Name: a tandem liquid chromatography&#8211;mass spectrometry-based approach for metabolite analysis of staphylococcus aureus
Uploaded: 2017-03-28T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Tandem Liquid ChromatographyÃ¢â‚¬â€œMass Spectrometry-based Approach for Metabolite Analysis of Staphylococcus aureus at JoVE.com

Dette arbeidet ble finansiert delvis av en NIH Pathway to Independence Award (gi GM 099 893) og fakultet oppstart midler til SRB, samt et forskningsprosjekt Grant (gi GM 042 219). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og tolkning, eller beslutningen om å sende inn arbeidet for publisering.

1. Fremstilling av buffer- oppløsninger <ol><li> Forbered fosfat-bufret saltvann (PBS; pH 7,4) ved fortynning av en stamløsning av 10 x PBS til en sluttkonsentrasjon på 1 x med ultrarent (destillert og deionisert) vann. </li><li> Fremstill bråkjøling oppløsning ved å kombinere 2 ml av acetonitril, 2 ml metanol, 1 ml ultrarent H2O, og 19 ul (0,1 mM sluttkonsentrasjon) maursyre. </li><li> Forbered LC-MS løsningsmiddel A ved tilsetning av maursyre (0,2% [v / v] sluttkonsentrasjon) til ultrarent vann. <...

Alle lavmolekylære metabolitter er forbundet med hverandre gjennom deres felles opprinnelse i sentral metabolske veier. I løpet av eksponensiell vekst, bakterieceller er ved biologisk og metabolsk stabil tilstand, noe som gir et øyeblikksbilde av den fysiologiske tilstand som under visse betingelser. Cody overvåker næringsforsyning ved å svare på ILV og GTP. Som ILV og GTP bassenger slipp, er Cody aktivitet sannsynligvis gradvis redusert, justering av ekspresjon av dens målgener for å tilpasse seg stadig nærin...

Bakterielle patogener må stri med mange utfordringer innen verten miljøet. I tillegg til direkte angrep av celler i immunsystemet til verten sequesters også næringsstoffer essensielle for bakterieoverlevelse og replikasjon, genererer ernærings immunitet 1, 2. For å overleve disse fiendtlige miljøer, bakterielle patogener distribuere virulensfaktorer. Noen av disse faktorene tillater bakterier å unngå immunrespons; Andre faktorer er utskilt fordøyelsesenzymer, slik som hyaluronidase, thermonuclease, og lipase, noe som kan gjøre det mulig at bakterier for å etterfylle manglende næringsstoffer ved å forbruke vev-avledede komponenter 3, 4, 5. Faktisk har bakterier utviklet reguleringssystemer som binder den fysiologiske tilstanden til cellen for produksjon av virulensfaktorer 6, 7, <s<html> opp class = &quot;ekstern referanse&quot;&gt; 8, 9, 10. En økende mengde bevis peker på Cody som en viktig regulator som forbinder metabolisme og virulens. Selv om det først oppdaget i Bacillus subtilis som en undertrykker av dipeptidet permease (DPP) gen 11, Cody nå kjent for å bli produsert av nesten alle de lave G + C Gram-positive bakterier 12, 13 og regulerer mange gener som er involvert i karbon og nitrogenmetabolismen 14, 15, 16, 17, 18, 19. I patogene arter, Cody også styrer ekspresjonen av noen av de viktigste virulensgener 20, 21,. ef &quot;&gt; 22, 23, 24, 25, 26, 27 Cody aktiveres som et DNA-bindende protein ved to klasser av ligander: forgrenede aminosyrer (BCAA, isoleucin, leucin og valin [ILV]) og GTP . Når disse næringsstoffene er rikelig, undertrykker Cody (eller i noen tilfeller, stimulerer) transkripsjon. som disse næringsstoffene blir begrenset, Cody aktivitet gradvis redusert, noe som resulterer i en gradert transkripsjonen respons på at en overveier forløpere gjennom forskjellige metabolske veier som er koblet til det sentrale metabolisme 28, 29, 30. Tandem væskekromatografi koblet til massespektrometri (LC-MS) er en kraftfull teknikk som nøyaktig kan identifisere og kvantifisere lavmolekylære metabolitter intracellulære 31. Da sammen med transcriptome analyse (for eksempel RNA-Seq), denne analytiske arbeidsflyt kan gi innsikt i de fysiologiske endringer som oppstår i respons til omgivende eller ernæringsmessige belastning. Her presenterer vi en fremgangsmåte for metabolitt ekstraksjon fra Staphylococcus aureus-celler og etterfølgende analyse via LC-MS. Denne tilnærmingen har blitt brukt til å demonstrere en mitogen effekt av Cody på S. aureus fysiologi.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="933">
	<tbody>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:363px;">Material/Equipmenta</td>
			<td style="width:167px;"></td>
			<td style="width:163px;"></td>
			<td style="width:241px;"></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:363px;">DeLong Culture Flask (250 ml)</td>
			<td style="width:167px;">Belco</td>
			<td>2510-00250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:363px;">Sidearm Flask, 500 ml</td>
			<td style="width:167px;">Pyrex</td>
			<td style="width:163px;">5340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:363px;">3-hole Rubber Stopper, #7</td>
			<td style="width:167px;">Fisher</td>
			<td style="width:163px;">14-131E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:363px;">Stainless Steel Filter holder/frit</td>
			<td style="width:167px;">VWR</td>
			<td>89428-936</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:363px;">Petri Dish, 35 mm</td>
			<td style="width:167px;">Corning</td>
			<td style="width:163px;">430588</td>
			<td>Not tissue culture treated</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:363px;">Mixed cellulose ester membrane, 0.22 &#956;m pore size</td>
			<td style="width:167px;">Millipore</td>
			<td>GSWP02500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:363px;">Impact-resistant tubes, 2 ml</td>
			<td style="width:167px;">USA Scientific</td>
			<td style="width:163px;">1420-9600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:363px;">Silica Beads, 0.1 mm</td>
			<td style="width:167px;">Biospec Products Inc</td>
			<td>11079101Z</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:363px;">Precellys 24 homogenizer</td>
			<td style="width:167px;">Bertin Instruments</td>
			<td style="width:163px;">EQ03119-200-RD000.0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:363px;">Micro BCA Protein Assay Kit</td>
			<td style="width:167px;">Pierce (Thermo Scientific)</td>
			<td style="width:163px;">23235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:363px;">Cogent Diamond hydride type C column</td>
			<td style="width:167px;">Agilent</td>
			<td style="width:163px;">70000-15P-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:363px;">Accurate-Mass Time-of-Flight (TOF) LC-MS, 6200 Series</td>
			<td style="width:167px;">Agilent</td>
			<td style="width:163px;">G6230B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:363px;">Quat Pump, 1290 Series</td>
			<td style="width:167px;">Agilent</td>
			<td style="width:163px;">G4204A&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:363px;">Bin Pump, 1290 Series</td>
			<td style="width:167px;">Agilent</td>
			<td style="width:163px;">G4220A&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:363px;">Valve Drive, 1290 Series</td>
			<td style="width:167px;">Agilent</td>
			<td style="width:163px;">G1107A&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:363px;">Isocratic Pump, 1290 Series</td>
			<td style="width:167px;">Agilent</td>
			<td style="width:163px;">G1310B&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:363px;">TCC, 1290 Series</td>
			<td style="width:167px;">Agilent</td>
			<td style="width:163px;">G1316C&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:363px;">Sampler, 1290 Series</td>
			<td style="width:167px;">Agilent</td>
			<td style="width:163px;">G4226A&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:363px;">Thermostat, 1290 Series</td>
			<td style="width:167px;">Agilent</td>
			<td style="width:163px;">G1330B&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Name</td>
			<td style="width:167px;">Company</td>
			<td style="width:163px;">Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:363px;">Chemical</td>
			<td style="width:167px;"></td>
			<td style="width:163px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:363px;">Tryptic Soy Broth</td>
			<td style="width:167px;">Becton Dickinson</td>
			<td style="width:163px;">211825</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:363px;">Difco Agar, Granulated</td>
			<td style="width:167px;">Becton Dickinson</td>
			<td style="width:163px;">214530</td>
			<td>Solid media contains 1.5% [w/v] agar</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:363px;">Phosphate-buffered saline (pH 7.4) 10X</td>
			<td style="width:167px;">Ambion</td>
			<td style="width:163px;">AM9624</td>
			<td>Dilute fresh to 1X with ultra-pure water</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:363px;">Acetonitrile</td>
			<td style="width:167px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:163px;">A955-500</td>
			<td>Optima LC-MS</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:363px;">Methanol</td>
			<td style="width:167px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:163px;">A456-500</td>
			<td>Optima LC-MS; toxic</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:363px;">Formic Acid</td>
			<td style="width:167px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:163px;">94318</td>
			<td>For mass spectrometry, 98%</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Name</td>
			<td style="width:167px;">Company</td>
			<td style="width:163px;">Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:363px;">Software</td>
			<td style="width:167px;"></td>
			<td style="width:163px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:363px;">MassHunter</td>
			<td style="width:167px;">Agilent</td>
			<td style="width:163px;">G3337AA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:363px;">Bacterial Strain</td>
			<td style="width:167px;">Species</td>
			<td style="width:163px;">Strain</td>
			<td>Genotype</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;width:363px;">SRB 337</td>
			<td style="width:167px;">Staphylococcus aureus</td>
			<td style="width:163px;">USA200 MSSA UAMS-1</td>
			<td>wild type</td>
		</tr>
		<tr height="39">
			<td height="39" style="height:39px;width:363px;">SRB 372</td>
			<td style="width:167px;">Staphylococcus aureus</td>
			<td style="width:163px;">USA200 MSSA UAMS-1</td>
			<td>&#916;codY::erm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:933px;">aChemicals and materials listed are specific to the method described and do not include standard laboratory chemicals or supplies.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a tandem liquid chromatography&#8211;mass spectrometry-based approach for metabolite analysis of staphylococcus aureus

I et forsøk på å hindre bakterielle patogener, verter ofte begrense tilgjengeligheten av næringsstoffer i stedet for infeksjon. Denne begrensningen kan endre Forekomsten av viktige metabolitter som regulatoriske forhold reagerer, justere cellenes stoffskifte. I de senere år har en rekke proteiner og RNA seg å være viktige regulatorer av virulens genekspresjon. For eksempel, svarer Cody proteinet til nivåer av forgrenede aminosyrer og GTP og er mye konservert i lave G + C grampositive bakterier. Som en global regulator i Staphylococcus aureus, styrer Cody ekspresjonen av dusinvis av virulens og metabolske gener. Vi hypotese at S. aureus bruker Cody, delvis for å endre dets metabolske tilstand i et forsøk på å tilpasse seg til næringsbegrensende betingelser potensielt påtreffes i vertsmiljøet. Dette manuskriptet beskriver en metode for ekstrahering og analyse av metabolitter fra S. aureus ved å bruke væskekromatografi kombinert med massespekttrometry, en protokoll som ble utviklet for å teste denne hypotesen. Fremgangsmåten fremhever også fremgangsmåter som vil sikre rigor og reproduserbarhet, som for eksempel å opprettholde biologisk stabil og konstant lufting uten bruk av kontinuerlige kjemostat kulturer. I forhold til de USA200 meticillinfølsom S. aureus isolere UAMS-1 foreldrestammen, det isogen Cody mutant viste betydelige økninger i aminosyrer avledet fra aspartat (for eksempel treonin og isoleucin) og minskning av deres forløpere (for eksempel aspartat og O -acetylhomoserine ). Disse resultatene korrelerer godt med transkripsjonelle data oppnådd med RNA-seq analyse: gener i disse banene ble oppregulert mellom 10- og 800-fold i Cody null mutant. Kobling globale analyser av transkriptom og metabolomet kan avsløre hvordan bakterier endre deres stoffskifte når møtt med miljø eller ernæringsmessig stress, og gir potensial innsikt i Physiological forandringer assosiert med næringsutarming oppleves under infeksjon. Slike funn kan bane vei for utvikling av nye antiinfektiva og terapi.

Vi har analysert intracellulære metabolitt bassenger i S. aureus i løpet av in vitro-vekst i et rikt, komplekst medium. Som bevis på prinsippet, sammenlignet vi metabolittprofiler mellom meticillinfølsom S. aureus osteomyelitt isolere UAMS-1 (villtype [WT]) og en isogen stamme som mangler den globale transcriptional regulator Cody (Δ Cody) 26. Steady-state, ble det eksponensielle kulturer av WT og Cody stammer etab...

Watch this Scientific Journal Video about A Tandem Liquid ChromatographyÃ¢â‚¬â€œMass Spectrometry-based Approach for Metabolite Analysis of Staphylococcus aureus at JoVE.com

A Tandem Liquid ChromatographyÃƒÆ’Ã‚Â¢ÃƒÂ¢Ã¢â‚¬Å¡Ã‚Â¬ÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã…â€œMass Spectrometry-based Approach for Metabolite Analysis of Staphylococcus aureus

Her beskriver vi en protokoll for utvinning av metabolitter fra Staphylococcus aureus og deres påfølgende analyse via væske-kromatografi og massespektrometri.

Et tandem-væskekromatografi-massespektrometri basert tilnærming for Metabolitt Analyse av<em&gt; Staphylococcus aureus</em

In an effort to thwart bacterial pathogens, hosts often limit the availability of nutrients at the site of infection. This limitation can alter the ...

Research

JoVE Journal

Biochemistry

A Tandem Liquid Chromatography&#8211;Mass Spectrometry-based Approach for Metabolite Analysis of Staphylococcus aureus

A Facile and Efficient Approach for the Production of Reversible Disulfide Cross-linked Micelles

En Facile og effektiv tilnærming for produksjon av Reversibel disulfide tverrbundet Miceller

Nanomedicine is an emerging form of therapy that harnesses the unique properties of particles that are nanometers in scale for biomedical application. ...

A G-quadruplex DNA-affinity Approach for Purification of Enzymatically Active G4 Resolvase1

En G-quadruplex DNA-affinitet tilnærming for rensing av enzymatisk aktivt G4 Resolvase1

Higher-order nucleic acid structures called G-quadruplexes (G4s, G4 structures) can form in guanine-rich regions of both DNA and RNA and are highly ...

Sample Preparation for Mass Spectrometry-based Identification of RNA-binding Regions

Eksempel forberedelse til masse massespektrometri-baserte identifikasjon av RNA-bindende områder

Noncoding RNAs play important roles in several nuclear processes, including regulating gene expression, chromatin structure, and DNA repair. In most ...

2 in 1: One-step Affinity Purification for the Parallel Analysis of Protein-Protein and Protein-Metabolite Complexes

2 i 1: trinns affinitet rensing for parallell analyse av Protein-Protein og Protein-metabolitten komplekser

Cellular processes are regulated by interactions between biological molecules such as proteins, metabolites, and nucleic acids. While the investigation of ...

Identification of Novel CK2 Kinase Substrates Using a Versatile Biochemical Approach

Identifikasjon av romanen CK2 Kinase underlag med en allsidig biokjemiske tilnærming

The study of kinase-substrate relationships is essential to gain a complete understanding of the functions of these enzymes and their downstream targets ...

Using the Open-Source MALDI TOF-MS IDBac Pipeline for Analysis of Microbial Protein and Specialized Metabolite Data

Ved hjelp av Open-Source MALDI TOF-MS IDBac rørledning for analyse av mikrobiell protein og spesialiserte metabolitten data

In order to visualize the relationship between bacterial phylogeny and specialized metabolite production of bacterial colonies growing on nutrient agar, ...

A Customizable Approach for the Enzymatic Production and Purification of Diterpenoid Natural Products

En tilpasningsvennlig tilnærming for enzymatisk produksjon og rensing av Diterpenoid naturlige produkter

Diterpenoids form a diverse class of small molecule natural products that are widely distributed across the kingdoms of life and have critical biological ...

Quantitative Analysis of the Cellular Lipidome of Saccharomyces Cerevisiae Using Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry

Quantitative Analysis of the Cellular Lipidome of Saccharomyces Cerevisiae Using Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry

Kvantitativ analyse av cellulær lipidom eav saccharomyces cerevisiae ved hjelp av flytende kromatografi kombinert med tandem massespektrometri

Lipids are structurally diverse amphipathic molecules that are insoluble in water. Lipids are essential contributors to the organization and function of ...

Untargeted Liquid Chromatography-Mass Spectrometry-Based Metabolomics Analysis of Wheat Grain

Umålrettet flytende kromatografi-massespektrometribasert metabolomikkanalyse av hvetekorn

Understanding the interactions between genes, the environment and management in agricultural practice could allow more accurate prediction and management ...

Single Cell Analysis Of Transcriptionally Active Alleles By Single Molecule FISH

Enkeltcelleanalyse av transkripsjonsaktive alleler av enkeltmolekyl fisk

Gene transcription is an essential process in cell biology, and allows cells to interpret and respond to internal and external cues. Traditional bulk ...