Name: a tandem liquid chromatography&#8211;mass spectrometry-based approach for metabolite analysis of staphylococcus aureus
Uploaded: 2017-03-28T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Tandem Liquid ChromatographyÃ¢â‚¬â€œMass Spectrometry-based Approach for Metabolite Analysis of Staphylococcus aureus at JoVE.com

Ce travail a été financé en partie par un NIH Pathway to Independence Award (subvention GM 099893) et les fonds de démarrage du corps professoral à SRB, ainsi qu&#39;une subvention de projet de recherche (subvention GM 042219). Les bailleurs de fonds ont joué aucun rôle dans la conception de l&#39;étude, la collecte de données et l&#39;interprétation, ou la décision de soumettre le travail pour publication.

1. Préparation de tampon Solutions <ol><li> Préparer une solution saline tamponnée au phosphate (PBS; pH 7,4) par dilution d&#39;une solution mère de 10 x PBS à une concentration finale de 1 x avec ultrapure (distillée et désionisée) de l&#39;eau. </li><li> Préparer la solution de trempe en combinant 2 ml d&#39;acétonitrile, 2 ml de methanol, 1 ml de H 2 O ultrapure, et 19 ul (0,1 mM de concentration finale) d&#39;acide formique. </li><li> Préparez solvant LC-MS A par addition d&#39;acide formiqu...

Tous les métabolites de petites molécules sont reliés entre eux par leurs origines communes dans les voies métaboliques centrales. Au cours de la croissance exponentielle, les cellules bactériennes sont à l&#39;état d&#39;équilibre biologique et métabolique, donnant un aperçu de l&#39;état physiologique dans des conditions spécifiques. CodY surveille la suffisance des éléments nutritifs en répondant à ILV et GTP. Comme ILV et GTP baisse des piscines, l&#39; activité est susceptible CodY réduit progress...

Les bactéries pathogènes doivent faire face à de nombreux défis dans l&#39;environnement hôte. En plus d&#39;attaque directe par les cellules immunitaires, l&#39;hôte séquestrant également des nutriments essentiels pour la survie et la réplication bactérienne, générant une immunité nutritionnelle 1, 2. Pour survivre à ces environnements hostiles, les bactéries pathogènes déploient des facteurs de virulence. Certains de ces facteurs permettent aux bactéries d&#39;échapper à la réponse immunitaire; D&#39; autres facteurs comprennent sécrétées enzymes digestives, telles que l&#39; hyaluronidase, thermonucléase, et la lipase, ce qui peut permettre aux bactéries de reconstituer les éléments nutritifs manquants en consommant des constituants dérivés de tissus 3, 4, 5. En effet, les bactéries ont développé des systèmes de réglementation qui lient l&#39;état physiologique de la cellule à la production de facteurs de virulence 6, 7, <s<html> up class = &quot;xref&quot;&gt; 8, 9, 10. Un nombre croissant de Justificatif CodY comme à régulateur critique reliant le métabolisme et la virulence. Bien que d&#39; abord découvert dans Bacillus subtilis comme un répresseur du gène 11, Cody est maintenant connu perméase dipeptide (dpp) à produire par la quasi - totalité du faible G + C des bactéries Gram-positives 12, 13 et régule des douzaines de gènes impliqués dans le carbone et le métabolisme de l&#39; azote 14, 15, 16, 17, 18, 19. Chez les espèces pathogènes, CodY contrôle également l&#39;expression de certains des plus importants gènes de virulence 20, 21,. ef &quot;&gt; 22, 23, 24, 25, 26, 27 CodY est activée en tant que protéine de liaison à l&#39; ADN par deux classes de ligands: acides aminés à chaîne ramifiée (BCAA, isoleucine, leucine et valine [VLI]) et GTP . Lorsque ces nutriments sont abondants, Cody refoule (ou dans certains cas, stimule) la transcription. Comme ces nutriments deviennent limitées, l&#39;activité CodY est progressivement réduite, résultant en une réponse transcriptionnelle à gradient qui réachemine des précurseurs à travers différentes voies métaboliques liés au métabolisme central 28, 29, 30. Chromatographie liquide en tandem couplée à la spectrométrie de masse (LC-MS) est une technique puissante qui peut précisément identifier et quantifier les métabolites intracellulaires de petites molécules 31. Lorsqu&#39;il est associé à transcanalyse riptome (par exemple, l&#39; ARN-Seq), ce flux de travail d&#39; analyse peut donner un aperçu des changements physiologiques qui se produisent en réponse au stress environnemental ou nutritionnel. Ici, nous présentons une méthode pour l&#39; extraction des métabolites à partir de cellules de Staphylococcus aureus et une analyse ultérieure par LC-MS. Cette approche a été utilisée pour démontrer les effets pléiotropiques de CodY sur la physiologie de S. aureus.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="933">
	<tbody>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:363px;">Material/Equipmenta</td>
			<td style="width:167px;"></td>
			<td style="width:163px;"></td>
			<td style="width:241px;"></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:363px;">DeLong Culture Flask (250 ml)</td>
			<td style="width:167px;">Belco</td>
			<td>2510-00250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:363px;">Sidearm Flask, 500 ml</td>
			<td style="width:167px;">Pyrex</td>
			<td style="width:163px;">5340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:363px;">3-hole Rubber Stopper, #7</td>
			<td style="width:167px;">Fisher</td>
			<td style="width:163px;">14-131E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:363px;">Stainless Steel Filter holder/frit</td>
			<td style="width:167px;">VWR</td>
			<td>89428-936</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:363px;">Petri Dish, 35 mm</td>
			<td style="width:167px;">Corning</td>
			<td style="width:163px;">430588</td>
			<td>Not tissue culture treated</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:363px;">Mixed cellulose ester membrane, 0.22 &#956;m pore size</td>
			<td style="width:167px;">Millipore</td>
			<td>GSWP02500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:363px;">Impact-resistant tubes, 2 ml</td>
			<td style="width:167px;">USA Scientific</td>
			<td style="width:163px;">1420-9600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:363px;">Silica Beads, 0.1 mm</td>
			<td style="width:167px;">Biospec Products Inc</td>
			<td>11079101Z</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:363px;">Precellys 24 homogenizer</td>
			<td style="width:167px;">Bertin Instruments</td>
			<td style="width:163px;">EQ03119-200-RD000.0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:363px;">Micro BCA Protein Assay Kit</td>
			<td style="width:167px;">Pierce (Thermo Scientific)</td>
			<td style="width:163px;">23235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:363px;">Cogent Diamond hydride type C column</td>
			<td style="width:167px;">Agilent</td>
			<td style="width:163px;">70000-15P-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:363px;">Accurate-Mass Time-of-Flight (TOF) LC-MS, 6200 Series</td>
			<td style="width:167px;">Agilent</td>
			<td style="width:163px;">G6230B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:363px;">Quat Pump, 1290 Series</td>
			<td style="width:167px;">Agilent</td>
			<td style="width:163px;">G4204A&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:363px;">Bin Pump, 1290 Series</td>
			<td style="width:167px;">Agilent</td>
			<td style="width:163px;">G4220A&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:363px;">Valve Drive, 1290 Series</td>
			<td style="width:167px;">Agilent</td>
			<td style="width:163px;">G1107A&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:363px;">Isocratic Pump, 1290 Series</td>
			<td style="width:167px;">Agilent</td>
			<td style="width:163px;">G1310B&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:363px;">TCC, 1290 Series</td>
			<td style="width:167px;">Agilent</td>
			<td style="width:163px;">G1316C&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:363px;">Sampler, 1290 Series</td>
			<td style="width:167px;">Agilent</td>
			<td style="width:163px;">G4226A&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:363px;">Thermostat, 1290 Series</td>
			<td style="width:167px;">Agilent</td>
			<td style="width:163px;">G1330B&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Name</td>
			<td style="width:167px;">Company</td>
			<td style="width:163px;">Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:363px;">Chemical</td>
			<td style="width:167px;"></td>
			<td style="width:163px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:363px;">Tryptic Soy Broth</td>
			<td style="width:167px;">Becton Dickinson</td>
			<td style="width:163px;">211825</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:363px;">Difco Agar, Granulated</td>
			<td style="width:167px;">Becton Dickinson</td>
			<td style="width:163px;">214530</td>
			<td>Solid media contains 1.5% [w/v] agar</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:363px;">Phosphate-buffered saline (pH 7.4) 10X</td>
			<td style="width:167px;">Ambion</td>
			<td style="width:163px;">AM9624</td>
			<td>Dilute fresh to 1X with ultra-pure water</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:363px;">Acetonitrile</td>
			<td style="width:167px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:163px;">A955-500</td>
			<td>Optima LC-MS</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:363px;">Methanol</td>
			<td style="width:167px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:163px;">A456-500</td>
			<td>Optima LC-MS; toxic</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:363px;">Formic Acid</td>
			<td style="width:167px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:163px;">94318</td>
			<td>For mass spectrometry, 98%</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Name</td>
			<td style="width:167px;">Company</td>
			<td style="width:163px;">Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:363px;">Software</td>
			<td style="width:167px;"></td>
			<td style="width:163px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:363px;">MassHunter</td>
			<td style="width:167px;">Agilent</td>
			<td style="width:163px;">G3337AA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:363px;">Bacterial Strain</td>
			<td style="width:167px;">Species</td>
			<td style="width:163px;">Strain</td>
			<td>Genotype</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;width:363px;">SRB 337</td>
			<td style="width:167px;">Staphylococcus aureus</td>
			<td style="width:163px;">USA200 MSSA UAMS-1</td>
			<td>wild type</td>
		</tr>
		<tr height="39">
			<td height="39" style="height:39px;width:363px;">SRB 372</td>
			<td style="width:167px;">Staphylococcus aureus</td>
			<td style="width:163px;">USA200 MSSA UAMS-1</td>
			<td>&#916;codY::erm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:933px;">aChemicals and materials listed are specific to the method described and do not include standard laboratory chemicals or supplies.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a tandem liquid chromatography&#8211;mass spectrometry-based approach for metabolite analysis of staphylococcus aureus

Dans un effort pour contrecarrer les bactéries pathogènes, les hôtes limitent souvent la disponibilité des nutriments sur le site de l&#39;infection. Cette limitation peut modifier les abondances des métabolites clés qui répondent facteurs réglementaires, l&#39;ajustement du métabolisme cellulaire. Ces dernières années, un certain nombre de protéines et d&#39;ARN ont émergé comme des régulateurs importants de l&#39;expression des gènes de virulence. Par exemple, la protéine CodY répond à des niveaux d&#39;acides aminés à chaîne ramifiée et GTP et est largement conservée dans bas G + C des bactéries Gram-positives. En tant que régulateur global dans Staphylococcus aureus, CodY contrôle l&#39;expression de douzaines de gènes de virulence et métaboliques. Nous présumons que S. aureus utilise CodY, en partie, de modifier son état métabolique dans un effort d&#39;adaptation aux conditions de limitation de nutriments potentiellement rencontrés dans l&#39;environnement hôte. Ce manuscrit décrit un procédé pour l&#39; extraction et l&#39; analyse des métabolites provenant de S. aureus en utilisant la chromatographie liquide couplée à la spectrométrie de massespectrométrie, un protocole qui a été développé pour tester cette hypothèse. La méthode met également en évidence les meilleures pratiques qui assureront la rigueur et la reproductibilité, comme le maintien de l&#39;état d&#39;équilibre biologique et l&#39;aération constante sans l&#39;utilisation des cultures de chémostat continue. Par rapport aux USA200 sensibles à la méthicilline de S. aureus souche parentale isoler UAMS-1, le mutant isogénique codY présentait une augmentation significative des acides aminés dérivés de l&#39; aspartate (par exemple, threonine et isoleucine) et des diminutions de leurs précurseurs (par exemple, l&#39; aspartate et O -acetylhomoserine ). Ces résultats sont en bonne corrélation avec les données de transcription obtenus avec l&#39; analyse de l&#39; ARN-seq: gènes dans ces voies ont été régulés à la hausse entre 10 et 800 fois dans le mutant nul codY. Le couplage des analyses globales du transcriptome et métabolome peut révéler comment les bactéries modifient leur métabolisme lorsqu&#39;ils sont confrontés à un stress environnemental ou alimentaire, fournissant un aperçu potentiel dans les Physchangements siologiques associés à l&#39;épuisement des nutriments a connu au cours de l&#39;infection. Ces découvertes peuvent ouvrir la voie à la mise au point de nouveaux anti-infectieux et thérapeutiques.

Nous avons analysé les pools de métabolites intracellulaires dans S. aureus pendant la croissance in vitro dans un milieu riche et complexe,. Comme preuve de principe, nous avons des profils de métabolites comparés entre les méthicilline S. aureus sensible à l&#39; ostéomyélite isoler UAMS-1 (type sauvage [WT]) et une souche isogénique manque le régulateur transcriptionnel global CodY (Δ codY) 26. L&#39;état d&#39; ?...

Watch this Scientific Journal Video about A Tandem Liquid ChromatographyÃ¢â‚¬â€œMass Spectrometry-based Approach for Metabolite Analysis of Staphylococcus aureus at JoVE.com

A Tandem Liquid ChromatographyÃƒÆ’Ã‚Â¢ÃƒÂ¢Ã¢â‚¬Å¡Ã‚Â¬ÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã…â€œMass Spectrometry-based Approach for Metabolite Analysis of Staphylococcus aureus

Nous décrivons ici un protocole pour l&#39;extraction des métabolites à partir de Staphylococcus aureus et leur analyse ultérieure par Chromatographie liquide et spectrométrie de masse.

Une approche fondée Spectrométrie liquide tandem chromatographie-masse pour l&#39;analyse des Métabolite<em&gt; Staphylococcus aureus</em

In an effort to thwart bacterial pathogens, hosts often limit the availability of nutrients at the site of infection. This limitation can alter the ...

Research

JoVE Journal

Biochemistry

A Tandem Liquid Chromatography&#8211;Mass Spectrometry-based Approach for Metabolite Analysis of Staphylococcus aureus

A Facile and Efficient Approach for the Production of Reversible Disulfide Cross-linked Micelles

Une approche efficace et Facile pour la production de micelles réversible Disulfure réticulés

Nanomedicine is an emerging form of therapy that harnesses the unique properties of particles that are nanometers in scale for biomedical application. ...

Recherche

Biochimie

A G-quadruplex DNA-affinity Approach for Purification of Enzymatically Active G4 Resolvase1

Une approche du G-quadruplex ADN-affinité pour la purification de l&#39;activité enzymatique G4 Resolvase1

Higher-order nucleic acid structures called G-quadruplexes (G4s, G4 structures) can form in guanine-rich regions of both DNA and RNA and are highly ...

Sample Preparation for Mass Spectrometry-based Identification of RNA-binding Regions

Préparation de l’échantillon d’Identification basé sur la spectrométrie de masse des régions de liaison à l’ARN

Noncoding RNAs play important roles in several nuclear processes, including regulating gene expression, chromatin structure, and DNA repair. In most ...

2 in 1: One-step Affinity Purification for the Parallel Analysis of Protein-Protein and Protein-Metabolite Complexes

2 en 1 : en une seule étape de Purification d’affinité pour l’analyse parallèle de protéine-protéine et protéine-métabolite Complexes

Cellular processes are regulated by interactions between biological molecules such as proteins, metabolites, and nucleic acids. While the investigation of ...

Identification of Novel CK2 Kinase Substrates Using a Versatile Biochemical Approach

Identification des substrats de Kinase CK2 roman en utilisant une approche biochimique polyvalente

The study of kinase-substrate relationships is essential to gain a complete understanding of the functions of these enzymes and their downstream targets ...

Using the Open-Source MALDI TOF-MS IDBac Pipeline for Analysis of Microbial Protein and Specialized Metabolite Data

Utilisation du pipeline Open-Source MALDI TOF-MS IDBac pour l'analyse des protéines microbiennes et des données spécialisées sur les métabolites

In order to visualize the relationship between bacterial phylogeny and specialized metabolite production of bacterial colonies growing on nutrient agar, ...

A Customizable Approach for the Enzymatic Production and Purification of Diterpenoid Natural Products

Une approche personnalisable pour la production et la purification enzymatiques des produits naturels Diterpenoid

Diterpenoids form a diverse class of small molecule natural products that are widely distributed across the kingdoms of life and have critical biological ...

Quantitative Analysis of the Cellular Lipidome of Saccharomyces Cerevisiae Using Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry

Quantitative Analysis of the Cellular Lipidome of Saccharomyces Cerevisiae Using Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry

Analyse quantitative du lipidome cellulaire de Saccharomyces Cerevisiae à l’aide de la chromatographie liquide couplée à la spectrométrie de masse tandem

Lipids are structurally diverse amphipathic molecules that are insoluble in water. Lipids are essential contributors to the organization and function of ...

Untargeted Liquid Chromatography-Mass Spectrometry-Based Metabolomics Analysis of Wheat Grain

Chromatographie liquide non ciblée-Analyse métabolomique basée sur la spectrométrie de masse du grain de blé

Understanding the interactions between genes, the environment and management in agricultural practice could allow more accurate prediction and management ...

Single Cell Analysis Of Transcriptionally Active Alleles By Single Molecule FISH

Analyse unicellulaire d’allèles transcriptionnellement actifs par molécule unique FISH

Gene transcription is an essential process in cell biology, and allows cells to interpret and respond to internal and external cues. Traditional bulk ...