Name: measuring g-protein-coupled receptor signaling via radio-labeled gtp binding
Uploaded: 2017-06-09T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Measuring G-protein-coupled Receptor Signaling via Radio-labeled GTP Binding at JoVE.com

Diese Arbeit wurde von National Institutes of Health Grant DA-000266 und der Medical Scientist Training Program T32 Grant (CV, NWZ und PCS) unterstützt. Die Autoren würden auch gerne sagen, somersault18: 24 (somersault1824.com) für die Library of Science &amp; Medical Illustrationen.

1. Expression von rekombinantem HA-MOR1 in kultivierten Zellen HINWEIS: Befolgen Sie alle Zellkulturprotokolle in einer sterilen laminaren Strömungshaube. <ol><li> Sterilisieren Sie die Zellkultur-Laminar-Flow-Kapuze mit 70% Ethanol und halten Sie sterile Technik in der gesamten Zellkultur. </li><li> Bereiten menschliche embryonale Nierenzellen vor 293 (HEK293) Zellkulturmedium, vollständiges Dulbecco&#39;s modifiziertes Eagle Medium (DMEM): DMEM, pH 7,4, ergänzt mit 2 mM L-Glutamin, 1%...

<ol>
	<li>Kobilka, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=G+protein+coupled+receptor+structure+and+activation.">G protein coupled receptor structure and activation.</a> Biochim. Biophys. Acta. 1768 (4), 794-807 (2007).</li><li>Neubig, R. R., Siderovski, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulators+of+G-protein+signalling+as+new+central+nervous+system+drug+targets.">Regulators of G-protein signalling as new central nervous system drug targets.</a> Nat. Rev. Drug Discov 1. (3), 187-197 (2002).</li><li>Overington, J. P., Al-Lazikani, B., Hopkins, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+many+drug+targets+are+there?.">How many drug targets are there?.</a> Nat. Rev. Drug Discov. 5 (12), 993-996 (2006).</li><li>Buck, L., Axel, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+multigene+family+may+encode+odorant+receptors:+a+molecular+basis+for+odor+recognition.">A novel multigene family may encode odorant receptors: a molecular basis for odor recognition.</a> Cell. 65 (1), 175-187 (1991).</li><li>Kobilka, B. 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R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pharmacological+Assessment+of+M1+Muscarinic+Acetylcholine+Receptor-Gq/11+Protein+Coupling+in+Membranes+Prepared+from+Postmortem+Human+Brain+Tissue.">Pharmacological Assessment of M1 Muscarinic Acetylcholine Receptor-Gq/11 Protein Coupling in Membranes Prepared from Postmortem Human Brain Tissue.</a> J. Pharm. Exp. Ther. 325 (3), 869-874 (2008).</li><li>Milligan, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Principles:+extending+the+utility+of+[35S]GTP+gamma+S+binding+assays.">Principles: extending the utility of [35S]GTP gamma S binding assays.</a> Trends. Pharmacol. Sci. 24 (2), 87-90 (2003).</li><li>Harrison, C., Traynor, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+[35S]GTPgammaS+binding+assay:+approaches+and+applications+in+pharmacology.">The [35S]GTPgammaS binding assay: approaches and applications in pharmacology.</a> Life Sci. 74 (4), 489-508 (2003).</li><li>Traynor, J. R., Nahorski, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+by+mu-opioid+agonists+of+guanosine-5'-O-(3-[35S]thio)triphosphate+binding+to+membranes+from+human+neuroblastoma+SH-SY5Y+cells.">Modulation by mu-opioid agonists of guanosine-5'-O-(3-[35S]thio)triphosphate binding to membranes from human neuroblastoma SH-SY5Y cells.</a> Mol. Pharmacol. 47 (4), 848-854 (1995).</li><li>Sittampalam, G. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GTP&#947;S+Binding+Assays.">GTP&#947;S Binding Assays.</a> Assay Guidance Manual. , (2004).</li><li>Strange, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+the+GTP&#947;S+([35S]GTP&#947;S+and+Eu-GTP&#947;S)+binding+assay+for+analysis+of+ligand+potency+and+efficacy+at+G+protein-coupled+receptors.">Use of the GTP&#947;S ([35S]GTP&#947;S and Eu-GTP&#947;S) binding assay for analysis of ligand potency and efficacy at G protein-coupled receptors.</a> Br. J. Pharmacol. 161 (6), 1238-1249 (2010).</li></ol>

Das vorliegende Protokoll beschreibt zwei getrennte, aber komplementäre Methoden: einen einfachen Ansatz zur Fraktionierung von Zellen und Geweben in breite, aber unterschiedliche Kompartimente und ein Mittel zur Untersuchung der GPCR-Signalisierung durch Messung der [ 35 S] GTPγS-Bindung. Die effiziente zelluläre Fraktionierung hat eine breite Palette von Anwendungen, angefangen von der Extraktion und Anreicherung von Proteinen bis hin zur Bewertung der subzellulären Lokalisa...

G-Protein-gekoppelte Rezeptoren (GPCRs) sind eine große Familie von Zelloberflächenrezeptoren, die für eine bemerkenswerte Reihe von physiologischen Prozessen verantwortlich sind, einschließlich Analgesie, Olfusion und Verhalten 1 . GPCRs wirken, indem sie spezifische externe Signale erfassen und anschließend die intrazelluläre Signalisierung stimulieren. Sie markieren daher eine Schlüsselverbindung zwischen den äußeren und inneren Umgebungen einer Zelle. Aufgrund der kritischen Rolle, die GPCRs in der Biologie spielen, sind sie zu Hauptzielen für die Grundlagenforschung und die Wirkstoffforschung geworden 2 , 3 . Im Gegensatz zu anderen Rezeptorfamilien, die diskrete Liganden binden, können GPCRs sehr unterschiedliche Molekülarten binden. Während ein GPCR mit Peptiden interagieren kann, kann ein anderer Photonen, kleine Moleküle oder Ionen 1 , 4 feststellen. Während ihre Liganden vielfältig sind, sind GPCRs in ihrem Gesamtarchitekten vereintUnd Funktion. Individuelle GPCRs bestehen aus sieben α-helicalen Transmembranproteinen mit extrazellulären Aminoterminals und intrazellulären Carboxylterminals 5 , 6 . GPCRs sind an intrazelluläre G-Proteine-heterotrimere Proteinkomplexe aus α-, β- und γ-Untereinheiten gekoppelt, die verschiedene Signalwege vermitteln 7 . Die G &amp; agr ; -Untereinheit ist ein Guanin-Nukleotid-bindendes Protein, das inaktiv ist, wenn es an Guanosindiphosphat (GDP) gebunden ist und aktiv ist, wenn es an Guanosintriphosphat (GTP) 8 , 9 gebunden ist. Wenn GPCRs ihre Liganden binden, unterliegen sie einer Konformationsänderung, die es ermöglicht, dass G &amp; agr; von G &amp; bgr; &amp; ggr ; abtrennt , wodurch G &amp; agr; das GDP für GTP 7 austauschen kann. Der Rezeptor selbst wird an seinem Carboxylterminal durch verschiedene Serin / Threon phosphoryliertIne-Kinasen 10 , 11 und verinnerlicht, um die Rezeptorsignalisierung 12 , 13 , 14 zu dämpfen. Mittlerweile verlaufen das aktivierte G &amp; agr; -Monomer und das G &amp; bgr; &amp; ggr ; -Dimer , um unterschiedliche Signalwege 7 zu aktivieren. Es gibt mehrere Isoformen jeder G-Protein-Untereinheit, und jede Isoform zielt auf bestimmte nachgeschaltete Wege und sekundäre Messenger-Systeme ab. Die Haupt-G &amp; agr; -Isoformen umfassen G s , G q , G i / o und G 12-13 . Typischerweise assoziieren einzelne GPCRs mit einer bestimmten G &amp; agr; -Isoform, wodurch ein externer Stimulus mit einer spezifischen zellulären Antwort 1 verbunden wird. Die Charakterisierung einer GPCR-Ligand-Interaktion ist entscheidend für das Verständnis der Biologie des Rezeptors. Da der BIP / GTP-Austausch einer der frühesten Vorabend istNts, die der Ligandenbindung folgen, die Überwachung der GTP-Bindung kann die GPCR-Aktivierung oder Hemmung messen. Das Testen von mehr nachgeschalteten Ereignissen in der GPCR-Signalisierung ist oft nicht so quantitativ oder stöchiometrisch, kann nicht vollständige Agonisten von partiellen unterscheiden und kann teure Reagenzien erfordern. Darüber hinaus ist eine erhöhte GTP-Bindung an G &amp; agr; -Proteine ​​ein fast universelles Ereignis nach der GPCR-Aktivierung, was bedeutet, dass die Messung der GTP-Bindung ein weitgehend anwendbarer Assay zur Überwachung der Aktivität der meisten GPCRs ist. Die Messung der GTP-Bindung ist ein einfacher und schneller Ansatz zur Überwachung der GPCR-Signalisierung in Zellen, die den Rezeptor von Interesse oder in nativem Gewebe überexprimieren. Das vorliegende Protokoll beschreibt einen funktionellen GTP-Bindungsassay unter Verwendung eines archetypischen GPCR, des μ-Opioidrezeptors (MOR1), um die Aktivität eines Agonisten und Antagonisten auf GPCR-Signalisierung quantitativ zu bestimmen. Dieses Protokoll beschreibt zunächst, wie man Rohmembranen aus Zellen, die MOR1 überexprimieren, isoliert. Anmerkung thaDieses Protokoll ist nicht auf Überexpressionssysteme beschränkt und kann auf viele Membranquellen angewendet werden, einschließlich natives Gewebe oder Präparate, die mehrere Rezeptoren und G-Proteine ​​ausdrücken. Das Protokoll beschreibt dann, wie man die Bindung eines radioaktiven GTP-Analogons an diese Membranen in Abhängigkeit von variierenden Konzentrationen von [D-Ala, N-MePhe, Gly-ol] -Enkephalin (DAMGO) oder Naloxon, einem MOR1-Agonisten und -Antagonisten, beziehungsweise. Das GTP-Analog-, [ 35 S] Guanosin-5&#39;-O- (3-thio) triphosphat ([ 35 S] GTPγS) ist nicht hydrolysierbar. Diese Eigenschaft ist kritisch, da G &amp; agr; -Untereinheiten eine intrinsische GTPase-Aktivität 7 aufweisen und das markierte Gamma-Phosphat auf einer hydrolysierbaren GTP-Radiochemie eliminieren würden. Membranen werden dann auf Glasfaserfilter gefangen und gewaschen, wonach das radioaktiv markierte GTP durch Flüssigszintillationszählung quantifiziert wird. Mehrere pharmakologische Parameter können zu charakterisiert werdenE die Rezeptor-Ligand-Wechselwirkung, einschließlich der halbmaximalen Antwort (EC 50 ) und des Hill-Koeffizienten (n H ) für Agonisten und der halbmaximalen Hemmkonzentration (IC 50 ) und der Gleichgewichtsdissoziationskonstante (K b ) für die Antagonisten 16 , 17 , 18

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1034">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:463px;">DMEM, high glucose, pyruvate, no glutamine</td>
			<td style="width:189px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td align="right" style="width:119px;">10313021</td>
			<td style="width:264px;">Warm in 37&#176;C water bath before use</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:463px;">L-glutamine</td>
			<td style="width:189px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td align="right" style="width:119px;">25030081</td>
			<td>Warm in 37&#176;C water bath before use</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:463px;">Penicillin-Streptomycin</td>
			<td style="width:189px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td align="right" style="width:119px;">15140122</td>
			<td>Warm in 37&#176;C water bath before use</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:463px;">Opti-MEM I Reduced Serum Medium</td>
			<td style="width:189px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td align="right" style="width:119px;">31985070</td>
			<td>Warm in 37&#176;C water bath before use</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:463px;">Fetal Bovine Serum</td>
			<td style="width:189px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td align="right" style="width:119px;">16000044</td>
			<td>Warm in 37&#176;C water bath before use</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:463px;">Cell culture 10-cm plate</td>
			<td style="width:189px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">CLS430167</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:463px;">Lipofectamine 3000 reagent</td>
			<td style="width:189px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">L3000-008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:463px;">1.6 mL microcentrifuge tubes</td>
			<td style="width:189px;">USA Scientific</td>
			<td style="width:119px;">1615-5500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:463px;">4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES)</td>
			<td style="width:189px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">H3375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:463px;">Tris(hydroxymethyl)aminomethane (Trizma base)</td>
			<td style="width:189px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">BP152-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:463px;">ethylene glycol-bis(&#946;-aminoethyl ether)-N,N,N&#39;,N&#39;-tetraacetic acid (EGTA)</td>
			<td style="width:189px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">E3889</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:463px;">Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)</td>
			<td style="width:189px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">E9884</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:463px;">Sucrose</td>
			<td style="width:189px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">S5016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:463px;">cOmplete ULTRA Tablets, Mini, EASYpack Protease Inhibitor Cocktail</td>
			<td style="width:189px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td align="right" style="width:119px;">2900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:463px;">DL-Dithiothreitol (DTT)</td>
			<td style="width:189px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">DO632</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:463px;">Sodium chloride (NaCl)</td>
			<td style="width:189px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">BP358-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:463px;">Magnesium chloride (MgCl2)</td>
			<td style="width:189px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">M1028-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:463px;">Pellet pestles motor</td>
			<td style="width:189px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">Z359971</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:463px;">Pestles</td>
			<td style="width:189px;">Bel Art</td>
			<td style="width:119px;">F19923-0001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:463px;">Bovine serum albumin (BSA)</td>
			<td style="width:189px;">Affymetrix</td>
			<td align="right" style="width:119px;">10857</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">[35S]guanosine-5&#8217;-O-(3-thio)triphosphate ([35S]GTP&#947;S)&#160;</td>
			<td style="width:189px;">Perkin Elmer</td>
			<td style="width:119px;">NEG030H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">non-radiolabeled guanosine-5&#8217;-O-(3-thio)triphosphate (GTP&#947;S)&#160;</td>
			<td style="width:189px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td align="right" style="width:119px;">89378</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">guanosine diphosphate (GDP)</td>
			<td style="width:189px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td align="right" style="width:119px;">51060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:463px;">Bradford reagent</td>
			<td style="width:189px;">Bio-Rad</td>
			<td align="right" style="width:119px;">5000006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:463px;">UV/VIS spectrophotometer</td>
			<td style="width:189px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:119px;">DU640</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:463px;">spectrophotometer cuvettes</td>
			<td style="width:189px;">USA Scientific</td>
			<td style="width:119px;">9090-0460</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:463px;">orbital shaker</td>
			<td style="width:189px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td align="right" style="width:119px;">2314</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:463px;">thermomixer</td>
			<td style="width:189px;">Eppendorf</td>
			<td align="right" style="width:119px;">535027903</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">glass fiber filters&#160;</td>
			<td style="width:189px;">GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td style="width:119px;">1821-021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">vacuum filtration apparatus</td>
			<td style="width:189px;">Millipore Corporation</td>
			<td style="width:119px;">XX2702550</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:463px;">desktop microcentrifuge</td>
			<td style="width:189px;">Eppendorf</td>
			<td align="right" style="width:119px;">65717</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:463px;">Scintillation counter</td>
			<td style="width:189px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:119px;">LS6500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">scintillation fluid&#160;</td>
			<td style="width:189px;">Ecoscint A</td>
			<td style="width:119px;">LS-273</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">scintillation counter vials</td>
			<td style="width:189px;">Beckman Coulter</td>
			<td align="right" style="width:119px;">592690</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">scintillation vial lids</td>
			<td style="width:189px;">Beckman Coulter</td>
			<td align="right" style="width:119px;">592928</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:463px;">Prism 6</td>
			<td style="width:189px;">GraphPad Software</td>
			<td style="width:119px;">PRISM 6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:463px;">ATP1A1 antibody</td>
			<td style="width:189px;">Developmental Studies Hybridoma</td>
			<td style="width:119px;">a6F</td>
			<td>1:1000 in 3% BSA</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:463px;">GAPDH antibody</td>
			<td style="width:189px;">EMD Millipore</td>
			<td style="width:119px;">CB1001</td>
			<td>1:5000 in 3% BSA</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:463px;">H2B antibody</td>
			<td style="width:189px;">Cell Signaling</td>
			<td style="width:119px;">2934S</td>
			<td>1:2500 in 3% BSA</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:463px;">PDI antibody</td>
			<td style="width:189px;">Cell Signaling</td>
			<td style="width:119px;">3501S</td>
			<td>1:1000 in 3% BSA</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:463px;">HA antibody</td>
			<td style="width:189px;">Roche</td>
			<td align="right" style="width:119px;">11867423001</td>
			<td>1:2000 in 3% BSA</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measuring g-protein-coupled receptor signaling via radio-labeled gtp binding

G-Protein-gekoppelte Rezeptoren (GPCRs) sind eine große Familie von Transmembran-Rezeptoren, die in der normalen zellulären Physiologie kritische Rollen spielen und ein großes pharmakologisches Ziel für multiple Indikationen darstellen, einschließlich Analgesie, Blutdruckregulation und Behandlung psychiatrischer Erkrankungen. Nach der Ligandenbindung katalysieren GPCRs die Aktivierung von intrazellulären G-Proteinen durch Stimulierung des Einbaues von Guanosintriphosphat (GTP). Aktivierte G-Proteine ​​stimulieren dann Signalwege, die zelluläre Reaktionen hervorrufen. Die GPCR-Signalisierung kann durch Messung des Einbringens einer radioaktiv markierten und nicht hydrolysierbaren Form von GTP, [ 35 S] Guanosin-5&#39;-O- (3-thio) triphosphat ([ 35 S] GTPγS) in G-Proteine ​​überwacht werden. Im Gegensatz zu anderen Methoden, die mehr nachgeschaltete Signalisierungsprozesse beurteilen, misst [ 35 S] GTPγS-Bindung ein proximales Ereignis in der GPCR-Signalisierung und kann vor allem Agonis unterscheidenTs, antagonisten und inverse agonisten. Das vorliegende Protokoll beschreibt eine empfindliche und spezifische Methode zum Studieren der GPCR-Signalisierung unter Verwendung von Rohmembranpräparationen eines archetypischen GPCR, des μ-Opioidrezeptors (MOR1). Obwohl alternative Ansätze zur Fraktionierung von Zellen und Geweben existieren, sind viele kostenaufwendig, langwierig und / oder erfordern nicht standardisierte Laborgeräte. Die vorliegende Methode liefert ein einfaches Verfahren, das funktionelle Rohmembranen angereichert. Nach der Isolierung von MOR1 wurden verschiedene pharmakologische Eigenschaften seines Agonisten, [D-Ala, N-MePhe, Gly-ol] -enkephalin (DAMGO) und Antagonist, Naloxon, bestimmt.

Zellfraktionierung kann verwendet werden, um Membran-assoziierte Proteine ​​aus zytosolischen und nuklearen Proteinen zu isolieren und zu bereichern. Abbildung 1 ist ein Western-Blot, der den Inhalt der drei primären Fraktionen demonstriert, die während des subzellulären Fraktionierungsprozesses gesammelt werden können. Speziell zeigt Fig. 1 , daß die Fraktionierung Membranproteine ​​( dh Na + / K + ATPase,...

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Measuring G-protein-coupled Receptor Signaling via Radio-labeled GTP Binding

Guanosintriphosphat (GTP) -Bindung ist eine der frühesten Ereignisse in der G-Protein-Coupled Receptor (GPCR) -Aktivierung. Dieses Protokoll beschreibt die pharmakologisch charakterisierende spezifische GPCR-Ligand-Wechselwirkungen durch die Überwachung der Bindung des radioaktiv markierten GTP-Analogs [ 35 S] Guanosin-5&#39;-O- (3-thio) triphosphats ([ 35 S] GTPγS) in Antwort auf einen Liganden von Interesse.

Messung der G-Protein-gekoppelten Rezeptorsignalisierung über radioaktiv markierte GTP-Bindung

G-Protein-Coupled Receptors (GPCRs) are a large family of transmembrane receptors that play critical roles in normal cellular physiology and constitute a ...

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SCIENTISTS IN ACTION

Quantification of Bacterial Histidine Kinase Autophosphorylation Using a Nitrocellulose Binding Assay

Quantifizierung der Bakterien Histidinkinase Autophosphorylierung eine Nitrocellulose-Bindungsassay unter Verwendung

We demonstrate a useful method for quantifying autophosphorylation of purified bacterial histidine kinases. Histidine kinases are known for their ...

Forschung

Biochemie

Measuring Protein Binding to F-actin by Co-sedimentation

Messung der Proteinbindung an F-Aktin durch Co-Sedimentation

Filamentous actin (F-actin) organization within cells is regulated by a large number of actin-binding proteins that control actin nucleation, growth, ...

Measuring Biomolecular DSC Profiles with Thermolabile Ligands to Rapidly Characterize Folding and Binding Interactions

Messprofile biomolekularen DSC mit thermolabilen Liganden schnell zu charakterisieren, Falt- und bindende Wechselwirkungen

Differential scanning calorimetry (DSC) is a powerful technique for quantifying thermodynamic parameters governing biomolecular folding and binding ...

Sample Preparation for Mass Spectrometry-based Identification of RNA-binding Regions

Probenvorbereitung für Masse Spektrometrie-basierte Identifikation der RNA-bindende Regionen

Noncoding RNAs play important roles in several nuclear processes, including regulating gene expression, chromatin structure, and DNA repair. In most ...

Method for Efficient Refolding and Purification of Chemoreceptor Ligand Binding Domain

Methode für effiziente Umfaltung und Reinigung des Chemorezeptor-Liganden-bindende Domäne

Identification of natural ligands of chemoreceptors and structural studies aimed at elucidation of the molecular basis of the ligand specificity can be ...

Detection of Small GTPase Prenylation and GTP Binding Using Membrane Fractionation and  GTPase-linked Immunosorbent Assay

Erkennung von kleine GTPase Prenylation und GTP binden mit Membran Fraktionierung und GTPase verbundene Immunosorbentprobe Assay

The Rho GTPase family belongs to the Ras superfamily and includes approximately 20 members in humans. Rho GTPases are important in the regulation of ...

Dissipative Microgravimetry to Study the Binding Dynamics of the Phospholipid Binding Protein Annexin A2 to Solid-supported Lipid Bilayers Using a Quartz Resonator

Dissipative Microgravimetry die Bindung Dynamik der Phospholipid-bindende Protein Annexin A2, solide unterstützt Lipid Bilayer mit einem Quarz-Resonator zu studieren

The dissipative quartz crystal microbalance technique is a simple and label-free approach to measure simultaneously the mass uptake and viscoelastic ...

Extracellular Protein Microarray Technology for High Throughput Detection of Low Affinity Receptor-Ligand Interactions

Extrazelluläre Protein-Microarray-Technologie für hohen Durchsatz-Erkennung von geringe Affinität-Rezeptor-Ligand-Wechselwirkungen

Secreted factors, membrane-tethered receptors, and their interacting partners are main regulators of cellular communication and initiation of signaling ...

Production, Crystallization, and Structure Determination of the IKK-binding Domain of NEMO

Produktion, Kristallisation und Strukturbestimmung der IKK-bindungsdomäne von NEMO

NEMO is a scaffolding protein which plays an essential role in the NF-&#954;B pathway by assembling the IKK-complex with the kinases IKK&#945; and ...

Measuring Nucleotide Binding to Intact, Functional Membrane Proteins in Real Time

Messung der Nukleotidbindung an intakte, funktionelle Membranproteine in Echtzeit

We have developed a method to measure binding of adenine nucleotides to intact, functional transmembrane receptors in a cellular or membrane environment. ...