Name: a tandem liquid chromatography&#8211;mass spectrometry-based approach for metabolite analysis of staphylococcus aureus
Uploaded: 2017-03-28T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Tandem Liquid ChromatographyÃ¢â‚¬â€œMass Spectrometry-based Approach for Metabolite Analysis of Staphylococcus aureus at JoVE.com

Dit werk werd deels gefinancierd door een NIH Pathway to Independence Award (verlenen GM 099.893) en de faculteit opstarten fondsen om SRB, evenals een Research Project Grant (toekennen GM 042.219). De financiers hadden geen rol in de studie design, het verzamelen van gegevens en de interpretatie, of het besluit om het werk in te zenden voor publicatie.

1. Voorbereiding van de Buffer Solutions <ol><li> Bereid fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS, pH 7,4) door verdunning van een voorraadoplossing van 10x PBS tot een eindconcentratie van 1 x met ultrazuiver (gedestilleerd en gedeïoniseerd) water. </li><li> Bereid quenching oplossing combineert 2 ml acetonitril, 2 ml methanol, 1 ml ultrazuiver H2O en 19 pl (0,1 mM eindconcentratie) mierenzuur. </li><li> Bereid LC-MS oplosmiddel A door toevoeging van mierezuur (0,2% [v / v] eindconcentratie) met ultrazuiver ...

Alle kleine moleculen metabolieten zijn met elkaar verbonden via hun gemeenschappelijke oorsprong in centrale metabole routes. Tijdens exponentiële groei, bacteriële cellen in biologische en metabolische steady state, die een momentopname van de fysiologische toestand onder specifieke omstandigheden. CodY controleert voedingsstoffen voldoende door te reageren op ILV en GTP. Als ILV en GTP zwembaden druppel wordt CodY verricht waardoor geleidelijk verlaagd, het aanpassen van de expressie van de doelwitgenen te passen a...

Bacteriële pathogenen te kampen met vele uitdagingen in de nieuwe omgeving. Naast directe aantasting door immuuncellen, de gastheer sekwestreert ook voedingsstoffen die essentieel zijn voor bacteriële overleving en replicatie, genereren nutritionele immuniteit 1, 2. Om deze vijandige omgeving te overleven, bacteriële ziekteverwekkers implementeren virulentiefactoren. Sommige van deze factoren kan de bacterie om de immuunrespons te ontwijken; Andere factoren zijn uitgescheiden spijsverteringsenzymen, zoals hyaluronidase, thermonuclease en lipase, waarbij de bacteriën in staat kan stellen ontbrekende voedingsstoffen aan te vullen door de consumptie van weefsel afgeleide bestanddelen 3, 4, 5. Sterker nog, bacteriën regulerende systemen die de fysiologische toestand van de cel te binden aan de productie van virulentiefactoren 6, 7 geëvolueerd, <s<html> up class = &quot;xref&quot;&gt; 8, 9, 10. Een groeiende hoeveelheid bewijs wijst op CodY als kritische regulator koppelen metabolisme en virulentie. Hoewel in Bacillus subtilis eerst ontdekt als een repressor van het dipeptide permease (dpp) -gen 11, is CodY nu bekend dat door vrijwel alle lage G + C Gram-positieve bacteriën 12, 13 en regelt tientallen genen betrokken bij koolstof en stikstofmetabolisme 14, 15, 16, 17, 18, 19. In pathogene species, CodY bestuurt ook de expressie van een aantal van de belangrijkste virulentiegenen 20, 21,. ef &#39;&gt; 22, 23, 24, 25, 26, 27 CodY wordt geactiveerd als een DNA-bindend eiwit door twee klassen van liganden: vertakte aminozuren (BCAA, isoleucine, leucine en valine [ILV]) en GTP . Wanneer deze voedingsmiddelen zijn overvloedig, CodY onderdrukt (of in sommige gevallen, stimuleert) transcriptie. Al deze voedingsstoffen beperkter is CodY activiteit geleidelijk verminderd, waardoor een gegradeerde transcriptionele respons die omleidt precursoren via verschillende metabolische wegen verbonden centraal metabolisme 28, 29, 30. Tandem vloeistofchromatografie gekoppeld aan massaspectrometrie (LC-MS) is een techniek die nauwkeurig kan identificeren en kwantificeren van kleine moleculen intracellulaire metabolieten 31. In combinatie met Transcriptome analyse (bijvoorbeeld RNA-Seq) Dit analytisch workflow inzicht in de fysiologische veranderingen die optreden in reactie op milieu- of nutritionele stress. Hier presenteren we een methode voor het metaboliet extractie uit Staphylococcus aureus cellen en daaropvolgende analyse door LC-MS. Deze benadering is gebruikt om de pleiotrope effecten van CodY op S. aureus fysiologie aan te tonen.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="933">
	<tbody>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:363px;">Material/Equipmenta</td>
			<td style="width:167px;"></td>
			<td style="width:163px;"></td>
			<td style="width:241px;"></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:363px;">DeLong Culture Flask (250 ml)</td>
			<td style="width:167px;">Belco</td>
			<td>2510-00250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:363px;">Sidearm Flask, 500 ml</td>
			<td style="width:167px;">Pyrex</td>
			<td style="width:163px;">5340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:363px;">3-hole Rubber Stopper, #7</td>
			<td style="width:167px;">Fisher</td>
			<td style="width:163px;">14-131E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:363px;">Stainless Steel Filter holder/frit</td>
			<td style="width:167px;">VWR</td>
			<td>89428-936</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:363px;">Petri Dish, 35 mm</td>
			<td style="width:167px;">Corning</td>
			<td style="width:163px;">430588</td>
			<td>Not tissue culture treated</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:363px;">Mixed cellulose ester membrane, 0.22 &#956;m pore size</td>
			<td style="width:167px;">Millipore</td>
			<td>GSWP02500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:363px;">Impact-resistant tubes, 2 ml</td>
			<td style="width:167px;">USA Scientific</td>
			<td style="width:163px;">1420-9600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:363px;">Silica Beads, 0.1 mm</td>
			<td style="width:167px;">Biospec Products Inc</td>
			<td>11079101Z</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:363px;">Precellys 24 homogenizer</td>
			<td style="width:167px;">Bertin Instruments</td>
			<td style="width:163px;">EQ03119-200-RD000.0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:363px;">Micro BCA Protein Assay Kit</td>
			<td style="width:167px;">Pierce (Thermo Scientific)</td>
			<td style="width:163px;">23235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:363px;">Cogent Diamond hydride type C column</td>
			<td style="width:167px;">Agilent</td>
			<td style="width:163px;">70000-15P-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:363px;">Accurate-Mass Time-of-Flight (TOF) LC-MS, 6200 Series</td>
			<td style="width:167px;">Agilent</td>
			<td style="width:163px;">G6230B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:363px;">Quat Pump, 1290 Series</td>
			<td style="width:167px;">Agilent</td>
			<td style="width:163px;">G4204A&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:363px;">Bin Pump, 1290 Series</td>
			<td style="width:167px;">Agilent</td>
			<td style="width:163px;">G4220A&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:363px;">Valve Drive, 1290 Series</td>
			<td style="width:167px;">Agilent</td>
			<td style="width:163px;">G1107A&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:363px;">Isocratic Pump, 1290 Series</td>
			<td style="width:167px;">Agilent</td>
			<td style="width:163px;">G1310B&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:363px;">TCC, 1290 Series</td>
			<td style="width:167px;">Agilent</td>
			<td style="width:163px;">G1316C&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:363px;">Sampler, 1290 Series</td>
			<td style="width:167px;">Agilent</td>
			<td style="width:163px;">G4226A&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:363px;">Thermostat, 1290 Series</td>
			<td style="width:167px;">Agilent</td>
			<td style="width:163px;">G1330B&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Name</td>
			<td style="width:167px;">Company</td>
			<td style="width:163px;">Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:363px;">Chemical</td>
			<td style="width:167px;"></td>
			<td style="width:163px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:363px;">Tryptic Soy Broth</td>
			<td style="width:167px;">Becton Dickinson</td>
			<td style="width:163px;">211825</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:363px;">Difco Agar, Granulated</td>
			<td style="width:167px;">Becton Dickinson</td>
			<td style="width:163px;">214530</td>
			<td>Solid media contains 1.5% [w/v] agar</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:363px;">Phosphate-buffered saline (pH 7.4) 10X</td>
			<td style="width:167px;">Ambion</td>
			<td style="width:163px;">AM9624</td>
			<td>Dilute fresh to 1X with ultra-pure water</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:363px;">Acetonitrile</td>
			<td style="width:167px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:163px;">A955-500</td>
			<td>Optima LC-MS</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:363px;">Methanol</td>
			<td style="width:167px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:163px;">A456-500</td>
			<td>Optima LC-MS; toxic</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:363px;">Formic Acid</td>
			<td style="width:167px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:163px;">94318</td>
			<td>For mass spectrometry, 98%</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Name</td>
			<td style="width:167px;">Company</td>
			<td style="width:163px;">Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:363px;">Software</td>
			<td style="width:167px;"></td>
			<td style="width:163px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:363px;">MassHunter</td>
			<td style="width:167px;">Agilent</td>
			<td style="width:163px;">G3337AA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:363px;">Bacterial Strain</td>
			<td style="width:167px;">Species</td>
			<td style="width:163px;">Strain</td>
			<td>Genotype</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;width:363px;">SRB 337</td>
			<td style="width:167px;">Staphylococcus aureus</td>
			<td style="width:163px;">USA200 MSSA UAMS-1</td>
			<td>wild type</td>
		</tr>
		<tr height="39">
			<td height="39" style="height:39px;width:363px;">SRB 372</td>
			<td style="width:167px;">Staphylococcus aureus</td>
			<td style="width:163px;">USA200 MSSA UAMS-1</td>
			<td>&#916;codY::erm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:933px;">aChemicals and materials listed are specific to the method described and do not include standard laboratory chemicals or supplies.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a tandem liquid chromatography&#8211;mass spectrometry-based approach for metabolite analysis of staphylococcus aureus

In een poging om bacteriële pathogenen te dwarsbomen, hosts beperken vaak de beschikbaarheid van voedingsstoffen op de plaats van infectie. Deze beperking kan de abundanties van de belangrijkste metabolieten waaraan regulerende factoren te reageren, het aanpassen van cellulaire metabolisme te veranderen. In de afgelopen jaren is een aantal eiwitten en RNA zijn gekomen als belangrijke regulatoren van genexpressie virulentie. Bijvoorbeeld, de CodY eiwit reageert hoeveelheden vertakte aminozuren en GTP en wordt veel geconserveerd bij lage G + C Grampositieve bacteriën. Als globale regulator in Staphylococcus aureus, CodY de expressie van tientallen virulentie en metabole genen. Onze hypothese is dat S. aureus gebruikt CodY, voor een deel, aan de metabole toestand te veranderen in een poging aan te passen aan voedingsstoffen randvoorwaarden potentieel aangetroffen in de nieuwe omgeving. Dit manuscript beschrijft een werkwijze voor de extractie en analyse van metabolieten van S. aureus met behulp van vloeistofchromatografie gekoppeld aan massaspectrometrietrometry, een protocol dat is ontwikkeld om deze hypothese te testen. De werkwijze wijst ook beste praktijken die zorgt voor nauwkeurigheid en reproduceerbaarheid, zoals het behoud van biologische stabiele en voortdurende beluchting zonder het gebruik van continue chemostaatcultures. Ten opzichte van de USA200 methicilline-gevoelige S. aureus isolaat UAMS-1 uitgangsstam, de isogene mutant Cody vertoonden significante verhogingen van aminozuren afgeleid van aspartaat (bijvoorbeeld threonine en isoleucine) en afnamen in hun precursors (bijvoorbeeld aspartaat en O -acetylhomoserine ). Deze resultaten correleren goed met transcriptionele gegevens verkregen met RNA-seq analyse: genen in deze trajecten werden opgereguleerd tussen 10- en 800-voudig in Cody null-mutant. Koppeling globale analyse van de transcriptoom en het metaboloom kan onthullen hoe bacteriën veranderen hun metabolisme wanneer zij worden geconfronteerd met het milieu of nutritionele stress, het verstrekken van potentiële inzicht in de physiological veranderingen in verband met een tekort aan nutriënten ervaren tijdens infectie. Dergelijke ontdekkingen de weg voor de ontwikkeling van nieuwe anti-infectieuze middelen en therapeutische middelen vrijmaken.

We hebben intracellulaire metaboliet zwembaden in S. aureus geanalyseerd tijdens de in vitro groei in een rijke, complexe medium. Als bewijs van het principe, vergeleken we metabolietprofielen tussen de methicilline-gevoelige S. aureus osteomyelitis isoleren UAMS-1 (wildtype [WT]) en een isogene stam zonder de globale transcriptionele regulator CodY (Δ Cody) 26. Steady-state, exponentiële kweken van de WT en Cody stam...

Watch this Scientific Journal Video about A Tandem Liquid ChromatographyÃ¢â‚¬â€œMass Spectrometry-based Approach for Metabolite Analysis of Staphylococcus aureus at JoVE.com

A Tandem Liquid ChromatographyÃƒÆ’Ã‚Â¢ÃƒÂ¢Ã¢â‚¬Å¡Ã‚Â¬ÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã…â€œMass Spectrometry-based Approach for Metabolite Analysis of Staphylococcus aureus

Hier beschrijven we een protocol voor extractie van metabolieten van Staphylococcus aureus en de daaropvolgende analyse via vloeistofchromatografie en massaspectrometrie.

Een vloeistofchromatografie tandem-massaspectrometrie gebaseerde benadering voor metabolietanalyse van<em&gt; Staphylococcus aureus</em

In an effort to thwart bacterial pathogens, hosts often limit the availability of nutrients at the site of infection. This limitation can alter the ...

Research

JoVE Journal

Biochemistry

A Tandem Liquid Chromatography&#8211;Mass Spectrometry-based Approach for Metabolite Analysis of Staphylococcus aureus

A Facile and Efficient Approach for the Production of Reversible Disulfide Cross-linked Micelles

Een Facile en efficiënte aanpak voor de productie van omkeerbare Disulfide Cross-linked micellen

Nanomedicine is an emerging form of therapy that harnesses the unique properties of particles that are nanometers in scale for biomedical application. ...

A G-quadruplex DNA-affinity Approach for Purification of Enzymatically Active G4 Resolvase1

Een G-quadruplex DNA-affiniteit Aanpak voor zuivering van enzymatisch actieve G4 Resolvase1

Higher-order nucleic acid structures called G-quadruplexes (G4s, G4 structures) can form in guanine-rich regions of both DNA and RNA and are highly ...

Sample Preparation for Mass Spectrometry-based Identification of RNA-binding Regions

Bereiding van de monsters voor de massa spectrometrie gebaseerde identificatie van RNA-bindende regio 's

Noncoding RNAs play important roles in several nuclear processes, including regulating gene expression, chromatin structure, and DNA repair. In most ...

2 in 1: One-step Affinity Purification for the Parallel Analysis of Protein-Protein and Protein-Metabolite Complexes

2 in 1: stap zuivering van de affiniteit voor de parallelle analyse van eiwit-eiwit en eiwit-metaboliet complexen

Cellular processes are regulated by interactions between biological molecules such as proteins, metabolites, and nucleic acids. While the investigation of ...

Identification of Novel CK2 Kinase Substrates Using a Versatile Biochemical Approach

Identificatie van nieuwe CK2 Kinase substraten met behulp van een veelzijdige benadering van de biochemische

The study of kinase-substrate relationships is essential to gain a complete understanding of the functions of these enzymes and their downstream targets ...

Using the Open-Source MALDI TOF-MS IDBac Pipeline for Analysis of Microbial Protein and Specialized Metabolite Data

Met behulp van de open-source MALDI TOF-MS IDBac pijpleiding voor analyse van microbiële eiwitten en gespecialiseerde metaboliet gegevens

In order to visualize the relationship between bacterial phylogeny and specialized metabolite production of bacterial colonies growing on nutrient agar, ...

A Customizable Approach for the Enzymatic Production and Purification of Diterpenoid Natural Products

Een aanpasbare aanpak voor de enzymatische productie en zuivering van Diterpenoid natuurlijke producten

Diterpenoids form a diverse class of small molecule natural products that are widely distributed across the kingdoms of life and have critical biological ...

Quantitative Analysis of the Cellular Lipidome of Saccharomyces Cerevisiae Using Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry

Quantitative Analysis of the Cellular Lipidome of Saccharomyces Cerevisiae Using Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry

Kwantitatieve analyse van de cellulaire lipidoom van Saccharomyces Cerevisiae met behulp van vloeibare chromatografie in combinatie met tandem massaspectrometrie

Lipids are structurally diverse amphipathic molecules that are insoluble in water. Lipids are essential contributors to the organization and function of ...

Untargeted Liquid Chromatography-Mass Spectrometry-Based Metabolomics Analysis of Wheat Grain

Ongerichte vloeibare chromatografie-massaspectrometrie-gebaseerde metabolomics analyse van tarwekorrel

Understanding the interactions between genes, the environment and management in agricultural practice could allow more accurate prediction and management ...

Single Cell Analysis Of Transcriptionally Active Alleles By Single Molecule FISH

Single cell analyse van transcriptioneel actieve allelen door single molecule FISH

Gene transcription is an essential process in cell biology, and allows cells to interpret and respond to internal and external cues. Traditional bulk ...