Name: an in vitro caseum binding assay that predicts drug penetration in tuberculosis lesions
Uploaded: 2017-05-08T15:00:00
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Deseamos agradecer a Johnson &amp; Johnson, TB Alliance, Astra Zeneca, Rib-X y Trius Therapeutics por proporcionar bedaquiline, PA-824 (pretomanida), AZD5847, radezolid y tedizolid, respectivamente. Brendan Prideaux, Matthew Zimmerman, Stephen Juzwin, Emma Rey-Jurado, Nancy Ruel, Leyan Li y Danielle Weiner apoyaron el análisis MALDI, los métodos bioanalíticos, la preparación del sustituto del caseo, la síntesis química y el aislamiento del caseo de conejo. Este trabajo se llevó a cabo con fondos de la Fundación Bill y Melinda Gates, el premio # OPP1044966 y OPP1024050 a V. Dartois, la Subvención de Instrumentación Compartida NIH S10OD018072, así como el financiamiento conjunto de la Fundación Bill y Melinda Gates y Wellcome Trust for A Centre of Excellence Para la optimización del plomo para las enfermedades del mundo en vías de desarrollo a P. Wyatt.

Todos los estudios con animales se llevaron a cabo de acuerdo con la Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio de los Institutos Nacionales de Salud, con la aprobación del Comité Institucional Animal Cuidado y Uso del NIAID (NIH), Bethesda, MD. Se realizaron todos los estudios con M. tuberculosis en un laboratorio con nivel de bioseguridad de contención 3 (BSL-3). 1. Conejo Modelo de infección y caseosa Colección <ol><li> Infect Nueva Zelanda conejos blancos con ...

<ol>
	<li>Sacchettini, J. C., Rubin, E. J., Freundlich, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drugs+versus+bugs:+in+pursuit+of+the+persistent+predator+Mycobacterium+tuberculosis.">Drugs versus bugs: in pursuit of the persistent predator Mycobacterium tuberculosis.</a> Nat Rev Microbiol. 6 (1), 41-52 (2008).</li><li>Zhang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Persistent+and+dormant+tubercle+bacilli+and+latent+tuberculosis.">Persistent and dormant tubercle bacilli and latent tuberculosis.</a> Front Biosci. 1 (9), 1136-1156 (2004).</li><li>Aber, V. R., Nunn, A. 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S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+recovery+on+fraction+unbound+using+equilibrium+dialysis.">Impact of recovery on fraction unbound using equilibrium dialysis.</a> J Pharm Sci. 101 (3), 1327-1335 (2012).</li><li>Lenaerts, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Location+of+persisting+mycobacteria+in+a+Guinea+pig+model+of+tuberculosis+revealed+by+r207910.">Location of persisting mycobacteria in a Guinea pig model of tuberculosis revealed by r207910.</a> Antimicrob Agents Chemother. 51 (9), 3338-3345 (2007).</li><li>Prideaux, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-sensitivity+MALDI-MRM-MS+imaging+of+moxifloxacin+distribution+in+tuberculosis-infected+rabbit+lungs+and+granulomatous+lesions.">High-sensitivity MALDI-MRM-MS imaging of moxifloxacin distribution in tuberculosis-infected rabbit lungs and granulomatous lesions.</a> Anal Chem. 83 (6), 2112-2118 (2011).</li></ol>

lesiones necróticas pulmonares y cavidades en los pacientes de tuberculosis infectados contienen subpoblaciones de bacterias que son recalcitrantes al tratamiento farmacológico. Los núcleos caseosos de estas estructuras son particularmente responsable de albergar estos persisters en un entorno extracelular. 16 distribución favorable de agentes antibacterianos en estos lugares remotos se cree que es un determinante importante de la eficacia del fármaco tuberculosis. Antes de la validación de...

El tratamiento de la tuberculosis pulmonar requiere una distribución eficaz de fármacos en diferentes tipos de lesiones. Las lesiones necróticas y las cavidades contienen centros caseosos que albergan subpoblaciones de bacterias tolerantes a los fármacos o &quot;persistentes&quot;. 1 , 2 La enfermedad cavitaria se asocia con tasas de curación inferiores y mal pronóstico. 3 , 4 Estudios previos han demostrado, usando técnicas cuantitativas y de imágenes, que la capacidad de penetrar el caseo varía significativamente de una clase de fármaco a otra. 5 , 6 Estos métodos, sin embargo, requieren el uso de modelos de infección animal que son lentos y tediosos. Se diseñó un ensayo in vitro que mide la unión del fármaco al caseo ex vivo . Se encontró que esta unión se correlacionaba inversamente con la penetración del fármaco en granulomas caseosos y, por lo tanto, esUtilizado como herramienta predictiva. 7 La diálisis de equilibrio se considera como el método estándar de oro para los estudios de unión a proteínas plasmáticas. El dispositivo de diálisis de equilibrio rápido (RED) proporciona un sistema rápido, fácil de usar y fiable para realizar tales ensayos. 8 El dispositivo se compone de dos componentes: insertos de un solo uso y desechables compuestos de 2 cámaras separadas por un cilindro vertical de membrana semipermeable; Y placas de base reutilizables que pueden contener hasta 48 insertos a la vez. La membrana de diálisis tiene un corte de peso molecular de 8 kDa (MWCO) que es ideal para estudios de unión de fármacos-macromoléculas. La alta relación superficie / volumen del compartimento de membrana permite una diálisis rápida y equilibrio. Tanto los insertos como la placa de base han sido validados para una unión no específica específica. La combinación del dispositivo RED con técnicas bioanalíticas proporciona estimaciones precisas de las fracciones no unidas de fármacos en pLasma 8 , 9 Aunque originalmente se diseñó para medir la unión a proteínas plasmáticas, el dispositivo RED se ha utilizado en varios estudios de unión de tejidos utilizando homogenados. 10 , 11 En este protocolo, medimos la unión del fármaco al caseo, los residuos necróticos escindidos de las lesiones necróticas y cavidades de los conejos infectados con tuberculosis. La naturaleza acelular y no vascular del material caseoso hace que sea fácil de homogeneizar en una suspensión homogénea que sea compatible con el ensayo. Dado que el caseum es tedioso para producir y difícil de conseguir, el protocolo también ha sido validado para su uso con una matriz sustituta que se prepara a partir de macrófagos espumosos. Los macrófagos derivados de monocitos THP-1 son inducidos con ácido oleico para acumular múltiples cuerpos lipídicos que les dan su aspecto &quot;espumoso&quot;. Estas células cargadas de lípidos se cosechan yprocesada para producir una matriz que usamos como un sustituto para caseosa. Este estudio ha demostrado la unión a esta matriz sustituta se correlaciona bien con la unión a caseosa, imitando eficazmente el proceso in vivo que impide la penetración del fármaco en el núcleo caseosa de granulomas y cavidades que de drogas.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="960">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:443px;">New Zealand White Rabbits</td>
			<td style="width:203px;">Covance</td>
			<td style="width:147px;">-</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:443px;">HN878 Mycobacterium tuberculosis</td>
			<td style="width:203px;">BEI Resources</td>
			<td style="width:147px;">NR-13647&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:443px;">Ketathesia (Ketamine) 100mg/mL C3N</td>
			<td style="width:203px;">Henry Schein Animal Health</td>
			<td style="width:147px;">56344</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:443px;">Anased (Xylazine) 100mg/mL</td>
			<td style="width:203px;">Henry Schein Animal Health</td>
			<td style="width:147px;">33198</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:443px;">Euthasol (pentobarbital sodium and phenytoin sodium) Solution&#160;</td>
			<td style="width:203px;">Virbac</td>
			<td style="width:147px;">710101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:443px;">THP-1 monocytic cell line</td>
			<td style="width:203px;">ATCC</td>
			<td style="width:147px;">ATCC TIB-202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">175cm&#178; TC-Treated Flask (T175)</td>
			<td style="width:203px;">Fisher Scientific</td>
			<td>T-3400-175</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">RPMI 1640 media w/o glutamine</td>
			<td style="width:203px;">Fisher Scientific</td>
			<td>MT-15-040-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Hyclone Fetal Bovine Serum, Gamma irradiated&#160;</td>
			<td style="width:203px;">Fisher Scientific</td>
			<td>SH3091003IR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Hyclone L-glutamine, 200mM</td>
			<td style="width:203px;">Fisher Scientific</td>
			<td>SH3003401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Cellstar TC dish, 145x20mm, vented</td>
			<td style="width:203px;">Fisher Scientific</td>
			<td>T-2881-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Phorbol 12-myristate13-acetate (PMA)&#160;</td>
			<td style="width:203px;">Fisher Scientific</td>
			<td>BP685-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Ethylenediaminetetraacetic acid</td>
			<td style="width:203px;">Sigma</td>
			<td>E6758</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Oleic acid&#160;</td>
			<td style="width:203px;">Fisher Scientific</td>
			<td>ICN15178101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Pierce RED Device Reusable Base Plate</td>
			<td style="width:203px;">Fisher Scientific</td>
			<td>PI-89811</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Pierce RED Device Inserts, 50/box&#160;</td>
			<td style="width:203px;">Fisher Scientific</td>
			<td>PI-89809</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Pierce RED insert removal tool&#160;</td>
			<td style="width:203px;">Fisher Scientific</td>
			<td>89812</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Adhesive plate seal</td>
			<td style="width:203px;">Fisher Scientific</td>
			<td>08-408-240</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">PBS, pH7.4, 10 X 500 mL (Gibco)&#160;</td>
			<td style="width:203px;">Life Technologies&#160;</td>
			<td>10010-049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:443px;">DMSO</td>
			<td style="width:203px;">Sigma</td>
			<td>472301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:443px;">Acetonitrile</td>
			<td style="width:203px;">Sigma</td>
			<td>34998</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:443px;">Methanol</td>
			<td style="width:203px;">Sigma</td>
			<td>34860</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:443px;">Verapamil hydrochloride</td>
			<td style="width:203px;">Sigma</td>
			<td>V4629</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:443px;">Diclofenac sodium salt</td>
			<td style="width:203px;">Sigma</td>
			<td>93484</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:443px;">Trypan Blue Solution, 0.4%</td>
			<td style="width:203px;">Fisher Scientific</td>
			<td>15-250-061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:443px;">Ethanol, 200 proof</td>
			<td style="width:203px;">Fisher Scientific</td>
			<td>04-355-451</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:443px;">2010 Geno/Grinder</td>
			<td style="width:203px;">SPEX SamplePrep</td>
			<td style="width:147px;">2010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:443px;">Bead Mill Homogenizer Accessory, Metal Bulk Beads</td>
			<td style="width:203px;">Fisher Scientific</td>
			<td>15-340-158</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:443px;">484R Cobalt 60 Irradiator</td>
			<td style="width:203px;">JL Shepard</td>
			<td style="width:147px;">7810-484-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:443px;">INCYTO&#160;C-Chip Disposable Hemacytometers</td>
			<td style="width:203px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:147px;">22-600-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:443px;">Upright Light Microscope</td>
			<td style="width:203px;">Leica</td>
			<td style="width:147px;">DM1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:443px;">Binary Liquid Chromatography system</td>
			<td style="width:203px;">Agilent</td>
			<td style="width:147px;">1260</td>
			<td>Multi-compenent</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:443px;">Mass spectrometer</td>
			<td style="width:203px;">AB Sciex</td>
			<td>4000</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an in vitro caseum binding assay that predicts drug penetration in tuberculosis lesions

La erradicación de la enfermedad de la tuberculosis requiere regímenes farmacológicos que pueden penetrar las múltiples capas de lesiones pulmonares complejas. La distribución de fármacos en los núcleos caseosos de cavidades y lesiones es especialmente crucial porque albergan subpoblaciones de bacterias tolerantes a fármacos también comúnmente denominadas persisters. Los métodos existentes para la medición de la penetración del fármaco en lesiones de tuberculosis implican costosos y largos estudios farmacocinéticos in vivo acoplados a técnicas bioanalíticas o de formación de imágenes. La medida in vitro de la unión de fármacos a macromoléculas de caseo se propuso como una alternativa a tales técnicas ya que esta unión dificulta la difusión pasiva de moléculas de fármaco a través de caseo. La diálisis de equilibrio rápido es un sistema rápido y fiable para realizar estudios de unión a proteínas plasmáticas y tejidos. En este protocolo, se utilizó un dispositivo de diálisis de equilibrio rápido (RED) para medir la unión de fármacos a homogenados de caseo que es excised de las lesiones y de las cavidades de los conejos de tuberculosis infectados. El protocolo también se describe cómo generar una matriz sustituta de lípido cargado macrófagos THP-1 para utilizar en lugar de caseosa. Este / ensayo de unión sustituto caseosa es una herramienta importante en el descubrimiento de fármacos tuberculosis y se puede adaptar para ayudar a estudiar la distribución del fármaco en las lesiones o abscesos causados ​​por otras enfermedades.

Usando este protocolo, hemos probado cientos de compuestos de desarrollo de fármacos para la tuberculosis para su eficacia pronosticada en el caso de penetración. La figura 1 visualiza los conceptos básicos del ensayo RED. La membrana de diálisis de los insertos ROJO permite que pequeñas moléculas no unidas se difundan desde el pozo del donante hasta el pozo receptor, logrando finalmente un equilibrio entre ambos compartimentos. Las moléculas pequeñas que están ...

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An In Vitro Caseum Binding Assay that Predicts Drug Penetration in Tuberculosis Lesions

En este artículo se describe un método de diálisis de equilibrio rápido (RED) para medir la unión de fármacos a caseum de lesiones y cavidades de tuberculosis pulmonar. El protocolo también se utiliza con una matriz espumosa derivada de macrófagos que es un sustituto efectivo del caseo.

Un<em&gt; In Vitro</em&gt; Caseosa Ensayo de unión que permite predecir la penetración de fármacos en la tuberculosis lesiones

The eradication of tuberculosis disease requires drug regimens that can penetrate the multiple layers of complex pulmonary lesions. Drug distribution in ...

Research

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Un ensayo compatible de alto rendimiento para evaluar la eficacia del fármaco contra los macrófagos a pases<em&gt; Mycobacterium tuberculosis</em

The early drug development process for anti-tuberculosis drugs is hindered by the inefficient translation of compounds with in vitro activity to ...