkning vi var intresserade av en struktur vars inledning kunde kontrolleras med avseende på tid och var mottagliga för visualisering. Således har vi utvecklat en strategi baserad på psoralen. Psoralener är väl karakteriserade fotoaktiva DNA-interkalatorer som gynnar 5&#39; TA: AT webbplatser. Till skillnad från andra tvärbindningsmedel, såsom kvävesenaper och mitomycin C (MMC) de är inte DNA reaktiva såvida exponeras för långvågig UV (UVA) ljus. De inskjutna molekyler reagerar med tymin baser på motsatta strängar för att producera spiral snedvrida interstrand tvärbindningar (ICLs) 11. Med trimetyl psoralen som används i våra experiment de flesta produkterna är ICLs, relativt få monoaddukter genereras (mindre än 10%) 12 och intrastrand tvärbindningar mellan intilliggande baser på en sträng inte är bildade. Eftersom de är kraftfulla block till replikation och transkription, psoralen och andra tvärbindningsmedel, såsom cis-platina och MMC, används ofta i kemoterapi. Sålunda psoralen aktiverade studier som följde aktiveringen av DDR genom en spiral förvränga struktur, och även anordnade insikt i den cellulära responsen till en förening med klinisk betydelse. Vi syntetiserade ett reagens i vilket trimetyl psoralen var kopplat till digoxigenin (DIG), en växtsterol som inte finns i däggdjursceller och används ofta som en immunotag. Kravet på fotoaktivering medger lokalisering av laserljus (365 nm) av psoralen ICLs i definierade ROI i kärnor i levande celler. Dessa kan visas genom IMMunofluorescence mot Dig taggen. DNA-reparation och DDR-proteiner dök upp i ränder av laser lokaliserade ICLs 13, 14. DDR aktiveras av de höga laserintensiteter används för att producera DSB skulle kunna bero på isolerad eller klustrade skada 15, 16. Följaktligen relevansen av resultaten från dessa experiment för att naturligt förekommande lesioner, närvarande vid mycket lägre koncentration, är osäkert. Att ta itu med liknande frågor om psoralen addukt frekvens och avstånd i DNA, tog vi fördel av DNA-fiberteknologi 17 och immunoquantum prickar. Kvantprickar är mycket ljusare än fluorescerande färger och inte bleks av exponering för ljus. De är således ofta för enda molekyl avbildning 18, en tillämpning för vilken fluorescerande färgämnen är otillräckligt ljus. Individuella DNA fibrer kan sträckas på glass diabilder och kan visas genom immunofluorescens mot nukleosidanaloger inkorporerade under inkubationer före cellskörd. Vi behandlade celler med Dig-psoralen och exponeras ROI till lasermikro bestrålning. Fibrer framställdes från cellerna och enskilda gräver-psoralen addukter kunde visualiseras med immunoquantum prickar. Exponering av cellerna för nukleosidanaloger under relativt korta tider (20-60 min) möjliggör visning av replikerings skrifter i närheten av laser lokaliserad ICLs.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Digoxigenin NHS ester</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>11333054001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloro-psoralen</td>
			<td>Berry and Associates</td>
			<td>PS 5000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>diaminoglycol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>369519</td>
			<td>4,7,10-Trioxa-1,13-tridecanediamine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>423550040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A4524</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>5002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TLC plates</td>
			<td>Analtech, Inc.</td>
			<td>P02511</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flass glass column 24/40, 100ml</td>
			<td>Chemglass Life Sciences</td>
			<td>CG-1196-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon T2000_E2 spinning disk confocal microscope, equipped with automated stage and environmental control chamber and plate holder</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td></td>
			<td>With Volocity Software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropoint Galvo&#160;</td>
			<td>Andor Technologies</td>
			<td></td>
			<td>with a Nitrogen pulsed laser&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dye cell</td>
			<td>Andor Technologies</td>
			<td>MP-2250-2-365</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>365 dye</td>
			<td>Andor Technologies</td>
			<td>MP-27-365-DYE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IdU&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>17125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35mm glass botomm plates 1.5 coverslip, 10mm glass diameter, uncoated</td>
			<td>Matek</td>
			<td>P35G-1.5-10-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>microscope slides</td>
			<td>New Comer Supply</td>
			<td>Part # 5070</td>
			<td>New Silane Slides</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti BrdU antibody (IdU)</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>347580</td>
			<td>1 in 40</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat anti BrdU Antibody (CldU)</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab6326</td>
			<td>1 in 200&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti Dig antibody</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>710019</td>
			<td>1 in 200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Q-dot 655 goat anti Rabbit IgG</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>Q-11421MP</td>
			<td>1 in 5000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AF647- goat anti Rat IgG</td>
			<td>Jackson Immunoresearch</td>
			<td>112-605-167</td>
			<td>1 in 100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AF488-goat anti mouse IgG</td>
			<td>Jackson Immunoresearch</td>
			<td>115-545-166</td>
			<td>1 in 100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss epifluorescent microscope A200</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>&#160;with Axiovision software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Q-dot 655 filter</td>
			<td>Chroma</td>
			<td>39107</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

single molecule analysis of laser localized psoralen adducts

DNA Damage Response (DDR) har i stor utsträckning kännetecknad av studier av dubbelsträngsbrott (DSB) inducerade av lasermikrostråle bestrålning i levande celler. DDR att helix snedvrida kovalenta DNA-modifieringar, inklusive interstrand DNA tvärbindningar (ICLs), inte är lika väl definierade. Vi har studerat DDR stimuleras av ICLs, lokaliseras genom laserfotoaktivering av immunotagged psoralener, i kärnan av levande celler. För att ta itu med grundläggande frågor om distributions addukt och replikationen möten, vi kombinerat laser lokalisering med två andra tekniker. DNA-fibrer används ofta för att visa förloppet för replikationsgafflar genom immunofluorescens av nukleosidanaloger inkorporerade under korta pulser. Immunoquantum punkter har i stor utsträckning använts för enda molekyl avbildning. I den nya metoden, är DNA-fibrer från celler som bär laser lokaliserade ICLs spreds ut på objektglas. De märkta ICLs visas med immunoquantum prickar och the inter lesion avstånd bestäms. Replikationsgaffeln kollisioner med ICLs kan visualiseras och olika möter mönster identifieras och kvantifieras.

Laser lokaliserade Dig-TMP (Figur 1A) ICLs kan visas genom immunofluorescens mot Dig-tagg kopplad till psoralen. Även om lasern kan riktas att slå i ett område i varje kontur, band inte är &quot;naturliga&quot; former i celler, och legitima signaler kan lätt särskiljas från artefakter på grund av icke-specifik bindning av primära eller sekundära antikroppar. Den här funktionen är användbar när man använder antikroppar som är mindre än perfekt specificite...

Watch this Scientific Journal Video about Single Molecule Analysis of Laser Localized Psoralen Adducts at JoVE.com

Single Molecule Analysis of Laser Localized Psoralen Adducts

Lasrar används ofta i studier av cellulärt svar på DNA-skada. Emellertid, de genererar lesioner vars avstånd, frekvens, och kollisioner med replikationsgafflar sällan känne. Här beskriver vi en metod som gör det möjligt att bestämma dessa parametrar med laser lokaliserad interstrand tvärbindningar.

Enda molekyl Analys av Laser Lokaliserade psoralen Addukter

The DNA Damage Response (DDR) has been extensively characterized in studies of double strand breaks (DSBs) induced by laser micro beam irradiation in live ...

Research

JoVE Journal

Genetics

Laser-assisted Cytoplasmic Microinjection in Livestock Zygotes

Laser-assisted cytoplasmatisk mikroinjektion i Boskap Zygoter

Cytoplasmic microinjection into one-cell embryos is a very powerful technique. As an example, it enables the delivery of genome editing tools that can ...

Metagenomic Analysis of Silage

Metagenomic Analys av ensilage

Metagenomics is defined as the direct analysis of deoxyribonucleic acid (DNA) purified from environmental samples and enables taxonomic identification of ...

Detection of Copy Number Alterations Using Single Cell Sequencing

Detektion av Copy Number Ändringar Använda Single Cell Sequencing

Detection of genomic changes at single cell resolution is important for characterizing genetic heterogeneity and evolution in normal tissues, cancers, and ...

Mapping RNA-RNA Interactions Globally Using Biotinylated Psoralen

Kartläggning av RNA-RNA-interaktioner globalt med användning av biotinylerad psoralen

Knowing how RNAs interact with themselves and with others is key to understanding RNA based gene regulation in the cell. While examples of RNA-RNA ...

Laser Microirradiation to Study In Vivo Cellular Responses to Simple and Complex DNA Damage

Laser Microirradiation to Study In Vivo Cellular Responses to Simple and Complex DNA Damage

Laser Microirradiation att studera In Vivo cellulära svar till enkla och komplexa DNA-skador

DNA damage induces specific signaling and repair responses in the cell, which is critical for protection of genome integrity. Laser microirradiation ...

Real-time Analysis of Transcription Factor Binding, Transcription, Translation, and Turnover to Display Global Events During Cellular Activation

Realtidsanalys av transkriptionsfaktor som bindande, transkription, översättning och omsättning under cellulär aktivering med visning av globala händelser

Upon activation, cells rapidly change their functional programs and, thereby, their gene expression profile. Massive changes in gene expression occur, for ...

Investigation of Protein Recruitment to DNA Lesions Using 405 Nm Laser Micro-irradiation

Utredning av Protein rekrytering till DNA lesioner med 405 Nm Laser mikro-bestrålning

The DNA Damage Response (DDR) uses a plethora of proteins to detect, signal, and repair DNA lesions. Delineating this response is critical to understand ...

Single Molecule Fluorescence In Situ Hybridization (smFISH) Analysis in Budding Yeast Vegetative Growth and Meiosis

Single Molecule Fluorescence In Situ Hybridization smFISH Analysis in Budding Yeast Vegetative Growth and Meiosis

Enda molekyl fluorescens In Situ hybridisering (smFISH) analys i spirande jäst vegetativ tillväxt och meios

Single molecule fluorescence in situ hybridization (smFISH) is a powerful technique to study gene expression in single cells due to its ability to detect ...

Using In Vitro and In-cell SHAPE to Investigate Small Molecule Induced Pre-mRNA Structural Changes

Använda i Vitro och i cell form att undersöka småmolekylära inducerad Pre-mRNA strukturella förändringar

In the process of drug development of RNA-targeting small molecules, elucidating the structural changes upon their interactions with target RNA sequences ...