Name: a tandem liquid chromatography&#8211;mass spectrometry-based approach for metabolite analysis of staphylococcus aureus
Uploaded: 2017-03-28T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Tandem Liquid ChromatographyÃ¢â‚¬â€œMass Spectrometry-based Approach for Metabolite Analysis of Staphylococcus aureus at JoVE.com

Эта работа была частично финансируется с помощью NIH Пути к независимости премии (грант GM 099893) и запуск факультета средств на СРБ, а также научно-исследовательский грант проекта (грант GM 042219). В спонсорам не играет никакой роли в дизайн исследования, сбора и интерпретации данных, или решение представить работу для публикации.

1. Приготовление буферных растворов <ol><li> Подготовка фосфатно-солевого буфера (PBS,; рН 7,4) путем разбавления исходного раствора 10х PBS до конечной концентрации 1х с сверхчистых (дистиллированной и деионизированной) водой. </li><li> Готовят раствор закалки путем объединения 2 мл ацетонитрила, 2 ...

Все метаболиты малых молекул связаны друг с другом через их общее происхождение в центральных метаболических путях. Во время экспоненциального роста, бактериальные клетки находятся в биологическом и метаболическом стационарном состоянии, обеспечивая снимок физиологического состоя...

Бактериальные патогены должны бороться со многими проблемами в пределах принимающей среды. В дополнении к прямой атаке иммунных клеток, хозяин также изолирует питательные вещества , необходимые для выживания бактерий и репликации, генерирующие питательная иммунитета 1, 2. Чтобы выжить эти враждебные среды, бактериальные патогены развертывания факторов вирулентности. Некоторые из этих факторов позволяет бактериям уклоняться от иммунного ответа; Другие факторы включают секретируются пищеварительные ферменты, такие как гиалуронидаза, thermonuclease, и липазы, которые могут позволить бактерии пополнить недостающие питательные вещества, потребляя ткани , полученные составляющие 3, 4, 5. В самом деле, бактерии развивались регуляторные системы , которые связывают физиологическое состояние клетки к продукции факторов вирулентности 6, 7, <s<html> до класса = &quot;внешних ссылок&quot;&gt; 8, 9, 10. Все больше данных указывает на Коди в качестве критического регулятора, связывающего обмен веществ и вирулентность. Несмотря на то, впервые обнаружен в Bacillus зиЫШз как репрессор гена 11 дипептид пермеазы (ДПП), Cody теперь известно, производится почти всеми низкими G + C , грам-положительных бактерий , 12, 13 и регулирует множество генов , участвующих в угле и азота , метаболизм 14, 15, 16, 17, 18, 19. В патогенных видов, Cody также контролирует экспрессию некоторых из наиболее важных генов вирулентности 20, 21,. эф &quot;&gt; 22, 23, 24, 25, 26, 27 Cody активируется в качестве белка ДНК-связывающего два класса лигандов: с разветвленной цепью аминокислот (ВСАА; изолейцин, лейцин и валин [РКН]) и ГТФ . Когда эти питательные вещества в изобилии, Cody репрессирует (или в некоторых случаях, стимулирует) транскрипцию. Поскольку эти питательные вещества становятся ограниченными, активность Cody постепенно уменьшается, что приводит к градуированному транскрипционному ответу, который перенаправляет предшественник с помощью различных метаболических путей, связанных с центральным метаболизмом 28, 29, 30. Тандем жидкостной хроматографии в сочетании с масс - спектрометрией (ЖХ-МС) представляет собой мощный метод , который может точно определить и количественно малые молекулы внутриклеточных метаболитов 31. В сочетании с Закавкriptome анализ (например, РНК-Seq), этот аналитический рабочий процесс может дать представление о физиологических изменениях , которые происходят в ответ на экологический или питательный стресс. Здесь мы представляем метод для экстракции метаболита из клеток золотистого стафилококка и последующего анализа с помощью LC-MS. Этот подход был использован для демонстрации плеотропных эффектов Кодьте на золотистом стафилококке физиологии.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="933">
	<tbody>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:363px;">Material/Equipmenta</td>
			<td style="width:167px;"></td>
			<td style="width:163px;"></td>
			<td style="width:241px;"></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:363px;">DeLong Culture Flask (250 ml)</td>
			<td style="width:167px;">Belco</td>
			<td>2510-00250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:363px;">Sidearm Flask, 500 ml</td>
			<td style="width:167px;">Pyrex</td>
			<td style="width:163px;">5340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:363px;">3-hole Rubber Stopper, #7</td>
			<td style="width:167px;">Fisher</td>
			<td style="width:163px;">14-131E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:363px;">Stainless Steel Filter holder/frit</td>
			<td style="width:167px;">VWR</td>
			<td>89428-936</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:363px;">Petri Dish, 35 mm</td>
			<td style="width:167px;">Corning</td>
			<td style="width:163px;">430588</td>
			<td>Not tissue culture treated</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:363px;">Mixed cellulose ester membrane, 0.22 &#956;m pore size</td>
			<td style="width:167px;">Millipore</td>
			<td>GSWP02500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:363px;">Impact-resistant tubes, 2 ml</td>
			<td style="width:167px;">USA Scientific</td>
			<td style="width:163px;">1420-9600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:363px;">Silica Beads, 0.1 mm</td>
			<td style="width:167px;">Biospec Products Inc</td>
			<td>11079101Z</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:363px;">Precellys 24 homogenizer</td>
			<td style="width:167px;">Bertin Instruments</td>
			<td style="width:163px;">EQ03119-200-RD000.0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:363px;">Micro BCA Protein Assay Kit</td>
			<td style="width:167px;">Pierce (Thermo Scientific)</td>
			<td style="width:163px;">23235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:363px;">Cogent Diamond hydride type C column</td>
			<td style="width:167px;">Agilent</td>
			<td style="width:163px;">70000-15P-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:363px;">Accurate-Mass Time-of-Flight (TOF) LC-MS, 6200 Series</td>
			<td style="width:167px;">Agilent</td>
			<td style="width:163px;">G6230B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:363px;">Quat Pump, 1290 Series</td>
			<td style="width:167px;">Agilent</td>
			<td style="width:163px;">G4204A&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:363px;">Bin Pump, 1290 Series</td>
			<td style="width:167px;">Agilent</td>
			<td style="width:163px;">G4220A&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:363px;">Valve Drive, 1290 Series</td>
			<td style="width:167px;">Agilent</td>
			<td style="width:163px;">G1107A&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:363px;">Isocratic Pump, 1290 Series</td>
			<td style="width:167px;">Agilent</td>
			<td style="width:163px;">G1310B&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:363px;">TCC, 1290 Series</td>
			<td style="width:167px;">Agilent</td>
			<td style="width:163px;">G1316C&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:363px;">Sampler, 1290 Series</td>
			<td style="width:167px;">Agilent</td>
			<td style="width:163px;">G4226A&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:363px;">Thermostat, 1290 Series</td>
			<td style="width:167px;">Agilent</td>
			<td style="width:163px;">G1330B&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Name</td>
			<td style="width:167px;">Company</td>
			<td style="width:163px;">Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:363px;">Chemical</td>
			<td style="width:167px;"></td>
			<td style="width:163px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:363px;">Tryptic Soy Broth</td>
			<td style="width:167px;">Becton Dickinson</td>
			<td style="width:163px;">211825</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:363px;">Difco Agar, Granulated</td>
			<td style="width:167px;">Becton Dickinson</td>
			<td style="width:163px;">214530</td>
			<td>Solid media contains 1.5% [w/v] agar</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:363px;">Phosphate-buffered saline (pH 7.4) 10X</td>
			<td style="width:167px;">Ambion</td>
			<td style="width:163px;">AM9624</td>
			<td>Dilute fresh to 1X with ultra-pure water</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:363px;">Acetonitrile</td>
			<td style="width:167px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:163px;">A955-500</td>
			<td>Optima LC-MS</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:363px;">Methanol</td>
			<td style="width:167px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:163px;">A456-500</td>
			<td>Optima LC-MS; toxic</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:363px;">Formic Acid</td>
			<td style="width:167px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:163px;">94318</td>
			<td>For mass spectrometry, 98%</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Name</td>
			<td style="width:167px;">Company</td>
			<td style="width:163px;">Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:363px;">Software</td>
			<td style="width:167px;"></td>
			<td style="width:163px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:363px;">MassHunter</td>
			<td style="width:167px;">Agilent</td>
			<td style="width:163px;">G3337AA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:363px;">Bacterial Strain</td>
			<td style="width:167px;">Species</td>
			<td style="width:163px;">Strain</td>
			<td>Genotype</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;width:363px;">SRB 337</td>
			<td style="width:167px;">Staphylococcus aureus</td>
			<td style="width:163px;">USA200 MSSA UAMS-1</td>
			<td>wild type</td>
		</tr>
		<tr height="39">
			<td height="39" style="height:39px;width:363px;">SRB 372</td>
			<td style="width:167px;">Staphylococcus aureus</td>
			<td style="width:163px;">USA200 MSSA UAMS-1</td>
			<td>&#916;codY::erm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:933px;">aChemicals and materials listed are specific to the method described and do not include standard laboratory chemicals or supplies.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a tandem liquid chromatography&#8211;mass spectrometry-based approach for metabolite analysis of staphylococcus aureus

В попытке сорвать бактериальные патогены, хозяева часто ограничивают доступность питательных веществ в месте инфекции. Это ограничение может изменить содержания ключевых метаболитов, которые регуляторные факторы отвечают, регулируя клеточный метаболизм. В последние годы ряд белков и РНК стали важными регуляторами экспрессии генов вирулентности. Так, например, белок Cody реагирует на уровни разветвленных аминокислот и ГТФ и широко сохраняется в условиях низкой G + C грамположительных бактерий. В качестве глобального регулятора в стафилококк, Cody контролирует экспрессию десятков вирулентности и метаболических генов. Мы предполагаем , что золотистый стафилококк использует Коди, в частности, для изменения его метаболического состояния в целях адаптации к питательным ограничивающим условиям , потенциально встречающимся в принимающей среде. Эта рукопись описывает способ экстракции и анализа метаболитов из золотистого стафилококка с использованием жидкостной хроматографии в сочетании с масс - спектрометрическихtrometry, протокол, который был разработан, чтобы проверить эту гипотезу. Метод также подчеркивает лучшие практики, которые будут обеспечивать строгость и воспроизводимость, такие как поддержание биологического устойчивого состояния и постоянная аэрации без использования непрерывных культур хемостатических. По отношению к USA200 метициллин-чувствительных золотистого стафилококка изолировать UAMS-1 родительского штамма, изогенных Cody мутант показал значительное увеличение аминокислот , полученных из аспартата (например, треонин и изолейцин) и уменьшается в их предшественников (например, аспартат и О -acetylhomoserine ). Эти результаты хорошо коррелируют с данными , полученными транскрипционных с РНК-сл анализа: гены в этих путей были повышающей регуляции между 10- и 800-кратного в нуль - мутанта Cody. Сцепление глобальных анализов транскриптома и метабол может показать, как бактерии изменяют свой метаболизм, когда сталкиваются с экологическим или питательным стрессом, обеспечивая потенциальное понимание в Physiological изменения, связанные с истощением питательных веществ испытали во время инфекции. Такие открытия могут проложить путь к разработке новых антибактериальных и терапевтических средств.

Мы провели анализ внутриклеточных пулов метаболита в золотистого стафилококка в процессе роста в пробирке в богатой, сложной среде. В качестве доказательства принципа, мы сравнили метаболит профили между метициллиночувствительным золотистым стафилокок...

Watch this Scientific Journal Video about A Tandem Liquid ChromatographyÃ¢â‚¬â€œMass Spectrometry-based Approach for Metabolite Analysis of Staphylococcus aureus at JoVE.com

A Tandem Liquid ChromatographyÃƒÆ’Ã‚Â¢ÃƒÂ¢Ã¢â‚¬Å¡Ã‚Â¬ÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã…â€œMass Spectrometry-based Approach for Metabolite Analysis of Staphylococcus aureus

Здесь мы опишем протокол для экстракции метаболитов из золотистого стафилококка и их последующего анализа с помощью жидкостной хроматографии и масс - спектрометрии.

Тандем жидкостной хроматографии на основе подхода для анализа метаболитов<em&gt; Золотистый стафилококк</em

In an effort to thwart bacterial pathogens, hosts often limit the availability of nutrients at the site of infection. This limitation can alter the ...

Research

JoVE Journal

Biochemistry

A Tandem Liquid Chromatography&#8211;Mass Spectrometry-based Approach for Metabolite Analysis of Staphylococcus aureus

A Facile and Efficient Approach for the Production of Reversible Disulfide Cross-linked Micelles

Легким и эффективным подходом к производству Реверсивный дисульфид поперечно-сшитого мицелл

Nanomedicine is an emerging form of therapy that harnesses the unique properties of particles that are nanometers in scale for biomedical application. ...

A G-quadruplex DNA-affinity Approach for Purification of Enzymatically Active G4 Resolvase1

G-квадруплекс ДНК-сродства подход для очистки ферментативно активной G4 Resolvase1

Higher-order nucleic acid structures called G-quadruplexes (G4s, G4 structures) can form in guanine-rich regions of both DNA and RNA and are highly ...

Sample Preparation for Mass Spectrometry-based Identification of RNA-binding Regions

Пробоподготовка для массы на основе спектрометрии идентификации RNA-связывая регионов

Noncoding RNAs play important roles in several nuclear processes, including regulating gene expression, chromatin structure, and DNA repair. In most ...

2 in 1: One-step Affinity Purification for the Parallel Analysis of Protein-Protein and Protein-Metabolite Complexes

2 в 1: один шаг очищение сродства для параллельного анализа протеин протеина и белка метаболит комплексов

Cellular processes are regulated by interactions between biological molecules such as proteins, metabolites, and nucleic acids. While the investigation of ...

Identification of Novel CK2 Kinase Substrates Using a Versatile Biochemical Approach

Идентификация Роман CK2 киназы субстратов, используя универсальный подход биохимические

The study of kinase-substrate relationships is essential to gain a complete understanding of the functions of these enzymes and their downstream targets ...

Using the Open-Source MALDI TOF-MS IDBac Pipeline for Analysis of Microbial Protein and Specialized Metabolite Data

Использование трубопровода MALDI TOF-MS IDBac с открытым исходным кодом для анализа микробного белка и специализированных метаболитных данных

In order to visualize the relationship between bacterial phylogeny and specialized metabolite production of bacterial colonies growing on nutrient agar, ...

A Customizable Approach for the Enzymatic Production and Purification of Diterpenoid Natural Products

Настраиваемый подход к ферментативным производством и очистке терепенидов натуральных продуктов

Diterpenoids form a diverse class of small molecule natural products that are widely distributed across the kingdoms of life and have critical biological ...

Quantitative Analysis of the Cellular Lipidome of Saccharomyces Cerevisiae Using Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry

Quantitative Analysis of the Cellular Lipidome of Saccharomyces Cerevisiae Using Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry

Количественный анализ клеточного липидома Сахаромиса Церевизии с использованием жидкой хроматографии в сочетании с тандемной масс-спектрометрией

Lipids are structurally diverse amphipathic molecules that are insoluble in water. Lipids are essential contributors to the organization and function of ...

Untargeted Liquid Chromatography-Mass Spectrometry-Based Metabolomics Analysis of Wheat Grain

Нецелевая жидкая хроматография-масс-спектрометрия на основе метаболомики Анализ зерна пшеницы

Understanding the interactions between genes, the environment and management in agricultural practice could allow more accurate prediction and management ...

Single Cell Analysis Of Transcriptionally Active Alleles By Single Molecule FISH

Одноклеточный анализ транскрипционно активных аллелей одной молекулой FISH

Gene transcription is an essential process in cell biology, and allows cells to interpret and respond to internal and external cues. Traditional bulk ...