Name: an efficient and flexible cell aggregation method for 3d spheroid production
Uploaded: 2017-03-27T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about An Efficient and Flexible Cell Aggregation Method for 3D Spheroid Production at JoVE.com

The authors thank M. Gordon of the Queen's University Biomedical Imaging Centre for assistance. This work was supported by operating grants from the Cancer Research Society of Canada (19439) and the Canadian Institutes for Health Research (MOP-142303) (LMM), and by Ontario Graduate Scholarships and studentships from the Terry Fox Research Institute Training Program in Transdisciplinary Cancer Research (SMM, EYL), and by a Craig Jury Summer Studentship (SMM).

Примечание: Все реагенты и расходные материалы перечислены в списке материалов. 1. Сфероид производства по Cell Aggregation <ol><li> Метил раствор целлюлозы: Приготовьте 100 мл 100 мг / мл метилцеллюлозы. <ol><li> Тепло 50 мл сверхчистой Н 2 О до 80 ° С. Добавить 10 г пор...

<ol>
	<li>Zimmermann, M., Box, C., Eccles, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-dimensional+vs.+three-dimensional+in+vitro+tumor+migration+and+invasion+assays.">Two-dimensional vs. three-dimensional in vitro tumor migration and invasion assays.</a> Methods Mol Biol. 986 (986), 227-252 (2013).</li><li>Albini, A., Noonan, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+'chemoinvasion'+assay,+25+years+and+still+going+strong:+the+use+of+reconstituted+basement+membranes+to+study+cell+invasion+and+angiogenesis.">The 'chemoinvasion' assay, 25 years and still going strong: the use of reconstituted basement membranes to study cell invasion and angiogenesis.</a> Curr Opin Cell Biol. 22 (5), 677-689 (2010).</li><li>Pampaloni, F., Reynaud, E. G., Stelzer, E. H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+third+dimension+bridges+the+gap+between+cell+culture+and+live+tissue.">The third dimension bridges the gap between cell culture and live tissue.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 8 (10), 839-845 (2007).</li><li>Fennema, E., Rivron, N., Rouwkema, J., van Blitterswijk, C., de Boer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spheroid+culture+as+a+tool+for+creating+3D+complex+tissues.">Spheroid culture as a tool for creating 3D complex tissues.</a> Trends Biotechnol. 31 (2), 108-115 (2013).</li><li>Carletti, E., Motta, A., Migliaresi, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scaffolds+for+tissue+engineering+and+3D+cell+culture.">Scaffolds for tissue engineering and 3D cell culture.</a> Methods Mol Biol. 695, 17-39 (2011).</li><li>Foty, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+hanging+drop+cell+culture+protocol+for+generation+of+3D+spheroids.">A simple hanging drop cell culture protocol for generation of 3D spheroids.</a> J Vis Exp. (51), (2011).</li><li>Handschel, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prospects+of+micromass+culture+technology+in+tissue+engineering.">Prospects of micromass culture technology in tissue engineering.</a> Head Face Med. 3, 4 (2007).</li><li>Stuckhoff, A. P., DelValle, L., Amini, S., White, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Neuronal Cell Culture Methods and Protocols Vol. 1078 Methods in Molecular Biology. 1078, 119-132 (2013).</li><li>Stewart, G. J., Wang, Y., Niewiarowski, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methylcellulose+protects+the+ability+of+anchorage-dependent+cells+to+adhere+following+isolation+and+holding+in+suspension.">Methylcellulose protects the ability of anchorage-dependent cells to adhere following isolation and holding in suspension.</a> Biotechniques. 19 (4), 598-604 (1995).</li><li>Vinci, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+establishment+and+analysis+of+three-dimensional+tumor+spheroid-based+functional+assays+for+target+validation+and+drug+evaluation.">Advances in establishment and analysis of three-dimensional tumor spheroid-based functional assays for target validation and drug evaluation.</a> BMC Biol. 10, 29 (2012).</li><li>Nagelkerke, A., Bussink, J., Sweep, F. C. G. J., Span, P. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+multicellular+tumor+spheroids+of+breast+cancer+cells:+How+to+go+three-dimensional.">Generation of multicellular tumor spheroids of breast cancer cells: How to go three-dimensional.</a> Anal. Biochem. 437 (1), 17-19 (2013).</li></ol>

Мы представляем быстрый и гибкий способ получения 3D сфероиды клеток для моделирования архитектуры тканей в естественных условиях с использованием недорогих и широко доступных реагентов. Наш протокол использует не-цитотоксических и адгезионный свойства MC 8, <sup...

Биологически соответствующая оценка поведения опухолевых клеток является сложной задачей с использованием традиционных двумерных (2D) методологии клеточной культуры, отчасти потому , что они не могут адекватно отразить микросреды клеток нашли в естественных условиях. Альтернативные подходы , включающие компоненты внеклеточного матрикса в культуре (например, Бойденом камерные анализах) являются более физиологически представитель естественных условиях окружающей среды ткани в. Тем не менее, они могут быть ограничены оценкой индивидуального поведения клеток, и не резюмировать комплекса в комбинации прижизненного клеточного матрикса и межклеточных взаимодействий , которые способствуют росту ткани или опухоли 1, 2, 3. Использование многоклеточных сфероидов является недавний подход , который более точно воспроизводит компактную архитектуру роста в естественных условиях клетки 1,4. Сфероидов может быть использован для исследования клетка-матрица взаимодействия нормальных клеток, но могут также выступать в качестве аналогов опухолевые для моделирования характеристик прогрессии опухоли, такие как рост метастазов или резистентности к лекарственным препаратам 4. Сфероиды могут быть образованы путем пролиферации отдельных клеток , внедренных в матрицу 5, или более быстро, способствуя агрегации нескольких ячеек , чтобы сформировать один кластер клеток (например, висячей капли, методы центрифугирования) 6, 7. Существующие методы агрегации клеток может потребовать дорогостоящих материалов или специализированного оборудования. Кроме того, эти сфероиды имеют широкий диапазон размеров и морфологией и может быть трудно производить в больших количествах, что делает сравнения между условиями роста или лечения сложных. И, наконец, сфероиды, генерируемые этими способами может быть трудно отделить от белковый extracellular матрица, в которой они включены для использования в других приложениях. Здесь мы описываем надежную и легко изменяемый методологии агрегации клеток для быстрого формирования последовательно размерных сфероидов клеток с использованием коммерчески доступного U-дно электролизера водоотталкивающий пластины и инертную адгезионный матрицу, метилцеллюлоза. После образования эти многоклеточные сфероиды легко выделены для использования в широком диапазоне применений. Протокол также легко адаптировать для создания сфероидов посредством пролиферации клеток, которые могут быть использованы для оценки других клеточных процессов. Здесь мы покажем вторжение клеток анализы, количественно с помощью иммунофлуоресценции окрашивания, а также анализ anoikis, в качестве примера применения этих двух различных протоколов формирования сфероида.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Buffers</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10x Phosphate buffered saline</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>AM9625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium Chloride Solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>21114</td>
			<td>Used for PBS* wash buffer; Do not autoclave PBS* wash buffer upon addition of calcium chloride</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Chloride Solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M1028</td>
			<td>Used for PBS* wash buffer; Do not autoclave PBS* wash buffer upon addition of magnesium chloride</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>For Spheroid Formation</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well U-bottom Cell-Repellent Plate</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>650970</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle&#39;s Medium</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D5546</td>
			<td>For culturing SH-SY5Y, PANC-1, TPC-1 cell lines</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>F12K Medium</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>2112722</td>
			<td>For culturing TT cell line</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F1051</td>
			<td>Filter prior to use to remove particulate contaminants</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methyl cellulose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M7027</td>
			<td>Prepare in water to 100 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Roswell Park Memorial Institute Medium</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>R8758</td>
			<td>For culturing HCT-116, BxPC-3 cell lines</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE Express</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12605028</td>
			<td>Dissociation buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>For Invasion Assay</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Type I Collagen</td>
			<td>Corning Incorporated</td>
			<td>354231</td>
			<td>Stock 3.1mg/ml; Maintain on ice when in use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM Phenol Red Free Low Glucose&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11054-20</td>
			<td>Less background fluorescence compared to Phenol Red supplemented medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glial Cell Line Derived Neurotrophic Factor</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>450-10</td>
			<td>Chemoattractant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>For Immunofluorescence Microscopy</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>#1.5 Coverglass</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>72225-01</td>
			<td>For mounting excised spheroids</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa-Fluor 488 Phalloidin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A12379</td>
			<td>Used to stain actin at 1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Bioshop Canada Incorporated</td>
			<td>ALB001</td>
			<td>Used in BSA blocking buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dabco 33-LV</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>290734</td>
			<td>Antifade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol&#160;</td>
			<td>Bioshop Canada Incorporated</td>
			<td>GLY001</td>
			<td>Used in MOWIOL mounting medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ Software</td>
			<td>Freeware, NIH</td>
			<td>-</td>
			<td>Used for image analysis&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microslides</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>48312-024</td>
			<td>For mounting excised spheroids</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MOWIOL 4-88</td>
			<td>EMD-Millipore</td>
			<td>475904</td>
			<td>Used in MOWIOL mounting medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde&#160;</td>
			<td>EMD-Millipore</td>
			<td>PX0055-3</td>
			<td>Used in fixation buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Bioshop Canada Incorporated</td>
			<td>TRX777</td>
			<td>Used in permeabilization buffer</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an efficient and flexible cell aggregation method for 3d spheroid production

Однослойная культура клеток не адекватно моделировать поведение в естественных условиях тканей, который включает в себя сложные межклеточные и клетка-матрица взаимодействий. Трехмерные технологии (3D) культивирования клеток являются недавнее нововведение разработано для устранения недостатков культуры прикрепленных клеток. В то время как несколько способов генерации аналогов ткани в пробирке, были разработаны, эти методы часто сложны, дороги , чтобы установить, требуют специализированного оборудования, и , как правило , ограничены совместимостью только с определенными типами клеток. Здесь мы описываем быстрый и гибкий протокол для агрегацию клеток в многоклеточных 3D сфероидов одинакового размера, который совместим с ростом различных опухолевых и нормальных клеточных линий. Мы используем различные концентрации в сыворотке крови и метилцеллюлозы (MC), чтобы способствовать анкерное-независимого сфероид поколения и предотвратить образование монослоев клеток в высоко воспроизводимым образом. Оптимальные условия для Individual клеточные линии могут быть достигнуты путем регулировки MC или сывороточные концентрации в сфероида пластового среде. 3D-сфероиды, сгенерированные могут быть собраны для использования в широком диапазоне применений, в том числе клеточных сигналов или исследований экспрессии генов кандидата скрининга лекарственных средств, или в изучении клеточных процессов, таких как инвазии опухолевых клеток и миграции. Протокол также легко адаптировать для создания клоновых сфероидов из одиночных клеток, и могут быть адаптированы для оценки анкерное-независимый рост и anoikis резистентность. В целом, наш протокол обеспечивает легко изменяемый способ генерирования и использования 3D сфероиды клеток для того , чтобы Повторим 3D микроокружение тканей и смоделировать рост в естественных условиях нормальных и опухолевых клеток.

Мы опишем гибкий и эффективный метод для генерации дискретных сфероиды с использованием клеток отталкивающие пластин и сфероидами средств массовой формации, дополненные MC. При соответствующих условиях МС и сывороткой, отдельные клетки оседать и сцепленных вместе, в...

Watch this Scientific Journal Video about An Efficient and Flexible Cell Aggregation Method for 3D Spheroid Production at JoVE.com

An Efficient and Flexible Cell Aggregation Method for 3D Spheroid Production

Here, we describe a rapid and flexible protocol for the formation of 3D cell spheroids through cell aggregation. This is easily adapted to multiple cell types and is suitable for use in a variety of applications including cell migration, invasion, or anoikis assays, and for imaging and quantifying cell-matrix interactions.

Эффективный и гибкий метод Cell агрегация для 3D сфероида производства

Monolayer cell culture does not adequately model the in vivo behavior of tissues, which involves complex cell-cell and cell-matrix interactions. ...

Research

JoVE Journal

Biology

4D Imaging of Protein Aggregation in Live Cells

4D изображений агрегации белков в живых клетках

One of the key tasks of any living cell is maintaining the proper folding of newly synthesized proteins in the face of ever-changing environmental ...

Efficient Production and Purification of Recombinant Murine Kindlin-3 from Insect Cells for Biophysical Studies

Эффективное производство и очистка рекомбинантного мышиного Kindlin-3 от клетках насекомых биофизической исследований

Kindlins are essential coactivators, with talin, of the cell surface receptors&#160;integrins and also participate in integrin outside-in signalling, and ...

An Efficient Method for Quantitative, Single-cell Analysis of Chromatin Modification and Nuclear Architecture in Whole-mount Ovules in Arabidopsis

An Efficient Method for Quantitative, Single-cell Analysis of Chromatin Modification and Nuclear Architecture in Whole-mount Ovules in Arabidopsis

Эффективный метод для количественного, анализа одноклеточные хроматина Модификация и ядерной архитектуры в целом монтажа яйцеклеток в<em&gt; Arabidopsis</em

In flowering plants, the somatic-to-reproductive cell fate transition is marked by the specification of spore mother cells (SMCs) in floral organs of the ...

An Efficient In Vitro Transposition Method by a Transcriptionally Regulated Sleeping Beauty System Packaged into an Integration Defective Lentiviral Vector

An Efficient In Vitro Transposition Method by a Transcriptionally Regulated Sleeping Beauty System Packaged into an Integration Defective Lentiviral Vector

Эффективным в Vitro транспонирования метод транскрипционно регулируемых Спящая красоты системой упакованы в дефектных лентивирусные вектор интеграции

The Sleeping Beauty (SB) transposon is a non-viral integrating system with proven efficacy for gene transfer and functional genomics. To optimize the SB ...

Confocal Microscopy Reveals Cell Surface Receptor Aggregation Through Image Correlation Spectroscopy

Confocal микроскопии показывает клеток поверхности рецептор агрегации через спектроскопии корреляции изображений

Confocal microscopy provides an accessible methodology to capture sub-cellular interactions critical for the characterization and further development of ...

Time-Resolved Fluorescence Imaging and Analysis of Cancer Cell Invasion in the 3D Spheroid Model

Time-Resolved Флуоресценция Изображения и анализ вторжения раковых клеток в 3D-модель сфероидов

The invasion of cancer cells from the primary tumor into the adjacent healthy tissues is an early step in metastasis. Invasive cancer cells pose a major ...

An Easy and Flexible Inoculation Method for Accurately Assessing Powdery Mildew-Infection Phenotypes of Arabidopsis and Other Plants

Простой и гибкий метод инокуляции для точной оценки фенотипов мучнистой росы и других растений

Reducing crop losses due to fungal diseases requires improved understanding of the mechanisms governing plant immunity and fungal pathogenesis, which in ...

Detection of Protein Aggregation using Fluorescence Correlation Spectroscopy

Обнаружение агрегации белка с помощью спектроскопии корреляции флуоресценции

Protein aggregation is a hallmark of neurodegenerative disorders such as amyotrophic lateral sclerosis (ALS), Alzheimer's disease (AD), Parkinson's ...

High-throughput, Robust and Highly Time-flexible Method for Surface Sterilization of Arabidopsis Seeds

Высокопроизводительный, надежный и гибкий по времени метод поверхностной стерилизации семян арабидопсиса

Arabidopsis is by far the plant model species most widely used for functional studies. The surface sterilization of Arabidopsis seeds is a fundamental ...