Name: a tandem liquid chromatography&#8211;mass spectrometry-based approach for metabolite analysis of staphylococcus aureus
Uploaded: 2017-03-28T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Tandem Liquid ChromatographyÃ¢â‚¬â€œMass Spectrometry-based Approach for Metabolite Analysis of Staphylococcus aureus at JoVE.com

Detta arbete har finansierats delvis av en NIH Pathway to Independence Award (bevilja GM 099.893) och fakultets start medel till SRB, liksom ett forskningsprojekt Grant (Grant GM 042.219). Finansiärerna hade ingen roll i studiedesign, datainsamling och tolkning, eller beslutet att lämna arbetet för publicering.

1. Framställning av buffertlösningar <ol><li> Förbereda fosfatbuffrad saltlösning (PBS; pH 7,4) genom att späda en förrådslösning av 10x PBS till en slutlig koncentration av 1 x med ultrarent (destillerad och avjoniserat) vatten. </li><li> Bereda härdningslösning genom att kombinera 2 ml acetonitril, 2 ml metanol, 1 ml ultrarent H2O, och 19 | il (0,1 mM slutlig koncentration) myrsyra. </li><li> Förbereda LC-MS lösningsmedel A genom tillsats av myrsyra (0,2% [v / v] slutlig koncentration) till ul...

Alla småmolekylära metaboliter är anslutna till varandra genom deras gemensamma ursprung i centrala metaboliska vägar. Under exponentiell tillväxt, bakterieceller är på biologisk och metabolisk stabilt tillstånd, vilket ger en ögonblicksbild av det fysiologiska tillståndet under specifika betingelser. Cody följer näringsämnen tillräcklighet genom att svara på ILV och GTP. Som ILV och GTP pooler droppe, är Cody aktivitet sannolikt gradvis sänks, justering av expression av dess målgener att anpassa sig t...

Bakteriella patogener måste brottas med många utmaningar inom värdmiljön. Förutom direkt attack av immunceller, värden sequesters också näringsämnen som är nödvändiga för bakteriell överlevnad och replikering, generera närings immunitet 1, 2. För att överleva dessa fientliga miljöer, bakteriella patogener distribuera virulensfaktorer. Några av dessa faktorer gör det möjligt för bakterierna att undgå immunsvaret; Andra faktorer inkluderar utsöndrade matsmältningsenzymer, såsom hyaluronidas, thermonuclease, och lipas, som kan göra det möjligt för bakterierna att fylla saknade näringsämnen genom att konsumera vävnadshärledda beståndsdelar 3, 4, 5. I själva verket har bakterier utvecklats regelsystem som binder den fysiologiska tillståndet hos cellen till produktionen av virulensfaktorer 6, 7, <s<html> upp class = &quot;xref&quot;&gt; 8, 9, 10. En växande mängd bevis pekar på Cody som en kritisk regulator som förbinder metabolism och virulens. Även upptäcktes först i Bacillus subtilis som en repressor av dipeptiden permeaset (dpp) -genen 11, är Cody nu känt för att produceras av nästan alla de låga G + C grampositiva bakterier 12, 13 och reglerar tiotals gener involverade i kol och kvävemetabolism 14, 15, 16, 17, 18, 19. I patogena arter, Cody kontrollerar även expressionen av några av de viktigaste virulensgener 20, 21,. ef &quot;&gt; 22, 23, 24, 25, 26, 27 Cody aktiveras som ett DNA-bindande protein av två klasser av ligander: grenkedjiga aminosyror (BCAA, isoleucin, leucin, och valin [ILV]) och GTP . När dessa näringsämnen är riklig, rycker Cody (eller i vissa fall, stimulerar) transkription. Eftersom dessa näringsämnen bli begränsade, är Cody aktivitet gradvis minskas, vilket resulterar i en graderad transkriptionell svar som re-rutter prekursorer genom olika metaboliska vägar som är anslutna till centrala metabolism 28, 29, 30. Tandem vätskekromatografi kopplad till masspektrometri (LC-MS) är en kraftfull teknik som exakt kan identifiera och kvantifiera småmolekylära intracellulära metaboliter 31. När ihopkopplad med transcriptome analys (t ex RNA-Seq), denna analytiska arbetsflöde kan ge insikt i de fysiologiska förändringar som sker som svar på miljö eller näringsstress. Här presenterar vi en metod för metabolit extraktion från Staphylococcus aureus-celler och efterföljande analys via LC-MS. Denna metod har använts för att demonstrera pleiotropa effekterna av Cody på S. aureus fysiologi.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="933">
	<tbody>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:363px;">Material/Equipmenta</td>
			<td style="width:167px;"></td>
			<td style="width:163px;"></td>
			<td style="width:241px;"></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:363px;">DeLong Culture Flask (250 ml)</td>
			<td style="width:167px;">Belco</td>
			<td>2510-00250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:363px;">Sidearm Flask, 500 ml</td>
			<td style="width:167px;">Pyrex</td>
			<td style="width:163px;">5340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:363px;">3-hole Rubber Stopper, #7</td>
			<td style="width:167px;">Fisher</td>
			<td style="width:163px;">14-131E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:363px;">Stainless Steel Filter holder/frit</td>
			<td style="width:167px;">VWR</td>
			<td>89428-936</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:363px;">Petri Dish, 35 mm</td>
			<td style="width:167px;">Corning</td>
			<td style="width:163px;">430588</td>
			<td>Not tissue culture treated</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:363px;">Mixed cellulose ester membrane, 0.22 &#956;m pore size</td>
			<td style="width:167px;">Millipore</td>
			<td>GSWP02500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:363px;">Impact-resistant tubes, 2 ml</td>
			<td style="width:167px;">USA Scientific</td>
			<td style="width:163px;">1420-9600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:363px;">Silica Beads, 0.1 mm</td>
			<td style="width:167px;">Biospec Products Inc</td>
			<td>11079101Z</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:363px;">Precellys 24 homogenizer</td>
			<td style="width:167px;">Bertin Instruments</td>
			<td style="width:163px;">EQ03119-200-RD000.0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:363px;">Micro BCA Protein Assay Kit</td>
			<td style="width:167px;">Pierce (Thermo Scientific)</td>
			<td style="width:163px;">23235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:363px;">Cogent Diamond hydride type C column</td>
			<td style="width:167px;">Agilent</td>
			<td style="width:163px;">70000-15P-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:363px;">Accurate-Mass Time-of-Flight (TOF) LC-MS, 6200 Series</td>
			<td style="width:167px;">Agilent</td>
			<td style="width:163px;">G6230B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:363px;">Quat Pump, 1290 Series</td>
			<td style="width:167px;">Agilent</td>
			<td style="width:163px;">G4204A&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:363px;">Bin Pump, 1290 Series</td>
			<td style="width:167px;">Agilent</td>
			<td style="width:163px;">G4220A&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:363px;">Valve Drive, 1290 Series</td>
			<td style="width:167px;">Agilent</td>
			<td style="width:163px;">G1107A&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:363px;">Isocratic Pump, 1290 Series</td>
			<td style="width:167px;">Agilent</td>
			<td style="width:163px;">G1310B&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:363px;">TCC, 1290 Series</td>
			<td style="width:167px;">Agilent</td>
			<td style="width:163px;">G1316C&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:363px;">Sampler, 1290 Series</td>
			<td style="width:167px;">Agilent</td>
			<td style="width:163px;">G4226A&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:363px;">Thermostat, 1290 Series</td>
			<td style="width:167px;">Agilent</td>
			<td style="width:163px;">G1330B&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Name</td>
			<td style="width:167px;">Company</td>
			<td style="width:163px;">Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:363px;">Chemical</td>
			<td style="width:167px;"></td>
			<td style="width:163px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:363px;">Tryptic Soy Broth</td>
			<td style="width:167px;">Becton Dickinson</td>
			<td style="width:163px;">211825</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:363px;">Difco Agar, Granulated</td>
			<td style="width:167px;">Becton Dickinson</td>
			<td style="width:163px;">214530</td>
			<td>Solid media contains 1.5% [w/v] agar</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:363px;">Phosphate-buffered saline (pH 7.4) 10X</td>
			<td style="width:167px;">Ambion</td>
			<td style="width:163px;">AM9624</td>
			<td>Dilute fresh to 1X with ultra-pure water</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:363px;">Acetonitrile</td>
			<td style="width:167px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:163px;">A955-500</td>
			<td>Optima LC-MS</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:363px;">Methanol</td>
			<td style="width:167px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:163px;">A456-500</td>
			<td>Optima LC-MS; toxic</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:363px;">Formic Acid</td>
			<td style="width:167px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:163px;">94318</td>
			<td>For mass spectrometry, 98%</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Name</td>
			<td style="width:167px;">Company</td>
			<td style="width:163px;">Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:363px;">Software</td>
			<td style="width:167px;"></td>
			<td style="width:163px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:363px;">MassHunter</td>
			<td style="width:167px;">Agilent</td>
			<td style="width:163px;">G3337AA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:363px;">Bacterial Strain</td>
			<td style="width:167px;">Species</td>
			<td style="width:163px;">Strain</td>
			<td>Genotype</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;width:363px;">SRB 337</td>
			<td style="width:167px;">Staphylococcus aureus</td>
			<td style="width:163px;">USA200 MSSA UAMS-1</td>
			<td>wild type</td>
		</tr>
		<tr height="39">
			<td height="39" style="height:39px;width:363px;">SRB 372</td>
			<td style="width:167px;">Staphylococcus aureus</td>
			<td style="width:163px;">USA200 MSSA UAMS-1</td>
			<td>&#916;codY::erm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:933px;">aChemicals and materials listed are specific to the method described and do not include standard laboratory chemicals or supplies.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a tandem liquid chromatography&#8211;mass spectrometry-based approach for metabolite analysis of staphylococcus aureus

I ett försök att omintetgöra bakteriella patogener, värdar begränsar ofta tillgången på näringsämnen på platsen för infektionen. Denna begränsning kan ändra bestånd av viktiga metaboliter som regulatoriska faktorer svarar, justera cellulär metabolism. Under de senaste åren har ett antal proteiner och RNA framträtt som viktiga regulatorer av virulens genuttryck. Till exempel, svarar Cody proteinet till nivåer av grenkedjiga aminosyror och GTP och är allmänt konserverad i lågt G + C grampositiva bakterier. Som en global regulator i Staphylococcus aureus, styr Cody uttrycket av dussintals virulens och metaboliska gener. Vår hypotes är att S. aureus använder Cody, delvis för att ändra dess metaboliska tillstånd i ett försök att anpassa sig till näringsbegränsande förhållanden potentiellt förekommer i värdmiljön. Detta manuskript beskriver en metod för att extrahera och analysera metaboliter från S. aureus med användning av vätskekromatografi kopplat med masspektrometry, ett protokoll som utvecklats för att testa denna hypotes. Metoden belyser också bästa sätt som säkerställer noggrannhet och reproducerbarhet, såsom bibehållande biologisk stationärt tillstånd och konstant luftning utan användning av kontinuerliga kemostat kulturer. Relativt de USA200 meticillinkänsliga S. aureus isolat UAMS-1 föräldrastammen, uppvisade den isogena Cody mutanten signifikanta ökningar i aminosyror härledda från aspartat (t.ex. treonin och isoleucin) och minskar i deras prekursorer (t ex aspartat och O acetylhomoserin ). Dessa fynd korrelerar väl med transkriptionella data erhållna med RNA-seq analys: gener i dessa vägar uppreglerades mellan 10- och 800-faldigt i Cody null mutant. Koppling globala analyser av transkriptom och metabolomet kan avslöja hur bakterier förändrar deras metabolism när man står inför miljö- eller närings stress, ger potential inblick i Physiological förändringar i samband med näringsämnen utarmning upplevt under infektion. Sådana upptäckter kan bana väg för utveckling av nya medel mot infektioner och läkemedel.

Vi har analyserat intracellulära metabolit pooler i S. aureus under in vitro tillväxt i ett rikt, komplext medium. Som bevis på principen, jämförde vi metabolit profiler mellan meticillinkänsliga S. aureus osteomyelit isolera UAMS-1 (vildtyp [WT]) och en isogen stam som saknar den globala transkriptionsregulator Cody (Δ Cody) 26. Steady-state, exponentiella kulturer av stammarna WT och Cody fastställdes i TSB-me...

Watch this Scientific Journal Video about A Tandem Liquid ChromatographyÃ¢â‚¬â€œMass Spectrometry-based Approach for Metabolite Analysis of Staphylococcus aureus at JoVE.com

A Tandem Liquid ChromatographyÃƒÆ’Ã‚Â¢ÃƒÂ¢Ã¢â‚¬Å¡Ã‚Â¬ÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã…â€œMass Spectrometry-based Approach for Metabolite Analysis of Staphylococcus aureus

Här beskriver vi ett protokoll för extraktion av metaboliter från Staphylococcus aureus och deras efterföljande analys via vätskekromatografi och masspektrometri.

En Tandem vätskekromatografi-masspektrometri baserad strategi för metabolit analys av<em&gt; Staphylococcus aureus</em

In an effort to thwart bacterial pathogens, hosts often limit the availability of nutrients at the site of infection. This limitation can alter the ...

Research

JoVE Journal

Biochemistry

A Tandem Liquid Chromatography&#8211;Mass Spectrometry-based Approach for Metabolite Analysis of Staphylococcus aureus

A Facile and Efficient Approach for the Production of Reversible Disulfide Cross-linked Micelles

En Facile och effektiv strategi för produktion av Vändbar disulfid Tvärbundna Miceller

Nanomedicine is an emerging form of therapy that harnesses the unique properties of particles that are nanometers in scale for biomedical application. ...

A G-quadruplex DNA-affinity Approach for Purification of Enzymatically Active G4 Resolvase1

En G-quadruplex DNA-affinitet metoden för rening av enzymatiskt aktiva G4 Resolvase1

Higher-order nucleic acid structures called G-quadruplexes (G4s, G4 structures) can form in guanine-rich regions of both DNA and RNA and are highly ...

Sample Preparation for Mass Spectrometry-based Identification of RNA-binding Regions

Provberedning för Mass Spectrometry-baserade identifiering av RNA-bindande regioner

Noncoding RNAs play important roles in several nuclear processes, including regulating gene expression, chromatin structure, and DNA repair. In most ...

2 in 1: One-step Affinity Purification for the Parallel Analysis of Protein-Protein and Protein-Metabolite Complexes

2 i 1: enstegs affinitet rening för parallell analys av Protein-Protein och Protein-metaboliten komplex

Cellular processes are regulated by interactions between biological molecules such as proteins, metabolites, and nucleic acids. While the investigation of ...

Identification of Novel CK2 Kinase Substrates Using a Versatile Biochemical Approach

Identifiering av romanen CK2 Kinase substrat med en mångsidig biokemisk metod

The study of kinase-substrate relationships is essential to gain a complete understanding of the functions of these enzymes and their downstream targets ...

Using the Open-Source MALDI TOF-MS IDBac Pipeline for Analysis of Microbial Protein and Specialized Metabolite Data

Med öppen källkod MALDI TOF-MS IDBac pipeline för analys av mikrobiellt protein och specialiserade Metabolitdata

In order to visualize the relationship between bacterial phylogeny and specialized metabolite production of bacterial colonies growing on nutrient agar, ...

A Customizable Approach for the Enzymatic Production and Purification of Diterpenoid Natural Products

En anpassningsbar metod för enzymatisk produktion och rening av Diterpenoid naturliga produkter

Diterpenoids form a diverse class of small molecule natural products that are widely distributed across the kingdoms of life and have critical biological ...

Quantitative Analysis of the Cellular Lipidome of Saccharomyces Cerevisiae Using Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry

Quantitative Analysis of the Cellular Lipidome of Saccharomyces Cerevisiae Using Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry

Kvantitativ analys av cellulär lipidom e av Saccharomyces Cerevisiae med hjälp av flytande kromatografi tillsammans med Tandem Mass Spectrometri

Lipids are structurally diverse amphipathic molecules that are insoluble in water. Lipids are essential contributors to the organization and function of ...

Untargeted Liquid Chromatography-Mass Spectrometry-Based Metabolomics Analysis of Wheat Grain

Oriktad flytande kromatografi-Mass Pektrometri-Baserade metabolomika analys av vetekorn

Understanding the interactions between genes, the environment and management in agricultural practice could allow more accurate prediction and management ...

Single Cell Analysis Of Transcriptionally Active Alleles By Single Molecule FISH

Encellsanalys av transkriptionellt aktiva alleler med enmolekylig FISK

Gene transcription is an essential process in cell biology, and allows cells to interpret and respond to internal and external cues. Traditional bulk ...