Name: a tandem liquid chromatography&#8211;mass spectrometry-based approach for metabolite analysis of staphylococcus aureus
Uploaded: 2017-03-28T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Tandem Liquid ChromatographyÃ¢â‚¬â€œMass Spectrometry-based Approach for Metabolite Analysis of Staphylococcus aureus at JoVE.com

وقد تم تمويل هذا العمل في جزء من ممر NIH لجائزة الاستقلال (منح GM 099893) وصناديق بدء التشغيل أعضاء هيئة التدريس لSRB، فضلا عن مشروع بحث غرانت (منح GM 042219). وكان الممولين أي دور في تصميم الدراسة وجمع البيانات وتفسيرها، أو قرار لتقديم عمل للنشر.

1. إعداد العازلة حلول <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد الفوسفات مخزنة المالحة (PBS، ودرجة الحموضة 7.4) عن طريق تمييع الحل المخزون من 10X PBS إلى التركيز النهائي من 1X مع عالى النقاء (المقطر ومنزوع الأيونات) المياه. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يعد حل التب?...

وترتبط جميع نواتج جزيء صغير لبعضها البعض من خلال أصول المشتركة في المسارات الأيضية المركزية. خلال النمو المتسارع، الخلايا البكتيرية هي في حالة مستقرة البيولوجية والتمثيل الغذائي، وتوفير لقطة من حالة فسيولوجية في ظل ظروف محددة. كودي تراقب الاكتفاء المواد الغذائية م...

يجب مسببات الأمراض البكتيرية يتعامل مع العديد من التحديات في البيئة المضيفة. بالإضافة إلى الهجوم المباشر من قبل الخلايا المناعية، التي تستضيف أيضا تعزل العناصر الغذائية الضرورية للبقاء على قيد الحياة البكتيرية والتكرار، وتوليد مناعة الغذائية 1 و 2. البقاء على قيد الحياة هذه البيئات المعادية، مسببات الأمراض البكتيرية تنتشر عوامل الفوعة. بعض هذه العوامل السماح للبكتيريا للتهرب من الاستجابة المناعية. وتشمل العوامل الأخرى يفرز الإنزيمات الهضمية، مثل هيالورونيداز، thermonuclease، والليباز، والتي قد تمكن البكتيريا لتجديد المواد الغذائية التي تستهلك في عداد المفقودين المكونات المشتقة من الأنسجة 3 و 4 و 5. والواقع أن البكتيريا تطورت النظم التنظيمية التي تربط الحالة الفسيولوجية للخلية إلى إنتاج الفوعة العوامل 6، 7، <s<html> حتى الطبقة = &quot;XREF&quot;&gt; 8 و 9 و 10. وهناك مجموعة متزايدة من الأدلة تشير الى كودي كمنظم حاسم ربط عملية التمثيل الغذائي والفوعة. على الرغم من أن اكتشفت لأول مرة في العصوية الرقيقة بمثابة كاظمة من الجين ثنائي الببتيد بيرمياز (النيابة العامة) 11، ومن المعروف كودي الآن إلى أن يتم إنتاجها من قبل ما يقرب من جميع المنخفضة البكتيريا G + C إيجابية الجرام 12 و 13 و ينظم العشرات من الجينات المسؤولة عن الكربون و الأيض 14، 15، 16، 17، 18، 19 النيتروجين. في الأنواع المسببة للأمراض، كودي أيضا تسيطر على التعبير عن بعض الجينات الفوعة أهم 20، 21،يتم تنشيط EF &quot;&gt; 22، 23، 24، 25، 26، 27 كودي كما بروتين ملزمة DNA من قبل فئتين من بروابط: الأحماض الأمينية المتفرعة السلسلة (BCAAs، آيسولوسين، ليسين، وحمض أميني أساسي [ILV]) وGTP . عندما تكون هذه المواد الغذائية وفيرة، ويقمع كودي (أو في بعض الحالات، ويحفز) النسخ. وتصبح هذه المواد الغذائية محدودة، وانخفاض النشاط كودي تدريجيا، مما أدى إلى استجابة النسخي متدرج أن إعادة طرق السلائف من خلال مختلف المسارات الأيضية المتصلة الأيض المركزي 28، 29، 30. جنبا إلى جنب اللوني السائل إلى جانب لقياس الطيف الكتلي (LC-MS) هي تقنية قوية التي يمكن أن تحدد بدقة وتحديد جزيء صغير الأيض داخل الخلايا 31. عندما يقترن transcتحليل riptome (على سبيل المثال، RNA-يليها)، وهذا العمل التحليلي يمكن أن توفر نظرة ثاقبة على التغيرات الفسيولوجية التي تحدث في الاستجابة للإجهاد البيئي أو التغذية. هنا، نقدم طريقة لاستخراج المستقلب من خلايا المكورات العنقودية الذهبية وتحليلها لاحقا عبر LC-MS. وقد استخدم هذا النهج لإثبات الآثار عديد المظاهر من كودي على بكتريا المكورة العنقودية البرتقالية علم وظائف الأعضاء.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="933">
	<tbody>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:363px;">Material/Equipmenta</td>
			<td style="width:167px;"></td>
			<td style="width:163px;"></td>
			<td style="width:241px;"></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:363px;">DeLong Culture Flask (250 ml)</td>
			<td style="width:167px;">Belco</td>
			<td>2510-00250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:363px;">Sidearm Flask, 500 ml</td>
			<td style="width:167px;">Pyrex</td>
			<td style="width:163px;">5340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:363px;">3-hole Rubber Stopper, #7</td>
			<td style="width:167px;">Fisher</td>
			<td style="width:163px;">14-131E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:363px;">Stainless Steel Filter holder/frit</td>
			<td style="width:167px;">VWR</td>
			<td>89428-936</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:363px;">Petri Dish, 35 mm</td>
			<td style="width:167px;">Corning</td>
			<td style="width:163px;">430588</td>
			<td>Not tissue culture treated</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:363px;">Mixed cellulose ester membrane, 0.22 &#956;m pore size</td>
			<td style="width:167px;">Millipore</td>
			<td>GSWP02500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:363px;">Impact-resistant tubes, 2 ml</td>
			<td style="width:167px;">USA Scientific</td>
			<td style="width:163px;">1420-9600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:363px;">Silica Beads, 0.1 mm</td>
			<td style="width:167px;">Biospec Products Inc</td>
			<td>11079101Z</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:363px;">Precellys 24 homogenizer</td>
			<td style="width:167px;">Bertin Instruments</td>
			<td style="width:163px;">EQ03119-200-RD000.0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:363px;">Micro BCA Protein Assay Kit</td>
			<td style="width:167px;">Pierce (Thermo Scientific)</td>
			<td style="width:163px;">23235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:363px;">Cogent Diamond hydride type C column</td>
			<td style="width:167px;">Agilent</td>
			<td style="width:163px;">70000-15P-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:363px;">Accurate-Mass Time-of-Flight (TOF) LC-MS, 6200 Series</td>
			<td style="width:167px;">Agilent</td>
			<td style="width:163px;">G6230B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:363px;">Quat Pump, 1290 Series</td>
			<td style="width:167px;">Agilent</td>
			<td style="width:163px;">G4204A&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:363px;">Bin Pump, 1290 Series</td>
			<td style="width:167px;">Agilent</td>
			<td style="width:163px;">G4220A&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:363px;">Valve Drive, 1290 Series</td>
			<td style="width:167px;">Agilent</td>
			<td style="width:163px;">G1107A&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:363px;">Isocratic Pump, 1290 Series</td>
			<td style="width:167px;">Agilent</td>
			<td style="width:163px;">G1310B&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:363px;">TCC, 1290 Series</td>
			<td style="width:167px;">Agilent</td>
			<td style="width:163px;">G1316C&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:363px;">Sampler, 1290 Series</td>
			<td style="width:167px;">Agilent</td>
			<td style="width:163px;">G4226A&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:363px;">Thermostat, 1290 Series</td>
			<td style="width:167px;">Agilent</td>
			<td style="width:163px;">G1330B&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Name</td>
			<td style="width:167px;">Company</td>
			<td style="width:163px;">Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:363px;">Chemical</td>
			<td style="width:167px;"></td>
			<td style="width:163px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:363px;">Tryptic Soy Broth</td>
			<td style="width:167px;">Becton Dickinson</td>
			<td style="width:163px;">211825</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:363px;">Difco Agar, Granulated</td>
			<td style="width:167px;">Becton Dickinson</td>
			<td style="width:163px;">214530</td>
			<td>Solid media contains 1.5% [w/v] agar</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:363px;">Phosphate-buffered saline (pH 7.4) 10X</td>
			<td style="width:167px;">Ambion</td>
			<td style="width:163px;">AM9624</td>
			<td>Dilute fresh to 1X with ultra-pure water</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:363px;">Acetonitrile</td>
			<td style="width:167px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:163px;">A955-500</td>
			<td>Optima LC-MS</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:363px;">Methanol</td>
			<td style="width:167px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:163px;">A456-500</td>
			<td>Optima LC-MS; toxic</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:363px;">Formic Acid</td>
			<td style="width:167px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:163px;">94318</td>
			<td>For mass spectrometry, 98%</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Name</td>
			<td style="width:167px;">Company</td>
			<td style="width:163px;">Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:363px;">Software</td>
			<td style="width:167px;"></td>
			<td style="width:163px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:363px;">MassHunter</td>
			<td style="width:167px;">Agilent</td>
			<td style="width:163px;">G3337AA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:363px;">Bacterial Strain</td>
			<td style="width:167px;">Species</td>
			<td style="width:163px;">Strain</td>
			<td>Genotype</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;width:363px;">SRB 337</td>
			<td style="width:167px;">Staphylococcus aureus</td>
			<td style="width:163px;">USA200 MSSA UAMS-1</td>
			<td>wild type</td>
		</tr>
		<tr height="39">
			<td height="39" style="height:39px;width:363px;">SRB 372</td>
			<td style="width:167px;">Staphylococcus aureus</td>
			<td style="width:163px;">USA200 MSSA UAMS-1</td>
			<td>&#916;codY::erm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:933px;">aChemicals and materials listed are specific to the method described and do not include standard laboratory chemicals or supplies.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a tandem liquid chromatography&#8211;mass spectrometry-based approach for metabolite analysis of staphylococcus aureus

في محاولة لإفشال مسببات الأمراض البكتيرية، وتستضيف في كثير من الأحيان تحد من توافر المواد المغذية المفيدة على موقع الإصابة. هذا التحديد يمكن أن يغير وفرة من المركبات الرئيسية التي عوامل تنظيمية تستجيب، وتعديل الأيض الخلوي. في السنوات الأخيرة، برز عدد من البروتينات والحمض النووي الريبي كما المنظمين هامة في التعبير الجيني الفوعة. على سبيل المثال، البروتين كودي يستجيب إلى مستويات الأحماض الأمينية المتفرعة السلسلة وGTP وحفظها على نطاق واسع في البلدان المنخفضة الدخل G + C البكتيريا إيجابية الجرام. كمنظم العالمي في المكورات العنقودية الذهبية، كودي تسيطر على التعبير العشرات من الفوعة والجينات التمثيل الغذائي. نحن نفترض أن بكتريا المكورة العنقودية البرتقالية يستخدم كودي، في جزء منه، إلى تغيير حالته التمثيل الغذائي في محاولة للتكيف مع ظروف تحد من المغذيات يحتمل أن تكون واجهتها في بيئة المضيف. توضح هذه المخطوطة طريقة لاستخراج وتحليل نواتج الأيض من S. الذهبية باستخدام الكروماتوغرافيا السائلة إلى جانب المواصفات الشاملtrometry، وهو البروتوكول الذي تم تطويره لاختبار هذه الفرضية. يسلط الضوء على الأسلوب أيضا أفضل الممارسات التي من شأنها ضمان الدقة والتكاثر، مثل الحفاظ على حالة مستقرة البيولوجية والتهوية المستمرة دون استخدام الثقافات ناظم كيميائي مستمرة. بالنسبة إلى USA200 للميثيسيلين عرضة الذهبية S. عزل UAMS-1 السلالة الأبوية، عرضت على كودي متحولة إسوي زيادات كبيرة في الأحماض الأمينية المستمدة من اسبارتاتي (على سبيل المثال، ثريونين وآيسولوسين) والنقصان في سلائفها (على سبيل المثال، اسبارتاتي وO -acetylhomoserine ). هذه النتائج متطابقة تماما مع البيانات التي تم الحصول عليها النسخي مع تحليل الحمض النووي الريبي وما يليها: كانت الجينات في هذه المسارات يصل ينظم بين 10- و 800 أضعاف في متحولة لاغيا كودي. يمكن اقتران التحليلات العالمية لTranscriptome على وmetabolome تكشف كيف تغير البكتيريا عملية الأيض لديهم عندما تواجه مع الإجهاد البيئي أو الغذائية، وتقديم رؤية المحتملة في فيزالتغييرات المرتبطة iological نضوب المغذيات شهدت خلال العدوى. هذه الاكتشافات قد يمهد الطريق لتطوير رواية مكافحة العدوى والعلاجات.

قمنا بتحليل حمامات الأيض داخل الخلايا في S. الذهبية في المختبر خلال النمو في الغنية والمتوسطة معقدة. وكدليل على المبدأ، قارنا الشخصية الأيض بين S. الذهبية التهاب العظم والنقي للميثيسيلين عرضة عزل UAMS-1 (البرية من نوع [WT])، وسلالة إسوي تفت?...

Watch this Scientific Journal Video about A Tandem Liquid ChromatographyÃ¢â‚¬â€œMass Spectrometry-based Approach for Metabolite Analysis of Staphylococcus aureus at JoVE.com

A Tandem Liquid ChromatographyÃƒÆ’Ã‚Â¢ÃƒÂ¢Ã¢â‚¬Å¡Ã‚Â¬ÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã…â€œMass Spectrometry-based Approach for Metabolite Analysis of Staphylococcus aureus

نحن هنا وصف بروتوكول لاستخراج الأيض من المكورات العنقودية الذهبية والتحليل في وقت لاحق عبر اللوني السائل ومطياف الكتلة.

النهج القائم على الطيف، جنبا إلى جنب السائل اللوني الكتلة لتحليل المستقلب من<em&gt; المكورات العنقودية الذهبية</em

In an effort to thwart bacterial pathogens, hosts often limit the availability of nutrients at the site of infection. This limitation can alter the ...

Research

JoVE Journal

Biochemistry

A Tandem Liquid Chromatography&#8211;Mass Spectrometry-based Approach for Metabolite Analysis of Staphylococcus aureus

A Facile and Efficient Approach for the Production of Reversible Disulfide Cross-linked Micelles

مقاربة سطحية وكفاءة لإنتاج المذيلات عكسية ثاني كبريتيد عبر ربط

Nanomedicine is an emerging form of therapy that harnesses the unique properties of particles that are nanometers in scale for biomedical application. ...

A G-quadruplex DNA-affinity Approach for Purification of Enzymatically Active G4 Resolvase1

نهج G-quadruplex الحمض النووي تقارب لتنقية نشط إنزيمي G4 Resolvase1

Higher-order nucleic acid structures called G-quadruplexes (G4s, G4 structures) can form in guanine-rich regions of both DNA and RNA and are highly ...

Sample Preparation for Mass Spectrometry-based Identification of RNA-binding Regions

إعداد نموذج لتحديد الهوية الجماعية على أساس قياس الطيف الكتلي للجيش الملكي النيبالي-ربط المناطق

Noncoding RNAs play important roles in several nuclear processes, including regulating gene expression, chromatin structure, and DNA repair. In most ...

2 in 1: One-step Affinity Purification for the Parallel Analysis of Protein-Protein and Protein-Metabolite Complexes

2 في 1: انجذاب تطهير لتحليل مواز للبروتين-بروتين والبروتين-المستقلب المجمعات من خطوة واحدة

Cellular processes are regulated by interactions between biological molecules such as proteins, metabolites, and nucleic acids. While the investigation of ...

Identification of Novel CK2 Kinase Substrates Using a Versatile Biochemical Approach

تحديد ركائز كيناز CK2 الرواية باستخدام نهج بيوكيميائية تنوعاً

The study of kinase-substrate relationships is essential to gain a complete understanding of the functions of these enzymes and their downstream targets ...

Using the Open-Source MALDI TOF-MS IDBac Pipeline for Analysis of Microbial Protein and Specialized Metabolite Data

استخدام خط أنابيب MALDI TOF-MS IDBac المفتوح المصدر لتحليل البروتين الميكروبي وبيانات المستقلب المتخصصة

In order to visualize the relationship between bacterial phylogeny and specialized metabolite production of bacterial colonies growing on nutrient agar, ...

A Customizable Approach for the Enzymatic Production and Purification of Diterpenoid Natural Products

نهج للتخصيص للإنتاج الانزيمي وتنقيه المنتجات الطبيعية ديتيربينيد

Diterpenoids form a diverse class of small molecule natural products that are widely distributed across the kingdoms of life and have critical biological ...

Quantitative Analysis of the Cellular Lipidome of Saccharomyces Cerevisiae Using Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry

Quantitative Analysis of the Cellular Lipidome of Saccharomyces Cerevisiae Using Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry

التحليل الكمي للدهون الخلوية من Saccharomyces Cerevisiae باستخدام الكروماتوغرافيا السائلة إلى جانب قياس الطيف الكتلي جنبا إلى جنب

Lipids are structurally diverse amphipathic molecules that are insoluble in water. Lipids are essential contributors to the organization and function of ...

Untargeted Liquid Chromatography-Mass Spectrometry-Based Metabolomics Analysis of Wheat Grain

تحليل الموجات الاختزالية السائلة غير المستهدفة - قياس الطيف الشامل - Metabolomics من حبوب القمح

Understanding the interactions between genes, the environment and management in agricultural practice could allow more accurate prediction and management ...

Single Cell Analysis Of Transcriptionally Active Alleles By Single Molecule FISH

تحليل خلية واحدة من الأليل النشطة نسخيا بواسطة جزيء واحد FISH

Gene transcription is an essential process in cell biology, and allows cells to interpret and respond to internal and external cues. Traditional bulk ...