Name: a tandem liquid chromatography&#8211;mass spectrometry-based approach for metabolite analysis of staphylococcus aureus
Uploaded: 2017-03-28T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Tandem Liquid ChromatographyÃ¢â‚¬â€œMass Spectrometry-based Approach for Metabolite Analysis of Staphylococcus aureus at JoVE.com

Questo lavoro è stato finanziato in parte da un NIH Pathway to Independence Award (Grant GM 099.893) ei fondi di avvio facoltà di SRB, nonché un progetto di assegno di ricerca (Grant GM 042.219). I finanziatori avevano alcun ruolo nel disegno dello studio, la raccolta dei dati e l&#39;interpretazione, o la decisione di presentare il lavoro per la pubblicazione.

1. Preparazione del Buffer Solutions <ol><li> Preparare salina tamponata con fosfato (PBS, pH 7,4) diluendo una soluzione stock di 10x PBS ad una concentrazione finale di 1x con ultrapura (distillata e deionizzata) acqua. </li><li> Preparare la soluzione quenching combinando 2 mL di acetonitrile, 2 mL di metanolo, 1 mL di H 2 O ultrapura, e 19 microlitri (0,1 mM di concentrazione finale) di acido formico. </li><li> Preparare LC-MS solvente A per aggiunta di acido formico (0,2% [v / v] concentrazione finale)...

Tutti i metaboliti piccole molecole sono collegate tra di loro attraverso le loro origini comuni in vie metaboliche centrali. Durante la crescita esponenziale, le cellule batteriche sono a regime biologico e metabolico, fornendo una fotografia dello stato fisiologico in condizioni specifiche. Cody monitora sufficienza nutrienti rispondendo a IBT e GTP. Come ILV e GTP piscine goccia, attività Cody è probabile progressivamente ridotto, regolando l&#39;espressione dei suoi geni bersaglio per adattarsi alla crescente esau...

batteri patogeni devono affrontare molte sfide all&#39;interno dell&#39;ambiente host. Oltre a attacco diretto da parte delle cellule immunitarie, l&#39;host sequestra anche nutrienti essenziali per la sopravvivenza batterica e la replicazione, generando immunità nutrizionale 1, 2. Per sopravvivere a questi ambienti ostili, batteri patogeni distribuire fattori di virulenza. Alcuni di questi fattori permettono ai batteri di eludere la risposta immunitaria; Altri fattori includono secreti enzimi digestivi, come ialuronidasi, termonucleasi, e lipasi, che possono permettere ai batteri di riempire le sostanze nutrienti mancanti consumando costituenti derivate dal tessuto 3, 4, 5. Infatti, i batteri hanno sviluppato sistemi regolatori che legano lo stato fisiologico della cella per la produzione di fattori di virulenza 6, 7, <s<html> up class = &quot;xref&quot;&gt; 8, 9, 10. Un crescente corpo di evidenze indica Cody come un regolatore fondamentale che collega il metabolismo e virulenza. Sebbene scoperto nel Bacillus subtilis come repressore del gene 11 dipeptide permease (DPP), Cody è ormai noto per essere prodotto da quasi tutti i bassi batteri G + C Gram-positivi 12, 13 e regola decine di geni coinvolti in carbonio e azoto metabolismo 14, 15, 16, 17, 18, 19. In specie patogene, Cody controlla anche l&#39;espressione di alcuni tra i più importanti geni di virulenza 20, 21,. ef &quot;&gt; 22, 23, 24, 25, 26, 27 Cody è attivata come una proteina legante il DNA da due classi di ligandi: amminoacidi ramificati (BCAA, isoleucina, leucina e valina [ILV]) e GTP . Quando questi nutrienti sono abbondanti, Cody reprime (o in alcuni casi, stimola) trascrizione. Poiché questi nutrienti diventano limitato, attività Cody è progressivamente ridotto, con conseguente risposta trascrizionale graduata che ri-rotte precursori attraverso varie vie metaboliche legate al metabolismo centrale 28, 29, 30. Tandem cromatografia liquida accoppiata alla spettrometria di massa (LC-MS) è una tecnica potente che può identificare accuratamente e quantificare piccole molecole metaboliti intracellulari 31. Quando è accoppiato con transcAnalisi riptome (ad esempio, RNA-Seq), questo flusso di lavoro di analisi in grado di fornire una conoscenza delle cambiamenti fisiologici che si verificano in risposta a stress ambientale o nutrizionale. Qui, presentiamo un metodo per l&#39;estrazione metabolita da cellule di Staphylococcus aureus e successiva analisi mediante LC-MS. Questo approccio è stato utilizzato per dimostrare gli effetti pleiotropici di Cody su S. aureus fisiologia.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="933">
	<tbody>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:363px;">Material/Equipmenta</td>
			<td style="width:167px;"></td>
			<td style="width:163px;"></td>
			<td style="width:241px;"></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:363px;">DeLong Culture Flask (250 ml)</td>
			<td style="width:167px;">Belco</td>
			<td>2510-00250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:363px;">Sidearm Flask, 500 ml</td>
			<td style="width:167px;">Pyrex</td>
			<td style="width:163px;">5340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:363px;">3-hole Rubber Stopper, #7</td>
			<td style="width:167px;">Fisher</td>
			<td style="width:163px;">14-131E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:363px;">Stainless Steel Filter holder/frit</td>
			<td style="width:167px;">VWR</td>
			<td>89428-936</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:363px;">Petri Dish, 35 mm</td>
			<td style="width:167px;">Corning</td>
			<td style="width:163px;">430588</td>
			<td>Not tissue culture treated</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:363px;">Mixed cellulose ester membrane, 0.22 &#956;m pore size</td>
			<td style="width:167px;">Millipore</td>
			<td>GSWP02500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:363px;">Impact-resistant tubes, 2 ml</td>
			<td style="width:167px;">USA Scientific</td>
			<td style="width:163px;">1420-9600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:363px;">Silica Beads, 0.1 mm</td>
			<td style="width:167px;">Biospec Products Inc</td>
			<td>11079101Z</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:363px;">Precellys 24 homogenizer</td>
			<td style="width:167px;">Bertin Instruments</td>
			<td style="width:163px;">EQ03119-200-RD000.0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:363px;">Micro BCA Protein Assay Kit</td>
			<td style="width:167px;">Pierce (Thermo Scientific)</td>
			<td style="width:163px;">23235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:363px;">Cogent Diamond hydride type C column</td>
			<td style="width:167px;">Agilent</td>
			<td style="width:163px;">70000-15P-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:363px;">Accurate-Mass Time-of-Flight (TOF) LC-MS, 6200 Series</td>
			<td style="width:167px;">Agilent</td>
			<td style="width:163px;">G6230B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:363px;">Quat Pump, 1290 Series</td>
			<td style="width:167px;">Agilent</td>
			<td style="width:163px;">G4204A&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:363px;">Bin Pump, 1290 Series</td>
			<td style="width:167px;">Agilent</td>
			<td style="width:163px;">G4220A&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:363px;">Valve Drive, 1290 Series</td>
			<td style="width:167px;">Agilent</td>
			<td style="width:163px;">G1107A&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:363px;">Isocratic Pump, 1290 Series</td>
			<td style="width:167px;">Agilent</td>
			<td style="width:163px;">G1310B&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:363px;">TCC, 1290 Series</td>
			<td style="width:167px;">Agilent</td>
			<td style="width:163px;">G1316C&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:363px;">Sampler, 1290 Series</td>
			<td style="width:167px;">Agilent</td>
			<td style="width:163px;">G4226A&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:363px;">Thermostat, 1290 Series</td>
			<td style="width:167px;">Agilent</td>
			<td style="width:163px;">G1330B&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Name</td>
			<td style="width:167px;">Company</td>
			<td style="width:163px;">Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:363px;">Chemical</td>
			<td style="width:167px;"></td>
			<td style="width:163px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:363px;">Tryptic Soy Broth</td>
			<td style="width:167px;">Becton Dickinson</td>
			<td style="width:163px;">211825</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:363px;">Difco Agar, Granulated</td>
			<td style="width:167px;">Becton Dickinson</td>
			<td style="width:163px;">214530</td>
			<td>Solid media contains 1.5% [w/v] agar</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:363px;">Phosphate-buffered saline (pH 7.4) 10X</td>
			<td style="width:167px;">Ambion</td>
			<td style="width:163px;">AM9624</td>
			<td>Dilute fresh to 1X with ultra-pure water</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:363px;">Acetonitrile</td>
			<td style="width:167px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:163px;">A955-500</td>
			<td>Optima LC-MS</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:363px;">Methanol</td>
			<td style="width:167px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:163px;">A456-500</td>
			<td>Optima LC-MS; toxic</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:363px;">Formic Acid</td>
			<td style="width:167px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:163px;">94318</td>
			<td>For mass spectrometry, 98%</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Name</td>
			<td style="width:167px;">Company</td>
			<td style="width:163px;">Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:363px;">Software</td>
			<td style="width:167px;"></td>
			<td style="width:163px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:363px;">MassHunter</td>
			<td style="width:167px;">Agilent</td>
			<td style="width:163px;">G3337AA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:363px;">Bacterial Strain</td>
			<td style="width:167px;">Species</td>
			<td style="width:163px;">Strain</td>
			<td>Genotype</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;width:363px;">SRB 337</td>
			<td style="width:167px;">Staphylococcus aureus</td>
			<td style="width:163px;">USA200 MSSA UAMS-1</td>
			<td>wild type</td>
		</tr>
		<tr height="39">
			<td height="39" style="height:39px;width:363px;">SRB 372</td>
			<td style="width:167px;">Staphylococcus aureus</td>
			<td style="width:163px;">USA200 MSSA UAMS-1</td>
			<td>&#916;codY::erm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:933px;">aChemicals and materials listed are specific to the method described and do not include standard laboratory chemicals or supplies.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a tandem liquid chromatography&#8211;mass spectrometry-based approach for metabolite analysis of staphylococcus aureus

Nel tentativo di contrastare i batteri patogeni, ospita spesso limitano la disponibilità di nutrienti nel sito di infezione. Questa limitazione può alterare le abbondanze dei metaboliti principali alle quali fattori regolatori rispondono, regolando il metabolismo cellulare. Negli ultimi anni, un certo numero di proteine ​​e RNA sono emersi come importanti regolatori dell&#39;espressione genica virulenza. Ad esempio, la proteina CODY risponde a livelli di amminoacidi ramificati e GTP ed è ampiamente conservato in basso G + C batteri Gram-positivi. Come regolatore globale Staphylococcus aureus, Cody controlla l&#39;espressione di decine di virulenza e geni metabolici. Ipotizziamo che S. aureus utilizza Cody, in parte, per alterare il suo stato metabolico nel tentativo di adattarsi alle condizioni di nutrienti limitativo potenzialmente presenti nell&#39;ambiente ospitante. Questo manoscritto descrive un metodo per l&#39;estrazione e l&#39;analisi metaboliti da S. aureus mediante cromatografia liquida accoppiata con spettrometria di massaspettrometria, un protocollo che è stato sviluppato per verificare questa ipotesi. Il metodo evidenzia anche migliori pratiche che garantiranno rigore e riproducibilità, come il mantenimento stato stazionario biologica e costante aerazione senza l&#39;uso di colture chemostato continue. Rispetto alle USA200 meticillina-sensibili S. aureus isolare UAMS-1 ceppo parentale, il isogenico CODY mutante esposto aumenti significativi amminoacidi derivati da aspartato (ad esempio, treonina e isoleucina) e diminuisce nei loro precursori (ad esempio, aspartato e O -acetylhomoserine ). Queste scoperte correlano bene con i dati trascrizionali ottenuti con l&#39;analisi di RNA-seq: geni in questi percorsi sono up-regolata tra 10 e 800 volte nel mutante nullo Cody. Accoppiamento analisi globali del trascrittoma e il metaboloma può rivelare come i batteri alterano il loro metabolismo di fronte a stress ambientale o nutrizionale, permettono di approfondire il potenziale nelle Physmodifiche iological associati a esaurimento degli elementi nutritivi sperimentato durante l&#39;infezione. Queste scoperte possono aprire la strada per lo sviluppo di nuovi agenti anti-infettivi e terapeutica.

Abbiamo analizzato piscine metaboliti intracellulari di S. aureus durante la crescita in vitro in una ricca, mezzo complesso. Come prova di principio, abbiamo confrontato i profili dei metaboliti tra il sensibile alla meticillina di S. aureus osteomielite isolare UAMS-1 (wild-type [WT]) e un ceppo isogenico manca il regolatore trascrizionale globale Cody (Δ Cody) 26. Stato stazionario, culture esponenziali dei ceppi WT e Co...

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A Tandem Liquid ChromatographyÃƒÆ’Ã‚Â¢ÃƒÂ¢Ã¢â‚¬Å¡Ã‚Â¬ÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã…â€œMass Spectrometry-based Approach for Metabolite Analysis of Staphylococcus aureus

Qui si descrive un protocollo per l&#39;estrazione di metaboliti da Staphylococcus aureus e la loro successiva analisi mediante cromatografia liquida e spettrometria di massa.

Un approccio Tandem HPLC-MS-based per analisi dei metaboliti di<em&gt; Staphylococcus aureus</em

In an effort to thwart bacterial pathogens, hosts often limit the availability of nutrients at the site of infection. This limitation can alter the ...

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A Tandem Liquid Chromatography&#8211;Mass Spectrometry-based Approach for Metabolite Analysis of Staphylococcus aureus

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