Name: a tandem liquid chromatography&#8211;mass spectrometry-based approach for metabolite analysis of staphylococcus aureus
Uploaded: 2017-03-28T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Tandem Liquid ChromatographyÃ¢â‚¬â€œMass Spectrometry-based Approach for Metabolite Analysis of Staphylococcus aureus at JoVE.com

Diese Arbeit wurde teilweise durch einen NIH Pathway to Independence Award (gewähren GM 099.893) und Fakultät Startfonds SRB, sowie ein Forschungsprojekt Grant (gewähren GM 042219) gefördert. Die Geldgeber hatten keine Rolle in Studiendesign, Datenerfassung und Interpretation, oder die Entscheidung, die Arbeit zur Publikation einzureichen.

1. Herstellung von Pufferlösungen <ol><li> Bereiten phosphatgepufferter Salzlösung (PBS; pH 7,4) durch eine Stammlösung von 10 × PBS auf eine Endkonzentration von 1x mit Reinstwasser verdünnt wird (destilliertem und entionisiertem) Wasser. </li><li> Bereiten Abschrecken Lösung durch Kombination von 2 ml Acetonitril, 2 ml Methanol, 1 ml ultrareinem H 2 O und 19 ul (0,1 mM Endkonzentration) Ameisensäure. </li><li> Bereiten LC-MS Lösungsmittel A durch Zugabe von Ameisensäure (0,2% [v / v] Endkonzentra...

Alle kleinen Molekül-Metaboliten werden in zentralen Stoffwechselwege miteinander über ihren gemeinsamen Ursprung verbunden. Während des exponentiellen Wachstums sind Bakterienzellen in biologischen und metabolischen eingeschwungenen Zustand eine Momentaufnahme des physiologischen Zustands unter spezifischen Bedingungen bereitzustellen. CodY überwacht Nährstoff Hinlänglichkeit durch zu ILV und GTP reagieren. Als ILV und GTP - Pools Tropfen, wahrscheinlich CodY Aktivität progressiv verringert, um die Expression vo...

Bakterielle Krankheitserreger müssen mit vielen Herausforderungen in der Host-Umgebung kämpfen. Neben dem direkten Angriff von Immunzellen, sondert der Wirt auch Nährstoffe wichtig für bakterielle Überleben und die Replikation zu erzeugen Ernährungs Immunität 1, 2. Um diese feindlichen Umgebungen zu überleben, zu implementieren bakteriellen Erregern Virulenzfaktoren. Einige dieser Faktoren lassen sich die Bakterien die Immunantwort zu entziehen; Andere Faktoren sind Verdauungsenzyme, wie Hyaluronidase, Thermonuklease und Lipase sezerniert wird , die die Bakterien ermöglichen, fehlende Nährstoffe nachzufüllen von Gewebe stammenden Bestandteile 3, 4, 5 raubend. Tatsächlich Bakterien Regulierungssysteme entwickelt haben, die den physiologischen Zustand der Zelle zur Produktion von Virulenz - Faktoren binden 6, 7, <s<html> up class = &quot;xref&quot;&gt; 8, 9, 10. Eine wachsende Zahl von Hinweisen deutet auf CodY als entscheidender Regulator verbindet Stoffwechsel und Virulenz. Obwohl ersten 11 in Bacillus subtilis als Repressor des Dipeptids Permease (dpp) Gen entdeckt, wird CodY jetzt bekannt , um fast alle niedrigen G + C Gram-positive Bakterien , 12, 13 hergestellt werden und reguliert Dutzende von Genen in Kohlenstoff beteiligt und Stickstoffmetabolismus 14, 15, 16, 17, 18, 19. In pathogene Spezies, die Expression einiger der wichtigsten Virulenzgene 20, 21 CodY auch steuert,. ef &quot;&gt; 22, 23, 24, 25, 26, 27 CodY wird als ein DNA-bindendes Protein , das durch zwei Klassen von Liganden aktiviert: verzweigtkettigen Aminosäuren (BCAA, Isoleucin, Leucin und Valin [ILV]) und GTP . Wenn diese Nährstoffe reichlich vorhanden sind, reprimiert CodY (oder in einigen Fällen stimuliert) Transkription. Da diese Nährstoffe begrenzt werden, so wird CodY Aktivität progressiv verringert wird, in einer abgestuften Transkriptionsreaktion führt, daß erneut Routen durch verschiedene Stoffwechselwege Vorläufern zentralen Stoffwechsel verbunden 28, 29, 30. Tandem - Flüssigkeitschromatographie gekoppelt mit Massenspektrometrie (LC-MS) ist ein leistungsfähiges Verfahren , das genau identifizieren und quantifizieren , kann kleinmolekulare intrazelluläre Stoffwechselprodukte 31. Wenn mit umschrift gepaartriptome Analyse (zB RNA-Seq), dieser analytische Workflow kann Einblick in die physiologischen Veränderungen liefern , die in Reaktion auf Umwelt- oder Ernährungs Stress auftreten. Hier stellen wir ein Verfahren zur Extraktion von Metaboliten Staphylococcus aureus - Zellen und die anschließende Analyse mittels LC-MS. Dieser Ansatz wird verwendet, um die pleiotropen Wirkungen von CodY auf S. aureus Physiologie zu demonstrieren.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="933">
	<tbody>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:363px;">Material/Equipmenta</td>
			<td style="width:167px;"></td>
			<td style="width:163px;"></td>
			<td style="width:241px;"></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:363px;">DeLong Culture Flask (250 ml)</td>
			<td style="width:167px;">Belco</td>
			<td>2510-00250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:363px;">Sidearm Flask, 500 ml</td>
			<td style="width:167px;">Pyrex</td>
			<td style="width:163px;">5340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:363px;">3-hole Rubber Stopper, #7</td>
			<td style="width:167px;">Fisher</td>
			<td style="width:163px;">14-131E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:363px;">Stainless Steel Filter holder/frit</td>
			<td style="width:167px;">VWR</td>
			<td>89428-936</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:363px;">Petri Dish, 35 mm</td>
			<td style="width:167px;">Corning</td>
			<td style="width:163px;">430588</td>
			<td>Not tissue culture treated</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:363px;">Mixed cellulose ester membrane, 0.22 &#956;m pore size</td>
			<td style="width:167px;">Millipore</td>
			<td>GSWP02500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:363px;">Impact-resistant tubes, 2 ml</td>
			<td style="width:167px;">USA Scientific</td>
			<td style="width:163px;">1420-9600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:363px;">Silica Beads, 0.1 mm</td>
			<td style="width:167px;">Biospec Products Inc</td>
			<td>11079101Z</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:363px;">Precellys 24 homogenizer</td>
			<td style="width:167px;">Bertin Instruments</td>
			<td style="width:163px;">EQ03119-200-RD000.0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:363px;">Micro BCA Protein Assay Kit</td>
			<td style="width:167px;">Pierce (Thermo Scientific)</td>
			<td style="width:163px;">23235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:363px;">Cogent Diamond hydride type C column</td>
			<td style="width:167px;">Agilent</td>
			<td style="width:163px;">70000-15P-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:363px;">Accurate-Mass Time-of-Flight (TOF) LC-MS, 6200 Series</td>
			<td style="width:167px;">Agilent</td>
			<td style="width:163px;">G6230B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:363px;">Quat Pump, 1290 Series</td>
			<td style="width:167px;">Agilent</td>
			<td style="width:163px;">G4204A&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:363px;">Bin Pump, 1290 Series</td>
			<td style="width:167px;">Agilent</td>
			<td style="width:163px;">G4220A&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:363px;">Valve Drive, 1290 Series</td>
			<td style="width:167px;">Agilent</td>
			<td style="width:163px;">G1107A&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:363px;">Isocratic Pump, 1290 Series</td>
			<td style="width:167px;">Agilent</td>
			<td style="width:163px;">G1310B&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:363px;">TCC, 1290 Series</td>
			<td style="width:167px;">Agilent</td>
			<td style="width:163px;">G1316C&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:363px;">Sampler, 1290 Series</td>
			<td style="width:167px;">Agilent</td>
			<td style="width:163px;">G4226A&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:363px;">Thermostat, 1290 Series</td>
			<td style="width:167px;">Agilent</td>
			<td style="width:163px;">G1330B&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Name</td>
			<td style="width:167px;">Company</td>
			<td style="width:163px;">Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:363px;">Chemical</td>
			<td style="width:167px;"></td>
			<td style="width:163px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:363px;">Tryptic Soy Broth</td>
			<td style="width:167px;">Becton Dickinson</td>
			<td style="width:163px;">211825</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:363px;">Difco Agar, Granulated</td>
			<td style="width:167px;">Becton Dickinson</td>
			<td style="width:163px;">214530</td>
			<td>Solid media contains 1.5% [w/v] agar</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:363px;">Phosphate-buffered saline (pH 7.4) 10X</td>
			<td style="width:167px;">Ambion</td>
			<td style="width:163px;">AM9624</td>
			<td>Dilute fresh to 1X with ultra-pure water</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:363px;">Acetonitrile</td>
			<td style="width:167px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:163px;">A955-500</td>
			<td>Optima LC-MS</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:363px;">Methanol</td>
			<td style="width:167px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:163px;">A456-500</td>
			<td>Optima LC-MS; toxic</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:363px;">Formic Acid</td>
			<td style="width:167px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:163px;">94318</td>
			<td>For mass spectrometry, 98%</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Name</td>
			<td style="width:167px;">Company</td>
			<td style="width:163px;">Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:363px;">Software</td>
			<td style="width:167px;"></td>
			<td style="width:163px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:363px;">MassHunter</td>
			<td style="width:167px;">Agilent</td>
			<td style="width:163px;">G3337AA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:363px;">Bacterial Strain</td>
			<td style="width:167px;">Species</td>
			<td style="width:163px;">Strain</td>
			<td>Genotype</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;width:363px;">SRB 337</td>
			<td style="width:167px;">Staphylococcus aureus</td>
			<td style="width:163px;">USA200 MSSA UAMS-1</td>
			<td>wild type</td>
		</tr>
		<tr height="39">
			<td height="39" style="height:39px;width:363px;">SRB 372</td>
			<td style="width:167px;">Staphylococcus aureus</td>
			<td style="width:163px;">USA200 MSSA UAMS-1</td>
			<td>&#916;codY::erm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:933px;">aChemicals and materials listed are specific to the method described and do not include standard laboratory chemicals or supplies.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a tandem liquid chromatography&#8211;mass spectrometry-based approach for metabolite analysis of staphylococcus aureus

In dem Bemühen, bakterielle Pathogene zu vereiteln, begrenzen Wirte oft die Verfügbarkeit von Nährstoffen an dem Ort der Infektion. Diese Einschränkung kann die Häufigkeit von Schlüsselmetaboliten ändern, auf die regulatorischen Faktoren reagieren, den Zellstoffwechsel einstellen. In den letzten Jahren sind eine Reihe von Proteinen und RNA als wichtige Regulatoren der Genexpression Virulenz entstanden. Beispielsweise reagiert das CodY Protein auf ein Niveau von verzweigtkettigen Aminosäuren und GTP und ist in niedrigen G + C Gram-positiven Bakterien weitgehend konserviert. Als globaler Regulator in Staphylococcus aureus, steuert CodY die Expression von Dutzenden von Virulenz und metabolischen Gene. Wir vermuten , dass S. aureus verwendet CodY, teilweise seinen metabolischen Zustand in dem Bemühen , zu verändern , um Nährstoff einschränkenden Bedingungen möglicherweise begegneten in der Host - Umgebung anzupassen. Diese Handschrift beschreibt ein Verfahren zur Extraktion und Analyse von Metaboliten aus S. aureus unter Verwendung von Flüssigchromatographie gekoppelt mit Massenspektrometry, ein Protokoll, das entwickelt wurde, um diese Hypothese zu testen. Das Verfahren zeigt auch Best Practices, die Strenge und Reproduzierbarkeit gewährleisten, wie biologischen eingeschwungenen Zustand und konstante Belüftung ohne die Verwendung von kontinuierlichen Chemostatkulturen beibehalten wird. Relativ zu dem USA200 Methicillin-empfindlicher S. aureus UAMS-1 parentalen Stamm zu isolieren, zeigte die isogene Mutante codY signifikante Anstiege in Aminosäuren aus Aspartat abgeleitet (zB Threonin und Isoleucin) und nimmt in ihren Vorläufern (zB Aspartat und O - Acetylhomoserin ). Diese Ergebnisse korrelieren gut mit Transkriptions Daten mit RNA-Seq - Analyse erhalten: Gene in diesen Bahnen hochreguliert zwischen 10- und 800-fach in der codY Nullmutante waren. Die Kopplung globale Analysen der Transkriptom und Metabolom kann zeigen, wie Bakterien ihren Stoffwechsel verändern, wenn sie mit Umwelt- oder Ernährungs Stress konfrontiert, potenziellen Einblicks in die phys Bereitstellungiologische Veränderungen im Zusammenhang mit Nährstoffverarmung während der Infektion erfahren. Solche Entdeckungen können den Weg für die Entwicklung neuartiger Antiinfektiva und Therapeutika ebnen.

Wir haben während der in - vitro - Wachstum in einem reichen komplexen Medium intrazellulären Stoffwechselprodukt- Pools in S. aureus analysiert. Als Beweis für das Prinzip, verglichen wir Metabolitprofilen zwischen dem Methicillin-empfindlicher S. aureus Osteomyelitis isoliert UAMS-1 (Wildtyp [WT]) und einen isogenen Stamm , der den global Transkriptionsregulator CodY (Δ codY) 26 fehlt. Steady-state, exponentielle ...

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A Tandem Liquid ChromatographyÃƒÆ’Ã‚Â¢ÃƒÂ¢Ã¢â‚¬Å¡Ã‚Â¬ÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã…â€œMass Spectrometry-based Approach for Metabolite Analysis of Staphylococcus aureus

Hier beschreiben wir ein Protokoll für die Extraktion von Metaboliten von Staphylococcus aureus und deren anschließenden Analyse mittels Flüssigchromatographie und Massenspektrometrie.

Ein Tandem-Flüssigchromatographie-Massenspektrometrie-basierter Ansatz zur Analyse von Metabolit<em&gt; Staphylococcus aureus</em

In an effort to thwart bacterial pathogens, hosts often limit the availability of nutrients at the site of infection. This limitation can alter the ...

Research

JoVE Journal

Biochemistry

A Tandem Liquid Chromatography&#8211;Mass Spectrometry-based Approach for Metabolite Analysis of Staphylococcus aureus

A Facile and Efficient Approach for the Production of Reversible Disulfide Cross-linked Micelles

Eine leichte und effiziente Ansatz für die Produktion von Reversible Disulfid Vernetzte Mizellen

Nanomedicine is an emerging form of therapy that harnesses the unique properties of particles that are nanometers in scale for biomedical application. ...

Forschung

Biochemie

A G-quadruplex DNA-affinity Approach for Purification of Enzymatically Active G4 Resolvase1

Ein G-Quadruplex-DNA-Affinität Ansatz zur Reinigung von enzymatisch aktiven G4 Resolvase1

Higher-order nucleic acid structures called G-quadruplexes (G4s, G4 structures) can form in guanine-rich regions of both DNA and RNA and are highly ...

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Probenvorbereitung für Masse Spektrometrie-basierte Identifikation der RNA-bindende Regionen

Noncoding RNAs play important roles in several nuclear processes, including regulating gene expression, chromatin structure, and DNA repair. In most ...

2 in 1: One-step Affinity Purification for the Parallel Analysis of Protein-Protein and Protein-Metabolite Complexes

2 in 1: Affinitätsreinigung für die parallele Analyse von Protein-Protein und Protein-Metabolit komplexe in einem Schritt

Cellular processes are regulated by interactions between biological molecules such as proteins, metabolites, and nucleic acids. While the investigation of ...

Identification of Novel CK2 Kinase Substrates Using a Versatile Biochemical Approach

Identifizierung von neuartigen CK2 Kinase Substrate mit einem vielseitigen biochemischen Ansatz

The study of kinase-substrate relationships is essential to gain a complete understanding of the functions of these enzymes and their downstream targets ...

Using the Open-Source MALDI TOF-MS IDBac Pipeline for Analysis of Microbial Protein and Specialized Metabolite Data

Verwendung der Open-Source MALDI TOF-MS IDBac Pipeline zur Analyse von mikrobiellen Protein- und Spezialisierten Metabolitendaten

In order to visualize the relationship between bacterial phylogeny and specialized metabolite production of bacterial colonies growing on nutrient agar, ...

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Ein anpassbarer Ansatz für die enzymatische Produktion und Reinigung von Diterpenoid Naturprodukten

Diterpenoids form a diverse class of small molecule natural products that are widely distributed across the kingdoms of life and have critical biological ...

Quantitative Analysis of the Cellular Lipidome of Saccharomyces Cerevisiae Using Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry

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Quantitative Analyse des Zelllipidoms von Saccharomyces Cerevisiae mit Flüssigchromatographie gekoppelt mit Tandem-Massenspektrometrie

Lipids are structurally diverse amphipathic molecules that are insoluble in water. Lipids are essential contributors to the organization and function of ...

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Understanding the interactions between genes, the environment and management in agricultural practice could allow more accurate prediction and management ...

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Gene transcription is an essential process in cell biology, and allows cells to interpret and respond to internal and external cues. Traditional bulk ...