Name: small rna transfection in primary human th17 cells by next generation electroporation
Uploaded: 2017-04-13T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Small RNA Transfection in Primary Human Th17 Cells by Next Generation Electroporation at JoVE.com

This work was supported by the US National Institutes of Health grants (R01HL109102, P01HL107202, U19CA179512, F31HL131361), a Leukemia &amp; Lymphoma Society scholar award (K.M.A.), and the National Institute of General Medical Sciences (NIGMS) Medical Scientist Training Program (Grant #T32GM007618) (M.M.).

Questo protocollo aderisce alle linee guida del UCSF per l&#39;etica della ricerca umana. 1. Preparazione di T coltura cellulare, Isolamento di cellule T CD4 + e Th17 polarizzazione <ol><li> Al giorno 0, cappotto 6 pozzetti di coltura tissutale con 1,5 ml per pozzetto di anti-umana CD3 (2 ug / mL) e CD28 anti-umano (4 ug / ml) in PBS con calcio e magnesio per almeno 2 ore a 37 ° C. <ol><li> In alternativa, ricoprire le piastre per una notte a 4 ° C. Avvolgere ...

<ol>
	<li>Zhu, J., Yamane, H., Paul, W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+of+Effector+CD4+T+Cell+Populations*.">Differentiation of Effector CD4 T Cell Populations*.</a> Ann Rev Immunol. 28 (1), 445-489 (2010).</li><li>Korn, T., Bettelli, E., Oukka, M., Kuchroo, V. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IL-17+and+Th17+Cells.">IL-17 and Th17 Cells.</a> Ann Rev Immunol. 27 (1), 485-517 (2009).</li><li>Gaffen, S. L., Jain, R., Garg, A. V., Cua, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+IL-23-IL-17+immune+axis:+from+mechanisms+to+therapeutic+testing.">The IL-23-IL-17 immune axis: from mechanisms to therapeutic testing.</a> Nature. 14 (9), 585-600 (2014).</li><li>Romagnani, S., Maggi, E., Liotta, F., Cosmi, L., Annunziato, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Properties+and+origin+of+human+Th17+cells.">Properties and origin of human Th17 cells.</a> Mol Immunol. 47 (1), 3-7 (2009).</li><li>Acosta-Rodriguez, E. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surface+phenotype+and+antigenic+specificity+of+human+interleukin+17-producing+T+helper+memory+cells.">Surface phenotype and antigenic specificity of human interleukin 17-producing T helper memory cells.</a> Nature Immunol. 8 (6), 639-646 (2007).</li><li>Annunziato, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenotypic+and+functional+features+of+human+Th17+cells.">Phenotypic and functional features of human Th17 cells.</a> J Exp Med. 204 (8), 1849-1861 (2007).</li><li>Du, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNA+miR-326+regulates+TH-17+differentiation+and+is+associated+with+the+pathogenesis+of+multiple+sclerosis.">MicroRNA miR-326 regulates TH-17 differentiation and is associated with the pathogenesis of multiple sclerosis.</a> Nature Immunol. 10 (12), 1252-1259 (2009).</li><li>Escobar, T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=miR-155+Activates+Cytokine+Gene+Expression+in+Th17+Cells+by+Regulating+the+DNA-Binding+Protein+Jarid2+to+Relieve+Polycomb-Mediated+Repression.">miR-155 Activates Cytokine Gene Expression in Th17 Cells by Regulating the DNA-Binding Protein Jarid2 to Relieve Polycomb-Mediated Repression.</a> Immunity. 40 (6), 865-879 (2014).</li><li>Wang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Negative+regulation+of+Hif1a+expression+and+TH17+differentiation+by+the+hypoxia-regulated+microRNA+miR-210.">Negative regulation of Hif1a expression and TH17 differentiation by the hypoxia-regulated microRNA miR-210.</a> Nature Immunol. 15 (4), 393-401 (2014).</li><li>Kim, T. K., Eberwine, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mammalian+cell+transfection:+the+present+and+the+future.">Mammalian cell transfection: the present and the future.</a> Anal bioanal chem. 397 (8), 3173-3178 (2010).</li><li>Steiner, D. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNA-29+Regulates+T-Box+Transcription+Factors+and+Interferon-&amp;gamma;+Production+in+Helper+T+Cells.">MicroRNA-29 Regulates T-Box Transcription Factors and Interferon-&amp;gamma; Production in Helper T Cells.</a> Immunity. 35 (2), 169-181 (2011).</li><li>Simpson, L. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+microRNA+upregulated+in+asthma+airway+T+cells+promotes+TH2+cytokine+production.">A microRNA upregulated in asthma airway T cells promotes TH2 cytokine production.</a> Nature Immunol. 15 (12), 1162-1170 (2014).</li><li>Pua, H. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNAs+24+and+27+Suppress+Allergic+Inflammation+and+Target+a+Network+of+Regulators+of+T+Helper+2+Cell-Associated+Cytokine+Production.">MicroRNAs 24 and 27 Suppress Allergic Inflammation and Target a Network of Regulators of T Helper 2 Cell-Associated Cytokine Production.</a> Immunity. 44 (4), 821-832 (2016).</li><li>Flaherty, S., Reynolds, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+Na&#239;ve+CD4++T+Cell+Isolation+and+In+vitro+Differentiation+into+T+Cell+Subsets.">Mouse Na&#239;ve CD4+ T Cell Isolation and In vitro Differentiation into T Cell Subsets.</a> J Vis Exp. (98), (2015).</li><li>Schumann, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+knock-in+primary+human+T+cells+using+Cas9+ribonucleoproteins.">Generation of knock-in primary human T cells using Cas9 ribonucleoproteins.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 112 (33), 10437-10442 (2015).</li></ol>

Questo protocollo fornisce un metodo migliorato per la consegna di piccoli RNA in cellule Th17 umane. Sebbene le cellule Th17 umane sono stati usati qui, questo metodo di elettroporazione con piccoli RNA può essere utilizzato con altri sottoinsiemi helper umana primaria T, come Th1, Th2 e Tregs. Esso non funziona bene per le cellule T CD4 + naive quindi le cellule devono essere attivati in coltura prima della trasfezione. Per questo protocollo, abbiamo prima ottimizzato il sistema di coltura in vitro in<...

Cellule T CD4 + sono orchestrators cruciali della risposta immunitaria adattativa. Naive cellule T CD4 + sono capaci di svilupparsi in diversi cellule T effettrici (es Th1, Th2, Th17, ecc), ciascuno con la propria serie di citochine e fattori di trascrizione caratteristici, a seconda del microambiente locale 1. Le decisioni lignaggio che le cellule T fanno sono fondamentali sia per l&#39;immunità protettiva e la tolleranza per sé. Cellule Th17 sono un sottogruppo di cellule T conosciuti per combattere batteri extracellulari e funghi, ma le loro risposte improprie sono anche implicati nella patogenesi di più malattie autoimmuni e infiammatorie come la sclerosi multipla e psoriasi 2, 3. Cellule Th17 umane possono essere generati da cellule T CD4 + naive in vitro fornendo loro un appropriato ambiente polarizzazione 4. Vario<html> ci combinazioni delle citochine IL-1β, IL-23, TGF, e IL-6 sono stati utilizzati per lo sviluppo delle cellule Th17 umane. Cellule Th17 umane esprimono CCR6, un recettore delle chemochine che viene comunemente utilizzato per identificare questa popolazione cellulare e sono definite dall&#39;espressione del loro fattore di trascrizione principale, RORγt (codificata dal RORC) 5, 6. cellule Th17 hanno la capacità di esprimere molteplici citochine, ma IL-17A è la citochina effettore lignaggio definizione prodotta da queste cellule. Abbiamo esaminato l&#39;espressione di tutti i tre marcatori Th17-associato (CCR6, RORγt, IL-17A) per valutare la robustezza della nostra analisi umana Th17 in vitro differenziazione. Inoltre, abbiamo coltivato le cellule T CD4 + umane in condizioni non polarizzante, in cui sono stati aggiunti citochine o anticorpi bloccanti al mezzo di coltura da usare come controllo negativo in quanto espressione di questi marcatori Th17 dovrebbe essere molto bassa o assente. ve_content &quot;&gt; Un modo per studiare il normale sviluppo delle cellule T umane e la biologia è quello di manipolare l&#39;espressione genica durante il loro sviluppo. A breve RNA interferenti (siRNA) sono sintetici piccole molecole di RNA che hanno come target mRNA codificanti proteine ​​e possono essere utilizzati per ridurre l&#39;espressione genica specifica . I microRNA (miRNA) sono endogeni non codificanti piccoli RNA noti per modulare l&#39;espressione genica post-trascrizionale. miRNA hanno dimostrato di svolgere un ruolo importante sia murine e biologia delle cellule T umane, anche in cellule Th17 7, 8, 9. e &#39; è fondamentale avere metodi affidabili di manipolare piccola attività di RNA nelle cellule T umane per studiare i loro effetti sulla espressione genica e, infine, sulla biologia delle cellule T umano. Qui, descriviamo un protocollo facile da usare, affidabile e coerente che abbiamo sviluppato per l&#39;introduzione piccoli RNA sintetici e acidi nucleici bloccati (LNA, chimicamente modificati acidi nucleici con maggiore stabilità)nelle cellule del sistema immunitario, e in particolare nelle cellule Th17 umane. Ci sono diversi metodi alternativi di introdurre piccoli RNA in cellule di mammifero, che generalmente rientrano in chimici, biologici o fisici categorie 10. metodi chimici comunemente usati, tra trasfezioni base di lipidi e trasfezioni calcio-fosfato, si basano sulla creazione di complessi chimico-DNA che vengono più efficacemente assorbiti dalle cellule. In generale, i metodi chimici non sono efficienti per la trasfezione di cellule T primarie. Il metodo biologico più comune è quella di utilizzare un vettore virale (ad esempio retrovirus o lentivirus), che inserisce direttamente RNA estraneo in un host come parte del suo ciclo di replica naturale. trasduzione virale richiede in genere più tempo per completare, soprattutto quando si tiene conto in tempo per la clonazione molecolare di plasmidi provirale. Inoltre, i vettori di trasduzione virali possono essere potenzialmente dannosi per i ricercatori umani. L&#39;elettroporazione è una m fisicoetodo di indurre permeabilizzazione della membrana sottoponendo cellule di impulsi di alta tensione, permettendo agli acidi nucleici di entrare transientemente nella cella dove possono agire per suo bersaglio. strumenti elettroporazione tradizionali non sono stati efficaci per trasfezione linfociti primari. Tuttavia, ottimizzato generazione elettroporazione accanto ha dimostrato di essere in grado di trasfettare cellule T ad altissima efficienza, specialmente quando il materiale da transfettate è piccolo RNA. La prossima generazione termine è genericamente usato per differenziare le due piattaforme più recenti (ad esempio, neon, Amaxa) dalle macchine tradizionali elettroporazione. Inoltre, questo metodo è facilmente scalabile per schermi di throughput moderati con fino a circa 120 piccoli RNA in un singolo esperimento, spesso utilizzando reagenti convalidati sintetici. Soprattutto, trasfezioni successo può essere raggiunto in appena 16 h dopo l&#39;attivazione delle cellule T. Lo svantaggio di questo metodo, tuttavia, è che non comporti stabile incorporati genomicasu, ed è quindi transitoria. Quindi, vale la pena lo sforzo supplementare per creare un costrutto di espressione stabile che può essere confezionato in un vettore virale ed espresso con successo in cellule T nei casi in cui è richiesta l&#39;espressione a lungo termine di un piccolo RNA. Abbiamo utilizzato un trasfezione prossima generazione (ad esempio, neon) per fornire diversi strumenti semplice o doppio filamento di RNA o LNA oligonucleotidici per scopi diversi 11, 12, 13. RNA interferenza efficiente può essere indotta nel topo primaria e cellule T umane usando RNA corto interferenti doppio filamento (siRNA). Questo protocollo descrive condizioni ottimizzate per l&#39;utilizzo di questa tecnica in cellule Th17 umane. Oltre a siRNA, disponibili in commercio imita miRNA sintetiche e inibitori possono essere utilizzati per studiare guadagno miRNA e perdita di funzione. imita miRNA sono molecole di RNA a doppio filamento molto simili a siRNA, ma designed con la sequenza dei miRNA maturi endogeni. inibitori miRNA sono chimicamente modificati RNA e / o LNA basato oligonucleotidi cavo rigido che si legano a miRNA nativi e antagonizzano la loro funzione. Abbiamo scoperto che tutti questi strumenti possono essere utilizzati efficacemente in coltura i linfociti T primari, compreso ma non limitato alle cellule Th17 umane.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>anti-human IL-17A PE</td>
			<td>ebioscience</td>
			<td>12-7179-42&#160;</td>
			<td>Clone: eBio64DEC17</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-human IFNg FITC</td>
			<td>ebioscience</td>
			<td>11-7319-82</td>
			<td>Clone: 4S.B3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-human CD4 eVolve605</td>
			<td>ebioscience</td>
			<td>83-0047-42</td>
			<td>Clone: SK3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mouse anti-human CD196 (CCR6) BV421</td>
			<td>BD biosciences</td>
			<td>562515</td>
			<td>Clone: 11A9</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-human RORgt AF647</td>
			<td>BD biosciences</td>
			<td>563620</td>
			<td>Clone: Q21-559</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-human CD45 eFluor450</td>
			<td>ebioscience</td>
			<td>48-9459-42</td>
			<td>Clone: 2D1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Foxp3/Trascription Factor Staining Buffer Set</td>
			<td>ebioscience</td>
			<td>00-5523-00</td>
			<td>For intracellular transcription factor flow cytometry staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hu FcR Binding Inhibitor Purified</td>
			<td>ebioscience</td>
			<td>14-9161-71</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImmunoCult-XF T Cell Expansion Medium</td>
			<td>Stemcell Technologies</td>
			<td>10981</td>
			<td>&#34;Serum-Free Base Media&#34;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACS CD28 pure functional grade, human</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-093-375</td>
			<td>Clone: 15E8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-human CD3 Purified</td>
			<td>UCSF monoclonal antibody core</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Clone: OKT-3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LEAF purified anti-human IL-4</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>500815</td>
			<td>Clone: MP4-25D2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-human IFNg, functional grade purified</td>
			<td>ebioscience</td>
			<td>16-7318-85</td>
			<td>Clone: NIB42</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant human IL-23</td>
			<td>Peprotech&#160;</td>
			<td>200-23</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant human IL-1&#946;</td>
			<td>Peprotech&#160;</td>
			<td>200-01B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant human TGF-&#946;1</td>
			<td>Peprotech&#160;</td>
			<td>100-21C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant human IL-6</td>
			<td>Peprotech&#160;</td>
			<td>200-06</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>siGENOME Control Pool, Non-targeting #2</td>
			<td>Dharmacon</td>
			<td>D-001206-14-05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>siGENOME SMARTpool Human RORC</td>
			<td>Dharmacon</td>
			<td>M-003442-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>siGENOME SMARTpool Human PTPRC</td>
			<td>Dharmacon</td>
			<td>M-008067-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dynabeads Untouched Human CD4 T Cells Kit</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>11346D</td>
			<td>Human CD4+ T cell Isolation Kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neon Tranfection System</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>MPK5000</td>
			<td>Next generation electroporation instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neon Tranfection System 10 &#956;l Kit</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>MPK1096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Resuspension Buffer T</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>Provided in kit (MPK1096)</td>
			<td>&#34;Transfection Resuspension Buffer&#34;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lymphoprep</td>
			<td>Stemcell Technologies</td>
			<td>#07801</td>
			<td>Density Gradient Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>costar 6-well tissue culture treated plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3516</td>
			<td>flat bottom plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>costar 48-well tissue culture treated plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3548</td>
			<td>flat bottom plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Pharm Lyse lysing buffer, 10 X</td>
			<td>BD biosciences</td>
			<td>555899</td>
			<td>Must make 1X solution with distilled water prior to use</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

small rna transfection in primary human th17 cells by next generation electroporation

CD4+ T cells can differentiate into several subsets of effector T helper cells depending on the surrounding cytokine milieu. Th17 cells can be generated from na&#239;ve CD4+ T cells in vitro by activating them in the presence of the polarizing cytokines IL-1&#946;, IL-6, IL-23, and TGF&#946;. Th17 cells orchestrate immunity against extracellular bacteria and fungi, but their aberrant activity has also been associated with several autoimmune and inflammatory diseases. Th17 cells are identified by the chemokine receptor CCR6 and defined by their master transcription factor, ROR&#947;t, and characteristic effector cytokine, IL-17A. Optimized culture conditions for Th17 cell differentiation facilitate mechanistic studies of human T cell biology in a controlled environment. They also provide a setting for studying the importance of specific genes and gene expression programs through RNA interference or the introduction of microRNA (miRNA) mimics or inhibitors. This protocol provides an easy to use, reproducible, and highly efficient method for transient transfection of differentiating primary human Th17 cells with small RNAs using a next generation electroporation device.

Il primo passo per lo sviluppo di un sistema affidabile di electroporating successo cellule Th17 umane era di generare robusta in vitro differenziato colture di cellule Th17 umane. Le cellule T coltivate in condizioni Th17 polarizzabili espresso il recettore delle chemochine CCR6 e il fattore di trascrizione RORγt (Figura 1A, sinistra). Questi marcatori non sono stati espressi quando le cellule T sono state coltivate in condizioni non polarizzante (THN) <strong...

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Small RNA Transfection in Primary Human Th17 Cells by Next Generation Electroporation

Next generation electroporation is an efficient method for transfecting human Th17 cells with small RNAs to alter gene expression and cell behavior.

Piccolo RNA trasfezione in cellule primarie Th17 Human Next Generation elettroporazione

CD4+ T cells can differentiate into several subsets of effector T helper cells depending on the surrounding cytokine milieu. Th17 cells can be generated ...

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