Name: a tandem liquid chromatography&#8211;mass spectrometry-based approach for metabolite analysis of staphylococcus aureus
Uploaded: 2017-03-28T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Tandem Liquid ChromatographyÃ¢â‚¬â€œMass Spectrometry-based Approach for Metabolite Analysis of Staphylococcus aureus at JoVE.com

Este trabalho foi financiado em parte por uma NIH Pathway to Prêmio Independência (conceder GM 099.893) e os fundos de arranque faculdade de SRB, bem como um projeto de Grant Research (conceder GM 042.219). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e interpretação, ou a decisão de enviar o trabalho para publicação.

1. Preparação de Soluções Tampão <ol><li> Preparar solução salina tamponada com fosfato (PBS; pH 7,4) por diluição de uma solução de reserva de 10x PBS para uma concentração final de 1x com água ultrapura (desionizada destilada e). </li><li> Preparar a solução de têmpera através da combinação de 2 mL de acetonitrilo, 2 mL de metanol, 1 mL de H2O ultra-pura, e 19 uL (concentração final 0,1 mM) de ácido fórmico. </li><li> Prepare LC-MS solvente A pela adição de ácido fórmico (0,2% ...

Todos os metabolitos de pequenas moléculas são ligadas uma à outra através das suas origens comuns em vias metabólicas centrais. Durante o crescimento exponencial, as células bacterianas são em estado estacionário biológica e metabólica, fornecendo um instantâneo do estado fisiológico sob condições específicas. Cody monitora suficiência de nutrientes por responder a ILV e GTP. Como ILV e GTP piscinas gota, actividade Cody é provável progressivamente reduzido, ajustando a expressão dos seus genes-alvo ...

patógenos bacterianos devem lidar com muitos desafios dentro do ambiente de host. Além de ataque directo por células do sistema imunológico, o hospedeiro também sequestra nutrientes essenciais para a sobrevivência das bactérias e a replicação, gerando imunidade nutricional 1, 2. Para sobreviver nestes ambientes hostis, patógenos bacterianos implantar fatores de virulência. Alguns destes factores de permitir que as bactérias para evadir a resposta imune; Outros factores incluem segregada enzimas digestivas, tais como hialuronidase, termonuclease, e lipases, que podem permitir que as bactérias para reabastecer nutrientes em falta por consumir constituintes derivadas de tecido 3, 4, 5. Com efeito, as bactérias têm evoluído sistemas reguladores que ligam o estado fisiológico da célula para a produção de factores de virulência 6, 7, <s<html> -se class = &quot;xref&quot;&gt; 8, 9, 10. Um crescente corpo de evidências aponta para Cody como um regulador crítico que liga o metabolismo e virulência. Embora descoberto pela primeira vez em Bacillus subtilis como um repressor do gene dipéptido permease (dpp) 11, Cody é agora conhecido por ser produzido por quase todas as bactérias em G + C Gram-positivos baixos 12, 13 e regula dezenas de genes envolvidos em carbono e metabolismo 14, 15, 16, 17, 18, 19 de azoto. Em espécies patogénicas, Cody também controla a expressão de alguns dos mais importantes genes de virulência de 20, 21,. ef &quot;&gt; 22, 23, 24, 25, 26, 27 Cody é activada como uma proteína de ligação de ADN por duas classes de ligandos: aminoácidos de cadeia ramificada (BCAA, isoleucina, leucina, e valina [ILV]) e GTP . Quando estes nutrientes são abundante, Cody reprime (ou em alguns casos, estimula) a transcrição. Como estes nutrientes tornam-se limitadas, actividade Cody é progressivamente reduzido, o que resulta em uma resposta transcripcional graduada que re-rotas precursores por meio de várias vias metabólicas ligados ao metabolismo central 28, 29, 30. Em tandem cromatografia luida acoplada a espectrometria de massa (LC-MS) é uma técnica poderosa que pode identificar e quantificar com precisão pequenas moléculas metabolitos intracelulares 31. Quando emparelhado com transcanálise riptome (por exemplo, ARN-SEQ), este fluxo de trabalho analítico pode fornecer informações sobre as alterações fisiológicas que ocorrem em resposta ao stress ambiental ou nutricional. Aqui, apresentam-se um método para a extracção de metabolitos a partir de células de Staphylococcus aureus e subsequente análise por meio de LC-MS. Esta abordagem tem sido usada para demonstrar os efeitos pleiotrópicos das Cody sobre S. aureus fisiologia.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="933">
	<tbody>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:363px;">Material/Equipmenta</td>
			<td style="width:167px;"></td>
			<td style="width:163px;"></td>
			<td style="width:241px;"></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:363px;">DeLong Culture Flask (250 ml)</td>
			<td style="width:167px;">Belco</td>
			<td>2510-00250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:363px;">Sidearm Flask, 500 ml</td>
			<td style="width:167px;">Pyrex</td>
			<td style="width:163px;">5340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:363px;">3-hole Rubber Stopper, #7</td>
			<td style="width:167px;">Fisher</td>
			<td style="width:163px;">14-131E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:363px;">Stainless Steel Filter holder/frit</td>
			<td style="width:167px;">VWR</td>
			<td>89428-936</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:363px;">Petri Dish, 35 mm</td>
			<td style="width:167px;">Corning</td>
			<td style="width:163px;">430588</td>
			<td>Not tissue culture treated</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:363px;">Mixed cellulose ester membrane, 0.22 &#956;m pore size</td>
			<td style="width:167px;">Millipore</td>
			<td>GSWP02500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:363px;">Impact-resistant tubes, 2 ml</td>
			<td style="width:167px;">USA Scientific</td>
			<td style="width:163px;">1420-9600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:363px;">Silica Beads, 0.1 mm</td>
			<td style="width:167px;">Biospec Products Inc</td>
			<td>11079101Z</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:363px;">Precellys 24 homogenizer</td>
			<td style="width:167px;">Bertin Instruments</td>
			<td style="width:163px;">EQ03119-200-RD000.0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:363px;">Micro BCA Protein Assay Kit</td>
			<td style="width:167px;">Pierce (Thermo Scientific)</td>
			<td style="width:163px;">23235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:363px;">Cogent Diamond hydride type C column</td>
			<td style="width:167px;">Agilent</td>
			<td style="width:163px;">70000-15P-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:363px;">Accurate-Mass Time-of-Flight (TOF) LC-MS, 6200 Series</td>
			<td style="width:167px;">Agilent</td>
			<td style="width:163px;">G6230B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:363px;">Quat Pump, 1290 Series</td>
			<td style="width:167px;">Agilent</td>
			<td style="width:163px;">G4204A&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:363px;">Bin Pump, 1290 Series</td>
			<td style="width:167px;">Agilent</td>
			<td style="width:163px;">G4220A&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:363px;">Valve Drive, 1290 Series</td>
			<td style="width:167px;">Agilent</td>
			<td style="width:163px;">G1107A&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:363px;">Isocratic Pump, 1290 Series</td>
			<td style="width:167px;">Agilent</td>
			<td style="width:163px;">G1310B&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:363px;">TCC, 1290 Series</td>
			<td style="width:167px;">Agilent</td>
			<td style="width:163px;">G1316C&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:363px;">Sampler, 1290 Series</td>
			<td style="width:167px;">Agilent</td>
			<td style="width:163px;">G4226A&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:363px;">Thermostat, 1290 Series</td>
			<td style="width:167px;">Agilent</td>
			<td style="width:163px;">G1330B&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Name</td>
			<td style="width:167px;">Company</td>
			<td style="width:163px;">Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:363px;">Chemical</td>
			<td style="width:167px;"></td>
			<td style="width:163px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:363px;">Tryptic Soy Broth</td>
			<td style="width:167px;">Becton Dickinson</td>
			<td style="width:163px;">211825</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:363px;">Difco Agar, Granulated</td>
			<td style="width:167px;">Becton Dickinson</td>
			<td style="width:163px;">214530</td>
			<td>Solid media contains 1.5% [w/v] agar</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:363px;">Phosphate-buffered saline (pH 7.4) 10X</td>
			<td style="width:167px;">Ambion</td>
			<td style="width:163px;">AM9624</td>
			<td>Dilute fresh to 1X with ultra-pure water</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:363px;">Acetonitrile</td>
			<td style="width:167px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:163px;">A955-500</td>
			<td>Optima LC-MS</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:363px;">Methanol</td>
			<td style="width:167px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:163px;">A456-500</td>
			<td>Optima LC-MS; toxic</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:363px;">Formic Acid</td>
			<td style="width:167px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:163px;">94318</td>
			<td>For mass spectrometry, 98%</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Name</td>
			<td style="width:167px;">Company</td>
			<td style="width:163px;">Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:363px;">Software</td>
			<td style="width:167px;"></td>
			<td style="width:163px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:363px;">MassHunter</td>
			<td style="width:167px;">Agilent</td>
			<td style="width:163px;">G3337AA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:363px;">Bacterial Strain</td>
			<td style="width:167px;">Species</td>
			<td style="width:163px;">Strain</td>
			<td>Genotype</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;width:363px;">SRB 337</td>
			<td style="width:167px;">Staphylococcus aureus</td>
			<td style="width:163px;">USA200 MSSA UAMS-1</td>
			<td>wild type</td>
		</tr>
		<tr height="39">
			<td height="39" style="height:39px;width:363px;">SRB 372</td>
			<td style="width:167px;">Staphylococcus aureus</td>
			<td style="width:163px;">USA200 MSSA UAMS-1</td>
			<td>&#916;codY::erm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:933px;">aChemicals and materials listed are specific to the method described and do not include standard laboratory chemicals or supplies.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a tandem liquid chromatography&#8211;mass spectrometry-based approach for metabolite analysis of staphylococcus aureus

Em um esforço para frustrar patógenos bacterianos, os anfitriões muitas vezes limitam a disponibilidade de nutrientes no local da infecção. Esta limitação pode alterar as abundâncias de metabólitos chave para os quais fatores regulatórios respondem, ajustando o metabolismo celular. Nos últimos anos, um número de proteínas e de ARN surgiram como importantes reguladores da expressão de genes de virulência. Por exemplo, a proteína Cody responde a níveis de aminoácidos de cadeia ramificada e de GTP e é amplamente conservada em baixo G + C bactérias Gram-positivas. Como um regulador global em Staphylococcus aureus, Cody controla a expressão de dúzias de genes de virulência e metabólicas. Nossa hipótese é que S. aureus usa Cody, em parte, para alterar seu estado metabólico em um esforço para se adaptar às condições de limitação de nutrientes potencialmente encontrados no ambiente de host. Este manuscrito descreve um método para a extracção e análise de metabolitos a partir de S. aureus utilizando cromatografia líquida acoplada com espectrometria de massatrometry, um protocolo que foi desenvolvido para testar esta hipótese. O método também destaca as melhores práticas que irão garantir rigor e reprodutibilidade, tais como manter o estado estacionário biológico e aeração constante sem o uso de culturas quimiostato contínuas. Em relação aos USA200 sensível à meticilina S. aureus isolar UAMS-1 estirpe parental, o mutante isogico Cody exibiram aumentos significativos na aminoácidos derivados a partir de aspartato (por exemplo, treonina e isoleucina) e diminui em seus precursores (por exemplo, aspartato e O -acetylhomoserine ). Estes resultados correlacionam-se bem com os dados obtidos com análise de transcrição de ARN-seguintes: os genes nestas vias foram supra-regulados entre 10 e 800 vezes no mutante nulo Cody. Acoplamento análises globais do transcriptoma e metaboloma pode revelar como as bactérias alterar o seu metabolismo, quando confrontado com o estresse ambiental ou nutricional, proporcionando potencial visão sobre as physmudanças iological associados com esgotamento de nutrientes experimentado durante a infecção. Tais descobertas podem abrir o caminho para o desenvolvimento de novos anti-infecciosos e terapêutica.

Analisamos piscinas metabolitos intracelulares em S. aureus durante crescimento in vitro num meio rico, complexo. Como prova de princípio, foram comparados os perfis de metabolitos entre o S. aureus sensível à meticilina osteomielite isolar UAMS-1 (tipo selvagem [WT]) e uma estirpe isogénica sem o regulador transcricional mundial Cody (Δ Cody) 26. O estado estacionário, culturas exponenciais das estirpes WT e Cody...

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A Tandem Liquid ChromatographyÃƒÆ’Ã‚Â¢ÃƒÂ¢Ã¢â‚¬Å¡Ã‚Â¬ÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã…â€œMass Spectrometry-based Approach for Metabolite Analysis of Staphylococcus aureus

Aqui, descrevemos um protocolo para a extracção de metabolitos a partir de Staphylococcus aureus e a sua subsequente análise por meio de cromatografia líquida e espectrometria de massa.

Uma abordagem baseada em Espectrometria Tandem Cromatografia Líquida de Massachusetts para análise de metabolitos de<em&gt; Staphylococcus aureus</em

In an effort to thwart bacterial pathogens, hosts often limit the availability of nutrients at the site of infection. This limitation can alter the ...

Research

JoVE Journal

Biochemistry

A Tandem Liquid Chromatography&#8211;Mass Spectrometry-based Approach for Metabolite Analysis of Staphylococcus aureus

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Nanomedicine is an emerging form of therapy that harnesses the unique properties of particles that are nanometers in scale for biomedical application. ...

Bioquímica

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Usando o pipeline de código aberto MALDI TOF-MS IDBac para análise de proteína microbiana e dados metabólito especializados

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Análise Quantitativa do Lipidome Celular de Saccharomyces Cerevisiae Usando Cromatografia Líquida Juntamente com Espectrometria de Massa de Tandem

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Gene transcription is an essential process in cell biology, and allows cells to interpret and respond to internal and external cues. Traditional bulk ...