Name: a paired bead and magnet array for molding microwells with variable concave geometries
Uploaded: 2018-01-28T13:00:00
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Questa ricerca è stata sostenuta dal programma di ricerca di scienza base attraverso la nazionale Ricerca Fondazione della Corea (NRF) finanziato dal Ministero della scienza, ICT e futuro pianificazione (NRF-2014R1A1A2057527 e NRF-2016R1D1A1B03934418).

1. preparazione del attraverso-foro alluminio piastra e magnete una matrice
<ol><li>Preparare due 50 mm x 50 mm (o superiore) piastre in alluminio. Lo spessore di ogni piatto era 300 µm che è la metà del diametro del tallone.</li>
	<li>Costituiscono una matrice di attraverso-foro di 30 x 30 su una delle piastre in alluminio utilizzando un incisore rotativo di CNC con un po' di micro punta Φ550-µm con 30 mm/s di tasso di tuffo e 8000 RPM di velocità dell'alberino. La distanza tra ogni foro (da centro a centro) era...

<ol>
	<li>Fennema, E., Rivron, N., Rouwkema, J., van Blitterswijk, C., de Boer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spheroid+culture+as+a+tool+for+creating+3D+complex+tissues.">Spheroid culture as a tool for creating 3D complex tissues.</a> Trends Biotechnol. 31 (2), 108-115 (2013).</li><li>Djordjevic, B., Lange, C. 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S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Capture+and+culturing+of+single+microalgae+cells,+and+retrieval+of+colonies+using+a+perforated+hemispherical+microwell+structure.">Capture and culturing of single microalgae cells, and retrieval of colonies using a perforated hemispherical microwell structure.</a> RSC Advances. 4 (106), 61298-61304 (2014).</li><li>Zhong, K., Gao, Y., Li, F., Zhang, Z., Luo, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fabrication+of+PDMS+microlens+array+by+digital+maskless+grayscale+lithography+and+replica+molding+technique.">Fabrication of PDMS microlens array by digital maskless grayscale lithography and replica molding technique.</a> Optik. 125 (10), 2413-2416 (2014).</li><li>Lai, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simple+multi-level+microchannel+fabrication+by+pseudo-grayscale+backside+diffused+light+lithography.">Simple multi-level microchannel fabrication by pseudo-grayscale backside diffused light lithography.</a> RSC advances. 3 (42), 19467-19473 (2013).</li><li>Pan, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fabrication+of+a+3D+hair+follicle-like+hydrogel+by+soft+lithography.">Fabrication of a 3D hair follicle-like hydrogel by soft lithography.</a> J Biomed MAter Res A. 101 (11), 3159-3169 (2013).</li><li>Mori, R., Sakai, Y., Nakazawa, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Micropatterned+organoid+culture+of+rat+hepatocytes+and+HepG2+cells.">Micropatterned organoid culture of rat hepatocytes and HepG2 cells.</a> J Biosci Bioeng. 106 (3), 237-242 (2008).</li></ol>

La sfida principale di questo metodo di fabbricazione era il fissaggio sicuro dei branelli della matrice del attraverso-foro nella piastra di alluminio. Per risolvere questa sfida, forza magnetica sotto forma di una matrice di 30x30 magnete è stato utilizzato per fissare le perline saldamente, come mostrato nelle figure 6 e 7. La densità di flusso magnetico della matrice di magnete, che ha la polarità opposta, è più forte al centro di ogni superficie del magnete. Poiché l'intensit?...

Le cellule coltivate in una forma sferoide sono più simile a tessuto reale nel corpo di una coltura planare bidimensionale1. Dato questo vantaggio, l'uso di sferoidi è stata adottata per migliorare lo studio della interazione cellula-cellula2,3, immunitario-attivazione4,5e6di differenziazione di screening di stupefacenti. Inoltre, sferoidi incorporando più tipi di cellule sono stati applicati recentemente a organoids (quasi-fisiologiche tessuto tridimensionale (3D)), che sono molto utili per studiare lo sviluppo e la malattia umana7. Diversi metodi sono stati utilizzati per produrre sferoidi. Il metodo più semplice prevede l'utilizzo di una superficie non-adesivo, tale che le cellule di aggregazione con gli altri e sferoidi di forma. Una capsula di Petri può essere trattata con albumina di siero bovino, pluronic F-127 o un polimero idrofobico (ad es. in metacrilato di 2-hydroxyethl poli) per rendere la sua superficie non adesivo89. Il metodo del filatore-pallone è un altro ben noto mezzo di produrre grandi quantità di sferoidi10,11. In questo metodo, le cellule sono tenute in sospensione da mescolando per impedire loro di diventare attaccato al substrato. Invece, il galleggiante cellule aggregato di sferoidi di forma. Il metodo superficiale non adesivo e il filatore boccetta metodo può produrre grandi quantità di sferoidi. Tuttavia, essi sono soggetti a limitazioni compreso le difficoltà nel controllare la dimensione della sferoide, come pure il tracciamento e monitoraggio di ogni sferoide. Come rimedio a tali problemi, un altro metodo di produzione della sferoide, vale a dire, l'impiccagione metodo drop può essere autonomo12. Si tratta di deposito di gocce di sospensione cellulare sulla parte inferiore del coperchio di una piastra di coltura. Queste gocce sono di solito da 15 a 30 µ l di dimensioni e contengono circa 300 a 3000 cellule13. Quando il coperchio viene invertito, le gocce sono tenute in posizione dalla tensione superficiale. L'ambiente di microgravità in ogni goccia si concentra le cellule, che poi formano sferoidi singoli presso l'interfaccia liquido-aria libera. I vantaggi dell'impiccagione metodo drop sono che offre una distribuzione delle dimensioni ben controllato, mentre è facile da tracciare e monitorare ogni sferoide, riguardante i metodi di boccetta di superficie e spinner non adesivo. Tuttavia, questo metodo comporta uno svantaggio in quanto la produzione massiccia di sferoidi e il processo di produzione stesso è eccessivamente labor intensive.
Una matrice di micropozzetti è un piatto piatto con molti micro-dimensione pozzi, ciascuno con un diametro che varia da 100 a 1000 µm. Il principio di produzione di sferoide quando utilizzando micropozzetti è simile a quella del metodo superficiale non adesivo. I benefici includono il fatto che i micropozzetti forniscano spazi tra i micropozzetti per separare le cellule o sferoidi, tale che è facile controllare la dimensione di sferoide, mentre anche lo rende facile da monitorare ogni singola sferoide. Con un gran numero di micropozzetti, produzione di alto-rendimento sferoide è anche possibile. Un altro vantaggio di micropozzetti è l'opzione per pozzi di forma di diverse forme (hexahedral, cilindrico, trigonal prismatico) a seconda di unici scopi sperimentali degli utenti. In generale, tuttavia, una forma di tridimensionale (3D) concava (o emisferica) è considerata come essendo il più adatto per la produzione di uniforme-dimensioni singoli sferoidi. Di conseguenza, l'utilità di micropozzetti concavi è stato segnalato per molti studi di biologia cellulare come quelli esame del cardiomyocyte differenziazione delle cellule staminali embrionali14, la secrezione dell'insulina delle cellule dell'isolotto cluster15, la attività enzimatica di epatociti16e la farmacoresistenza tumorale sferoidi17.
Purtroppo, la fabbricazione di micropozzetti spesso richiede strutture specializzate micropatterning; metodi convenzionali basati su fotolitografia richiedono esposizione e strutture in via di sviluppo mentre metodi basati su ion-acquaforte reattive bisogno apparecchiature plasma e il fascio di ioni. Tale attrezzatura è costosa che, insieme con il processo di fabbricazione complicati, presenta un'elevata barriera all'entrata per i biologi che non hanno accesso alla microtecnologia. Per superare questi problemi, altri metodi economici come ghiaccio Litografia18 (con le goccioline di acqua congelata) e il metodo di membrana flessibile14 (utilizzando una membrana, substrato del attraverso-foro e un vuoto) sono stati suggeriti. Tuttavia, questi metodi inoltre incorrere in seri inconvenienti come fosse difficile controllare le dimensioni del modello, il raggiungimento di elevati rapporti di aspetto e la produzione di più grande zona micropozzetti.
Per superare i problemi di cui sopra, stiamo proponendo un metodo di fabbricazione del romanzo concavo microtiter utilizzando un substrato del attraverso-foro, le perline in acciaio e una matrice di magnete. Utilizzando questo metodo, centinaia di micropozzetti sferici concavi può essere fabbricato sfruttando il meccanismo di perline metalliche autobloccanti magnetico-forza-assistita (Figura 1). Il processo di fabbricazione prevede l'utilizzo di pochissimi servizi costosi e complicati e non richiede molte competenze avanzate. Come tale, anche addestrato può facilmente intraprendere questo metodo di fabbricazione. Per illustrare il metodo proposto, umano-adiposo-ha derivato le cellule staminali sono state coltivate nei pozzetti concavi per produrre sferoidi.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="612">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">CNC rotary engraver</td>
			<td style="width:111px;">Roland DGA</td>
			<td style="width:119px;">EGX-350</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Micro drill bit</td>
			<td style="width:111px;">HAM Pr&#228;zision</td>
			<td style="width:119px;">30-1301 TA</td>
			<td>&#934; 0.55 and 0.75 mm</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:216px;">Sulfuric acid 98%</td>
			<td style="width:111px;">Daejung</td>
			<td style="width:119px;">7683-4100</td>
			<td style="width:167px;">For cleaning aluminum plate. 
			Dilute with distilled water with 15% solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Neodymium magnet</td>
			<td style="width:111px;">Supermagnete</td>
			<td>W-01-N</td>
			<td>1 x 1 x 1 mm</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Bearing ball</td>
			<td style="width:111px;">Agami Modeling</td>
			<td style="width:119px;">SUJ2</td>
			<td>&#934; 600 &#956;m steel bead</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Polydimethylsiloxane (PDMS)</td>
			<td style="width:111px;">Dowcorning</td>
			<td style="width:119px;">Sylgard 184</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Pluronic F-127</td>
			<td style="width:111px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">p2443</td>
			<td>Dilute with phosphate buffered saline to 4% (w/v) solution</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Dulbecco&#39;s modified eaggle&#39;s medium (DMEM)</td>
			<td style="width:111px;">ATCC</td>
			<td style="width:119px;">30-2002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Dulbecco&#39;s phosphate buffered saline (D-PBS)</td>
			<td style="width:111px;">ATCC</td>
			<td style="width:119px;">30-2200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Fetal bovine serum</td>
			<td style="width:111px;">ATCC</td>
			<td style="width:119px;">30-2020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Adipose-derived mesenchymal stem cells</td>
			<td style="width:111px;">ATCC</td>
			<td style="width:119px;">ATCC PCS-500-011</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a paired bead and magnet array for molding microwells with variable concave geometries

Una cultura di sferoide è uno strumento utile per comprendere il comportamento cellulare in quanto fornisce un in vivo-come ambiente tridimensionale. Vari metodi di produzione di sferoide come superfici non-adesivo, boccette filatore, impiccagione gocce e micropozzetti sono stati utilizzati in studi di interazione della cellula--cellula, immunitario-attivazione, lo screening, staminali differenziazione cellulare e generazione organoid. Tra questi metodi, micropozzetti con una geometria tridimensionale concava hanno guadagnato l'attenzione di scienziati e ingegneri, dati loro vantaggi di generazione sferoide uniforme di dimensioni medie e la facilità con cui possono essere le risposte di sferoidi individuali monitorati. Anche se sono stati proposti metodi economici come l'uso di membrane flessibili e ghiaccio Litografia, queste tecniche comportano gravi inconvenienti quali difficoltà nel controllare le dimensioni del reticolo, raggiungimento di elevati rapporti di aspetto e la produzione di aree più grandi di micropozzetti. Per superare questi problemi, vi proponiamo un metodo affidabile per la realizzazione di micropozzetti concavi senza la necessità di complesse strutture di costi elevati. Questo metodo utilizza una matrice di foro passante 30x30, diverse centinaia di micrometro-ordine acciaio perle e la forza magnetica per fabbricare 900 micropozzetti in un substrato di polidimetilsilossano (PDMS) 3 x 3 cm. Per dimostrare l'applicabilità del nostro metodo per applicazioni biologiche delle cellule, abbiamo coltivate cellule staminali adipose per 3 giorni e prodotto con successo utilizzando la nostra piattaforma microtiter sferoidi. Inoltre, abbiamo effettuato una simulazione di magnetostatica per studiare il meccanismo, per cui la forza magnetica è stato utilizzato per intrappolare le sfere d'acciaio nei fori. Noi crediamo che il metodo di fabbricazione microtiter proposto potrebbe essere applicato a molti studi cellulari basati su sferoide quali lo screening di stupefacenti, rigenerazione tissutale, differenziazione delle cellule staminali e metastasi del cancro.

Uno stampo convesso e microtiter modello erano stati fabbricati con successo seguendo la procedura descritta 2.1 a 3.7. (Figura 4). Le perle d'acciaio commerciali sono rimasti intrappolate nella matrice del attraverso-foro di 30x30. Le perle erano tenute strettamente senza lacune tra le perline e i corrispondenti fori di passaggio (Figura 4a). La forma del fabbricato microtiter concavo è concavo emisferica, con un diametro di 60...

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A Paired Bead and Magnet Array for Molding Microwells with Variable Concave Geometries

Questo manoscritto presenta un metodo affidabile di fabbricare micropozzetti concavi senza la necessità di complesse strutture di costi elevati. Usando la forza magnetica, perline in acciaio e una matrice di attraverso-foro, diverse centinaia micropozzetti sono stati formati in un substrato di polidimetilsilossano (PDMS) 3 x 3 cm.

Una perlina accoppiato e matrice di magnete per lo stampaggio di micropozzetti con geometrie variabili concavi

A spheroid culture is a useful tool for understanding cellular behavior in that it provides an in vivo-like three-dimensional environment. Various ...

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