Name: a tandem liquid chromatography&#8211;mass spectrometry-based approach for metabolite analysis of staphylococcus aureus
Uploaded: 2017-03-28T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Tandem Liquid ChromatographyÃ¢â‚¬â€œMass Spectrometry-based Approach for Metabolite Analysis of Staphylococcus aureus at JoVE.com

Dette arbejde blev finansieret delvist af en NIH Pathway til Independence Award (give GM 099.893) og fakultet startup midler til SRB samt et forskningsprojekt Grant (give GM 042.219). De finansieringskilderne havde ingen rolle i studie design, dataindsamling og fortolkning, eller beslutningen om at indsende arbejde til offentliggørelse.

1. Udarbejdelse af Buffer Solutions <ol><li> Forberede phosphatbufret saltvand (PBS; pH 7,4) ved fortynding af en stamopløsning af 10x PBS til en slutkoncentration på 1 x med ultrarent (destilleret og deioniseret) vand. </li><li> Forberede quenching opløsning ved at kombinere 2 ml acetonitril, 2 ml methanol, 1 ml ultrarent H2O, og 19 pi (0,1 mM slutkoncentration) myresyre. </li><li> Forberede LC-MS opløsningsmiddel A ved tilsætning af myresyre (0,2% [v / v] slutkoncentration) til ultrarent vand. </li><...

Alle små molekyler metabolitter forbundet med hinanden via deres fælles oprindelse i de centrale metaboliske veje. Under eksponentiel vækst, bakterieceller er i biologisk og metabolisk stabil tilstand, tilvejebringelse af et øjebliksbillede af den fysiologiske tilstand under specifikke betingelser. Cody overvåger næringsstof tilstrækkelighed ved at reagere på ILV og GTP. Som ILV og GTP pools dråbe, er Cody aktivitet sandsynligvis nedsættes gradvis, indstilling af ekspression af dens målgener til at tilpasse s...

Bakteriepatogener skal kæmpe med mange udfordringer inden værten miljø. Ud over direkte angreb af immunceller, værten sekvestrerer også næringsstoffer afgørende for bakteriel overlevelse og replikation, frembringelse ernæringsmæssige immunitet 1, 2. For at overleve disse fjendtlige miljøer, bakterielle patogener implementere virulensfaktorer. Nogle af disse faktorer tillader bakterierne at unddrage sig den immunrespons; Andre faktorer omfatter udskilles fordøjelsesenzymer, såsom hyaluronidase, thermonuclease, og lipase, som kan gøre det muligt for bakterierne at genopbygge manglende næringsstoffer ved at indtage vævsafledte bestanddele 3, 4, 5. Faktisk har bakterier udviklet reguleringssystemer, der binder den fysiologiske tilstand af cellen til produktion af virulensfaktorer 6, 7, <s<html> op class = &quot;xref&quot;&gt; 8, 9, 10. En voksende dokumentation peger på Cody som et kritisk regulator forbinder metabolisme og virulens. Selvom først opdaget i Bacillus subtilis som en repressor af dipeptidet permease (dpp) gen 11 er Cody nu vides at blive produceret af næsten alle de lave G + C Gram-positive bakterier 12, 13 og regulerer snesevis af gener involveret i carbon og nitrogenmetabolisme 14, 15, 16, 17, 18, 19. I patogene arter, Cody styrer også udtryk for nogle af de vigtigste virulensgener 20, 21,. ef &quot;&gt; 22, 23, 24, 25, 26, 27 Cody aktiveres som en DNA-bindende protein ved to klasser af ligander: forgrenet aminosyre (BCAA, isoleucin, leucin og valin [ILV]) og GTP . Når disse næringsstoffer er rigelige, Cody undertrykker (eller i nogle tilfælde stimulerer transskription). Da disse næringsstoffer bliver begrænset, Cody aktivitet nedsættes gradvis, hvilket resulterer i en gradueret transkriptionel respons, som re-dirigeres forstadier gennem forskellige metaboliske veje er forbundet til det centrale stofskifte 28, 29, 30. Tandem væskekromatografi koblet til massespektrometri (LC-MS) er en kraftfuld teknik, der nøjagtigt kan identificere og kvantificere små molekyler intracellulære metabolitter 31. Når parret med transcriptome analyse (fx RNA-Seq), denne analytiske arbejdsgang kan give indsigt i de fysiologiske forandringer, der sker som reaktion på miljømæssig eller ernæringsmæssig stress. Her præsenteres en fremgangsmåde til metabolit ekstraktion fra Staphylococcus aureus-celler og efterfølgende analyse via LCMS. Denne fremgangsmåde er blevet anvendt til at påvise de pleiotrope virkninger af Cody på S. aureus fysiologi.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="933">
	<tbody>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:363px;">Material/Equipmenta</td>
			<td style="width:167px;"></td>
			<td style="width:163px;"></td>
			<td style="width:241px;"></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:363px;">DeLong Culture Flask (250 ml)</td>
			<td style="width:167px;">Belco</td>
			<td>2510-00250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:363px;">Sidearm Flask, 500 ml</td>
			<td style="width:167px;">Pyrex</td>
			<td style="width:163px;">5340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:363px;">3-hole Rubber Stopper, #7</td>
			<td style="width:167px;">Fisher</td>
			<td style="width:163px;">14-131E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:363px;">Stainless Steel Filter holder/frit</td>
			<td style="width:167px;">VWR</td>
			<td>89428-936</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:363px;">Petri Dish, 35 mm</td>
			<td style="width:167px;">Corning</td>
			<td style="width:163px;">430588</td>
			<td>Not tissue culture treated</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:363px;">Mixed cellulose ester membrane, 0.22 &#956;m pore size</td>
			<td style="width:167px;">Millipore</td>
			<td>GSWP02500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:363px;">Impact-resistant tubes, 2 ml</td>
			<td style="width:167px;">USA Scientific</td>
			<td style="width:163px;">1420-9600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:363px;">Silica Beads, 0.1 mm</td>
			<td style="width:167px;">Biospec Products Inc</td>
			<td>11079101Z</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:363px;">Precellys 24 homogenizer</td>
			<td style="width:167px;">Bertin Instruments</td>
			<td style="width:163px;">EQ03119-200-RD000.0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:363px;">Micro BCA Protein Assay Kit</td>
			<td style="width:167px;">Pierce (Thermo Scientific)</td>
			<td style="width:163px;">23235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:363px;">Cogent Diamond hydride type C column</td>
			<td style="width:167px;">Agilent</td>
			<td style="width:163px;">70000-15P-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:363px;">Accurate-Mass Time-of-Flight (TOF) LC-MS, 6200 Series</td>
			<td style="width:167px;">Agilent</td>
			<td style="width:163px;">G6230B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:363px;">Quat Pump, 1290 Series</td>
			<td style="width:167px;">Agilent</td>
			<td style="width:163px;">G4204A&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:363px;">Bin Pump, 1290 Series</td>
			<td style="width:167px;">Agilent</td>
			<td style="width:163px;">G4220A&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:363px;">Valve Drive, 1290 Series</td>
			<td style="width:167px;">Agilent</td>
			<td style="width:163px;">G1107A&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:363px;">Isocratic Pump, 1290 Series</td>
			<td style="width:167px;">Agilent</td>
			<td style="width:163px;">G1310B&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:363px;">TCC, 1290 Series</td>
			<td style="width:167px;">Agilent</td>
			<td style="width:163px;">G1316C&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:363px;">Sampler, 1290 Series</td>
			<td style="width:167px;">Agilent</td>
			<td style="width:163px;">G4226A&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:363px;">Thermostat, 1290 Series</td>
			<td style="width:167px;">Agilent</td>
			<td style="width:163px;">G1330B&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Name</td>
			<td style="width:167px;">Company</td>
			<td style="width:163px;">Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:363px;">Chemical</td>
			<td style="width:167px;"></td>
			<td style="width:163px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:363px;">Tryptic Soy Broth</td>
			<td style="width:167px;">Becton Dickinson</td>
			<td style="width:163px;">211825</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:363px;">Difco Agar, Granulated</td>
			<td style="width:167px;">Becton Dickinson</td>
			<td style="width:163px;">214530</td>
			<td>Solid media contains 1.5% [w/v] agar</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:363px;">Phosphate-buffered saline (pH 7.4) 10X</td>
			<td style="width:167px;">Ambion</td>
			<td style="width:163px;">AM9624</td>
			<td>Dilute fresh to 1X with ultra-pure water</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:363px;">Acetonitrile</td>
			<td style="width:167px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:163px;">A955-500</td>
			<td>Optima LC-MS</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:363px;">Methanol</td>
			<td style="width:167px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:163px;">A456-500</td>
			<td>Optima LC-MS; toxic</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:363px;">Formic Acid</td>
			<td style="width:167px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:163px;">94318</td>
			<td>For mass spectrometry, 98%</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Name</td>
			<td style="width:167px;">Company</td>
			<td style="width:163px;">Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:363px;">Software</td>
			<td style="width:167px;"></td>
			<td style="width:163px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:363px;">MassHunter</td>
			<td style="width:167px;">Agilent</td>
			<td style="width:163px;">G3337AA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:363px;">Bacterial Strain</td>
			<td style="width:167px;">Species</td>
			<td style="width:163px;">Strain</td>
			<td>Genotype</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;width:363px;">SRB 337</td>
			<td style="width:167px;">Staphylococcus aureus</td>
			<td style="width:163px;">USA200 MSSA UAMS-1</td>
			<td>wild type</td>
		</tr>
		<tr height="39">
			<td height="39" style="height:39px;width:363px;">SRB 372</td>
			<td style="width:167px;">Staphylococcus aureus</td>
			<td style="width:163px;">USA200 MSSA UAMS-1</td>
			<td>&#916;codY::erm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:933px;">aChemicals and materials listed are specific to the method described and do not include standard laboratory chemicals or supplies.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a tandem liquid chromatography&#8211;mass spectrometry-based approach for metabolite analysis of staphylococcus aureus

I et forsøg på at forpurre bakterielle patogener, værter ofte begrænse tilgængeligheden af ​​næringsstoffer i stedet for infektion. Denne begrænsning kan ændre mængderne af centrale metabolitter, som regulatoriske faktorer reagerer, justering cellulær metabolisme. I de senere år har en række proteiner og RNA opstået som vigtige regulatorer af virulens genekspression. For eksempel Cody proteinet reagerer på niveauer af forgrenede aminosyrer og GTP og er bredt konserveret i lav G + C grampositive bakterier. Som en global regulator i Staphylococcus aureus, Cody kontrollerer ekspressionen af snesevis af virulens og metaboliske gener. Vi hypotesen, at S. aureus anvender Cody delvis at ændre sin metabolisk tilstand i et forsøg på at tilpasse sig til næringsstof-begrænsende betingelser potentielt stødt i værtsmiljøet. Dette manuskript beskriver en fremgangsmåde til ekstraktion og analyse af metabolitter fra S. aureus under anvendelse af væskekromatografi koblet med massespektrumtrometry, en protokol, der blev udviklet for at teste denne hypotese. Fremgangsmåden fremhæver også god praksis som kan sikre stringens og reproducerbarhed, såsom opretholdelse af biologisk stabil tilstand og konstant beluftning uden brug af kontinuerlige kemostat kulturer. I forhold til de USA200 methicillin-modtagelige S. aureus isolere UAMS-1 parentale stamme, den isogene Cody mutanten udviste signifikante stigninger i aminosyrer afledt fra aspartat (fx threonin og isoleucin) og fald i deres forstadier (for eksempel aspartat og O -acetylhomoserine ). Disse fund korrelerer godt med transkriptionelle data opnået med RNA-seq analyse: gener i disse veje opreguleret mellem 10- og 800-fold i Cody null mutant. Kobling globale analyser af transkriptom og metabolomet kan afsløre, hvordan bakterier ændre deres metabolisme når de står med miljø- eller ernæringsmæssig stress, der giver potentiel indsigt i fysiological ændringer forbundet med næringsstof udtynding oplevet under infektion. Sådanne opdagelser kan bane vejen for udviklingen af ​​hidtil ukendte anti-infektiøse og terapeutika.

Vi har analyseret intracellulære metabolit pools i S. aureus under in vitro vækst i et rigt, komplekst medium. Som bevis for princippet, sammenlignede vi metabolitprofiler mellem methicillinmodtagelig S. aureus osteomyelitis isolere UAMS-1 (vildtype [WT]) og en isogen stamme, der mangler den globale transkriptionel regulator Cody (Δ Cody) 26. Steady-state blev eksponentielle kulturer af WT og Cody stammer etableret i...

Watch this Scientific Journal Video about A Tandem Liquid ChromatographyÃ¢â‚¬â€œMass Spectrometry-based Approach for Metabolite Analysis of Staphylococcus aureus at JoVE.com

A Tandem Liquid ChromatographyÃƒÆ’Ã‚Â¢ÃƒÂ¢Ã¢â‚¬Å¡Ã‚Â¬ÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã…â€œMass Spectrometry-based Approach for Metabolite Analysis of Staphylococcus aureus

Her beskriver vi en protokol til ekstraktion af metabolitter fra Staphylococcus aureus og deres efterfølgende analyse via væskekromatografi og massespektrometri.

En Tandem væskekromatografi-massespektrometri-baseret tilgang til Metabolit Analyse af<em&gt; Staphylococcus aureus</em

In an effort to thwart bacterial pathogens, hosts often limit the availability of nutrients at the site of infection. This limitation can alter the ...

Research

JoVE Journal

Biochemistry

A Tandem Liquid Chromatography&#8211;Mass Spectrometry-based Approach for Metabolite Analysis of Staphylococcus aureus

A Facile and Efficient Approach for the Production of Reversible Disulfide Cross-linked Micelles

En Facile og effektiv tilgang til fremkaldelse af reversibel disulfid Cross-forbundne Miceller

Nanomedicine is an emerging form of therapy that harnesses the unique properties of particles that are nanometers in scale for biomedical application. ...

A G-quadruplex DNA-affinity Approach for Purification of Enzymatically Active G4 Resolvase1

En G-quadruplex DNA-affinitet tilgang til oprensning af enzymatisk aktivt G4 Resolvase1

Higher-order nucleic acid structures called G-quadruplexes (G4s, G4 structures) can form in guanine-rich regions of both DNA and RNA and are highly ...

Sample Preparation for Mass Spectrometry-based Identification of RNA-binding Regions

Prøveforberedelse til massespektrometri-baseret identifikation af RNA-bindende regioner

Noncoding RNAs play important roles in several nuclear processes, including regulating gene expression, chromatin structure, and DNA repair. In most ...

2 in 1: One-step Affinity Purification for the Parallel Analysis of Protein-Protein and Protein-Metabolite Complexes

2 i 1: et-trins affinitet rensning for den parallelle analyse af Protein-Protein og Protein-metabolit komplekser

Cellular processes are regulated by interactions between biological molecules such as proteins, metabolites, and nucleic acids. While the investigation of ...

Identification of Novel CK2 Kinase Substrates Using a Versatile Biochemical Approach

Identifikation af roman CK2 Kinase substrater ved hjælp af en alsidig biokemiske tilgang

The study of kinase-substrate relationships is essential to gain a complete understanding of the functions of these enzymes and their downstream targets ...

Using the Open-Source MALDI TOF-MS IDBac Pipeline for Analysis of Microbial Protein and Specialized Metabolite Data

Brug af open source-MALDI TOF-MS IDBac-rørledningen til analyse af mikrobiel protein og specialiserede metabolit data

In order to visualize the relationship between bacterial phylogeny and specialized metabolite production of bacterial colonies growing on nutrient agar, ...

A Customizable Approach for the Enzymatic Production and Purification of Diterpenoid Natural Products

En tilpasselig tilgang til enzymatisk produktion og rensning af Diterpenoid naturprodukter

Diterpenoids form a diverse class of small molecule natural products that are widely distributed across the kingdoms of life and have critical biological ...

Quantitative Analysis of the Cellular Lipidome of Saccharomyces Cerevisiae Using Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry

Quantitative Analysis of the Cellular Lipidome of Saccharomyces Cerevisiae Using Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry

Kvantitativ analyse af cellulære lipidom af Saccharomyces Cerevisiae Ved hjælp af flydende kromatografi kombineret med tandem massespektrometri

Lipids are structurally diverse amphipathic molecules that are insoluble in water. Lipids are essential contributors to the organization and function of ...

Untargeted Liquid Chromatography-Mass Spectrometry-Based Metabolomics Analysis of Wheat Grain

Umålrettet flydende kromatografi-massespektrometri-baserede metabolomiske analyse af hvedekorn

Understanding the interactions between genes, the environment and management in agricultural practice could allow more accurate prediction and management ...

Single Cell Analysis Of Transcriptionally Active Alleles By Single Molecule FISH

Enkeltcelleanalyse af transskriptionsaktive alleler efter enkeltmolekyle FISH

Gene transcription is an essential process in cell biology, and allows cells to interpret and respond to internal and external cues. Traditional bulk ...