Name: measuring g-protein-coupled receptor signaling via radio-labeled gtp binding
Uploaded: 2017-06-09T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Measuring G-protein-coupled Receptor Signaling via Radio-labeled GTP Binding at JoVE.com

עבודה זו נתמכה על ידי המכונים הלאומיים לבריאות מענק DA-000266 ואת תוכנית מדען רפואי T32 מענק (קורות חיים, NWZ, ו- PCS). המחברים היו רוצים גם להודות somersault18: 24 (somersault1824.com) עבור הספרייה המדעית &amp; איורים רפואיים.

1. ביטוי של רקומביננטי HA-MOR1 בתאים תרבותיים הערה: בצע את כל פרוטוקולי תרבות התא בתא המנוע סטרילי זרימה למינרית. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעקר את תא התרבות למינרית זרימה למינרית עם אתנול 70% ולשמור על טכניקה ס?...

<ol>
	<li>Kobilka, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=G+protein+coupled+receptor+structure+and+activation.">G protein coupled receptor structure and activation.</a> Biochim. Biophys. Acta. 1768 (4), 794-807 (2007).</li><li>Neubig, R. R., Siderovski, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulators+of+G-protein+signalling+as+new+central+nervous+system+drug+targets.">Regulators of G-protein signalling as new central nervous system drug targets.</a> Nat. Rev. Drug Discov 1. (3), 187-197 (2002).</li><li>Overington, J. P., Al-Lazikani, B., Hopkins, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+many+drug+targets+are+there?.">How many drug targets are there?.</a> Nat. Rev. Drug Discov. 5 (12), 993-996 (2006).</li><li>Buck, L., Axel, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+multigene+family+may+encode+odorant+receptors:+a+molecular+basis+for+odor+recognition.">A novel multigene family may encode odorant receptors: a molecular basis for odor recognition.</a> Cell. 65 (1), 175-187 (1991).</li><li>Kobilka, B. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cloning,+sequencing,+and+expression+of+the+gene+coding+for+the+human+platelet+alpha+2-adrenergic+receptor.">Cloning, sequencing, and expression of the gene coding for the human platelet alpha 2-adrenergic receptor.</a> Science. 238 (4827), 650-656 (1987).</li><li>Palczewski, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystal+structure+of+rhodopsin:+A+G+protein-coupled+receptor.">Crystal structure of rhodopsin: A G protein-coupled receptor.</a> Science. 289 (5480), 739-745 (2000).</li><li>Neer, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterotrimeric+c+proteins:+organizers+of+transmembrane+signals.">Heterotrimeric c proteins: organizers of transmembrane signals.</a> Cell. 80 (2), 249-257 (1995).</li><li>Londos, C., Salomon, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=5'-Guanylylimidodiphosphate,+a+Potent+Activator+of+Adenylate+Cyclase+Systems+in+Eukaryotic+Cells.">5'-Guanylylimidodiphosphate, a Potent Activator of Adenylate Cyclase Systems in Eukaryotic Cells.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 71 (8), 3087-3090 (1974).</li><li>Ross, E. M., Gilman, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resolution+of+Some+Components+of+Adenylate-Cyclase+Necessary+for+Catalytic+Activity.">Resolution of Some Components of Adenylate-Cyclase Necessary for Catalytic Activity.</a> J. Biol. Chem. 252 (20), 6966-6969 (1977).</li><li>Stadel, J. M., Nambi, P., Shorr, R., Sawyer, D. F., Caron, M. G., Lefkowitz, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Catecholamine-Induced+Desensitization+of+Turkey+Erythrocyte+Adenylate-Cyclase+Is+Associated+with+Phosphorylation+of+the+Beta-Adrenergic-Receptor.">Catecholamine-Induced Desensitization of Turkey Erythrocyte Adenylate-Cyclase Is Associated with Phosphorylation of the Beta-Adrenergic-Receptor.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 80 (11), 3173-3177 (1983).</li><li>Wilden, U., Kuhn, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light-Dependent+Phosphorylation+of+Rhodopsin+-+Number+of+Phosphorylation+Sites.">Light-Dependent Phosphorylation of Rhodopsin - Number of Phosphorylation Sites.</a> Biochemistry. 21 (12), 3014-3022 (1982).</li><li>Lohse, M., Benovic, J., Codina, J., Caron, M., Lefkowitz, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=beta-Arrestin:+a+protein+that+regulates+beta-adrenergic+receptor+function.">beta-Arrestin: a protein that regulates beta-adrenergic receptor function.</a> Science. 248 (4962), 1547-1550 (1990).</li><li>Leftowitz, R. J., Shenoy, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transduction+of+receptor+signals+by+beta-arrestins.">Transduction of receptor signals by beta-arrestins.</a> Science. 308 (5721), 512-517 (2005).</li><li>Lefkowitz, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Historical+review:+a+brief+history+and+personal+retrospective+of+seven-transmembrane+receptors.">Historical review: a brief history and personal retrospective of seven-transmembrane receptors.</a> Trends Pharmacol. Sci. 25 (8), 413-422 (2004).</li><li>Salah-Uddin, H., Thomas, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pharmacological+assessment+of+m1+muscarinic+acetylcholine+receptor-gq/11+protein+coupling+in+membranes+prepared+from+postmortem+human+brain+tissue.">Pharmacological assessment of m1 muscarinic acetylcholine receptor-gq/11 protein coupling in membranes prepared from postmortem human brain tissue.</a> J. Pharm. Exp. Ther. 325 (3), 869-874 (2008).</li><li>Yung-Chi, C., Prusoff, W. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Relationship+between+the+inhibition+constant+(K1)+and+the+concentration+of+inhibitor+which+causes+50+per+cent+inhibition+(I50)+of+an+enzymatic+reaction.">Relationship between the inhibition constant (K1) and the concentration of inhibitor which causes 50 per cent inhibition (I50) of an enzymatic reaction.</a> Biochem. Pharmacol. 22 (23), 3099-3108 (1973).</li><li>Lazareno, S., Birdsall, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Estimation+of+competitive+antagonist+affinity+from+functional+inhibition+curves+using+the+Gaddum,+Schild+and+Cheng-Pruso&#237;f+equations.">Estimation of competitive antagonist affinity from functional inhibition curves using the Gaddum, Schild and Cheng-Pruso&#237;f equations.</a> Br. J. Pharmacol. 109 (4), 1110-1119 (1993).</li><li>Mar&#233;chal, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+5,+Measuring+Bioactivity:+KI,+IC50+and+EC50.">Chapter 5, Measuring Bioactivity: KI, IC50 and EC50.</a> Chemogenomics and Chemical Genetics. , 55-65 (2011).</li><li>Salah-Uddin, H., Thomas, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pharmacological+Assessment+of+M1+Muscarinic+Acetylcholine+Receptor-Gq/11+Protein+Coupling+in+Membranes+Prepared+from+Postmortem+Human+Brain+Tissue.">Pharmacological Assessment of M1 Muscarinic Acetylcholine Receptor-Gq/11 Protein Coupling in Membranes Prepared from Postmortem Human Brain Tissue.</a> J. Pharm. Exp. Ther. 325 (3), 869-874 (2008).</li><li>Milligan, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Principles:+extending+the+utility+of+[35S]GTP+gamma+S+binding+assays.">Principles: extending the utility of [35S]GTP gamma S binding assays.</a> Trends. Pharmacol. Sci. 24 (2), 87-90 (2003).</li><li>Harrison, C., Traynor, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+[35S]GTPgammaS+binding+assay:+approaches+and+applications+in+pharmacology.">The [35S]GTPgammaS binding assay: approaches and applications in pharmacology.</a> Life Sci. 74 (4), 489-508 (2003).</li><li>Traynor, J. R., Nahorski, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+by+mu-opioid+agonists+of+guanosine-5'-O-(3-[35S]thio)triphosphate+binding+to+membranes+from+human+neuroblastoma+SH-SY5Y+cells.">Modulation by mu-opioid agonists of guanosine-5'-O-(3-[35S]thio)triphosphate binding to membranes from human neuroblastoma SH-SY5Y cells.</a> Mol. Pharmacol. 47 (4), 848-854 (1995).</li><li>Sittampalam, G. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GTP&#947;S+Binding+Assays.">GTP&#947;S Binding Assays.</a> Assay Guidance Manual. , (2004).</li><li>Strange, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+the+GTP&#947;S+([35S]GTP&#947;S+and+Eu-GTP&#947;S)+binding+assay+for+analysis+of+ligand+potency+and+efficacy+at+G+protein-coupled+receptors.">Use of the GTP&#947;S ([35S]GTP&#947;S and Eu-GTP&#947;S) binding assay for analysis of ligand potency and efficacy at G protein-coupled receptors.</a> Br. J. Pharmacol. 161 (6), 1238-1249 (2010).</li></ol>

הפרוטוקול הנוכחי מתאר שתי שיטות נפרדות אך משלימות: גישה פשוטה לתאים ורקמות מפוצלות לתאים רחבים אך ברורים ואמצעי לחקור את אותות GPCR על ידי מדידת [ 35 S] GTPγS מחייב. חלוקה תאית יעילה יש מגוון רחב של יישומים, החל מיצוי והעשרה של חלב?...

G-RPRs (GPCRs) הם משפחה גדולה של קולטני שטח התא האחראים על מגוון מדהים של תהליכים פיזיולוגיים, כולל שיכוך כאבים, ריפוי והתנהגות 1 . GPCRs לפעול על ידי חישה אותות חיצוניים ספציפיים ולאחר מכן מגרה איתות תאיים. לכן הם מציינים צומת מפתח בין הסביבות החיצוניות והפנימיות של התא. בשל התפקיד הקריטי GPCRs לשחק בביולוגיה, הם הפכו מטרות מרכזיות הן במחקר בסיסי גילוי סמים 2 , 3 . בניגוד למשפחות קולטן אחרות המחברות ליגנים נפרדים, GPCRs יכול לקשור סוגים שונים מאוד של מולקולות. בעוד אחד GPCR עשוי אינטראקציה עם פפטידים, אחר עשוי לחוש פוטונים, מולקולות קטנות, או יונים 1 , 4 . בעוד ligands שלהם הם מגוונים, GPCRs מאוחדים האדריכל הכולל שלהםUre ו פונקציה. GPCRs בודדים מורכבים של שבעה חלבונים טרנסממברניים α-הסליל עם מסופי אמינו תאיים מסופי carboxyl תאיים 5 , 6 . GPCRs מצמידים אל חלבונים G תאיים-קומפלקסים חלבונים הטרוטרימריים המורכבים α, β, ו γ יחידות משנה, אשר מתווך מסלולים איתות שונים 7 . G α יחידת משנה הוא חלבון נוקליאוטיד גוואנין מחייב כי הוא לא פעיל כאשר קשורה diphosphate guanosine (תוצר) ופעילה כאשר קשורה כדי triphosphate guanosine (GTP) 8 , 9 . כאשר GPCRs לאגד ligands שלהם, הם עוברים שינוי קונפורמציה המאפשר G α לנתק מ G βγ , ובכך מאפשר G α להחליף התמ&quot;ג עבור GTP 7 . הקולטן עצמו הוא phosphorylated במסוף carboxyl שלה על ידי serine / threon שוניםIne קינאזות 10 , 11 ו מופנם להפחתת קולטן איתות 12 , 13 , 14 . בינתיים, מופעל מונומר G α ו G βγ dimer להמשיך להפעיל נתיבי איתות שונים 7 . ישנם מספר איזופורמים של כל יחידת משנה של חלבונים, וכל איזופורם מכוון למסלולים במורד הזרם ובמערכות שליחים משניות. האיזופורמים העיקריים של G α כוללים G, G q , G / i , ו- G 12-13 . בדרך כלל, GPCRs בודדים מקשרים עם איזופורם G α מסוים , ובכך מקשרים גירוי חיצוני לתגובה תאית ספציפית 1 . אפיון אינטראקציה GPCR-ligand הוא קריטי להבנת הביולוגיה של הקולטן. כמו התמ&quot;ג / חילופי GTP הוא אחד הראשונים ערבNts כי בעקבות ליגנד מחייב, ניטור GTP מחייב יכול למדוד הפעלה GPCR או עיכוב. Assaying יותר אירועים במורד GPCR איתות הוא לעתים קרובות לא כמותי או stoichiometric, לא יכול להבחין אגוניסטים מלאים מחלקיקים, והוא יכול לדרוש ריאגנטים יקר. יתר על כן, הגדלת GTP מחייב חלבונים G α הוא אירוע כמעט אוניברסלי לאחר ההפעלה GPCR, כלומר מדידה GTP מחייב הוא assay ישים נרחב לניטור הפעילות של GPCRs ביותר. מדידת GTP מחייב היא גישה פשוטה ומהירה לפקח איתות GPCR בתאים overexpressing קולטן של עניין או רקמות הילידים. בפרוטוקול הנוכחי פרטים assay פונקציונלי GTP מחייב באמצעות GPCR ארכיטיפי, קולטן μ אופיואידים (MOR1), כדי לקבוע כמותית את הפעילות של אגוניסט אנטגוניסט על GPCR איתות. פרוטוקול זה מתאר תחילה כיצד לבודד ממברנות גסות של תאים overexpressing MOR1. הערה thaלא פרוטוקול זה אינו מוגבל מערכות overexpression והוא יכול להיות מיושם על מקורות רבים של הממברנה, כולל רקמה מקומית או תכשירים המבטאים קולטנים מרובים חלבונים G 15 . לאחר מכן, הפרוטוקול מפרט כיצד למדוד את הכריכה של אנלוגי GTP רדיואקטיבי לממברנות אלה בתגובה לריכוזים שונים של [D-Ala, N-MePhe, Gly-ol] - אנקפאלין (DAMGO) או נלוקסון, אגוניסט ואנטגוניסט MOR1, בהתאמה. האנלוגי של ה- GTP, [ 35 S] ganosine-5&#39;-O- (3-thio) triphosphate ([ 35 S] GTPγS), הוא לא hydrolyzable. תכונה זו היא קריטית כי G α יחידות משנה התערוכה פעילות GTPase מהותי 7 יבטלו את הפוספט גמא שכותרתו על רדיואקטיבי GTP hydrolyzable. ממברנות נלכדים מכן על גבי מסנני סיבי זכוכית ושטף, לאחר מכן את gTP radiolabeled הוא לכמת על ידי ספירת הנוזל scintillation. הפרמטרים הפרמקולוגיים מרובים ניתן לגזור characterizE אינטראקציה קולטן ליגנד, כולל תגובה חצי מקסימלית (EC 50 ) ואת מקדם היל (n) עבור אגוניסטים ואת ריכוז מעכב מקסימלי חצי (IC 50 ) ו שיווי המשקל דיסוציאציה קבוע (K ב ) עבור אנטגוניסטים 16 , 17 , 18 .

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1034">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:463px;">DMEM, high glucose, pyruvate, no glutamine</td>
			<td style="width:189px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td align="right" style="width:119px;">10313021</td>
			<td style="width:264px;">Warm in 37&#176;C water bath before use</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:463px;">L-glutamine</td>
			<td style="width:189px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td align="right" style="width:119px;">25030081</td>
			<td>Warm in 37&#176;C water bath before use</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:463px;">Penicillin-Streptomycin</td>
			<td style="width:189px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td align="right" style="width:119px;">15140122</td>
			<td>Warm in 37&#176;C water bath before use</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:463px;">Opti-MEM I Reduced Serum Medium</td>
			<td style="width:189px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td align="right" style="width:119px;">31985070</td>
			<td>Warm in 37&#176;C water bath before use</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:463px;">Fetal Bovine Serum</td>
			<td style="width:189px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td align="right" style="width:119px;">16000044</td>
			<td>Warm in 37&#176;C water bath before use</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:463px;">Cell culture 10-cm plate</td>
			<td style="width:189px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">CLS430167</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:463px;">Lipofectamine 3000 reagent</td>
			<td style="width:189px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">L3000-008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:463px;">1.6 mL microcentrifuge tubes</td>
			<td style="width:189px;">USA Scientific</td>
			<td style="width:119px;">1615-5500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:463px;">4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES)</td>
			<td style="width:189px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">H3375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:463px;">Tris(hydroxymethyl)aminomethane (Trizma base)</td>
			<td style="width:189px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">BP152-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:463px;">ethylene glycol-bis(&#946;-aminoethyl ether)-N,N,N&#39;,N&#39;-tetraacetic acid (EGTA)</td>
			<td style="width:189px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">E3889</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:463px;">Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)</td>
			<td style="width:189px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">E9884</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:463px;">Sucrose</td>
			<td style="width:189px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">S5016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:463px;">cOmplete ULTRA Tablets, Mini, EASYpack Protease Inhibitor Cocktail</td>
			<td style="width:189px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td align="right" style="width:119px;">2900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:463px;">DL-Dithiothreitol (DTT)</td>
			<td style="width:189px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">DO632</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:463px;">Sodium chloride (NaCl)</td>
			<td style="width:189px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">BP358-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:463px;">Magnesium chloride (MgCl2)</td>
			<td style="width:189px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">M1028-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:463px;">Pellet pestles motor</td>
			<td style="width:189px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">Z359971</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:463px;">Pestles</td>
			<td style="width:189px;">Bel Art</td>
			<td style="width:119px;">F19923-0001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:463px;">Bovine serum albumin (BSA)</td>
			<td style="width:189px;">Affymetrix</td>
			<td align="right" style="width:119px;">10857</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">[35S]guanosine-5&#8217;-O-(3-thio)triphosphate ([35S]GTP&#947;S)&#160;</td>
			<td style="width:189px;">Perkin Elmer</td>
			<td style="width:119px;">NEG030H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">non-radiolabeled guanosine-5&#8217;-O-(3-thio)triphosphate (GTP&#947;S)&#160;</td>
			<td style="width:189px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td align="right" style="width:119px;">89378</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">guanosine diphosphate (GDP)</td>
			<td style="width:189px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td align="right" style="width:119px;">51060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:463px;">Bradford reagent</td>
			<td style="width:189px;">Bio-Rad</td>
			<td align="right" style="width:119px;">5000006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:463px;">UV/VIS spectrophotometer</td>
			<td style="width:189px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:119px;">DU640</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:463px;">spectrophotometer cuvettes</td>
			<td style="width:189px;">USA Scientific</td>
			<td style="width:119px;">9090-0460</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:463px;">orbital shaker</td>
			<td style="width:189px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td align="right" style="width:119px;">2314</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:463px;">thermomixer</td>
			<td style="width:189px;">Eppendorf</td>
			<td align="right" style="width:119px;">535027903</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">glass fiber filters&#160;</td>
			<td style="width:189px;">GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td style="width:119px;">1821-021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">vacuum filtration apparatus</td>
			<td style="width:189px;">Millipore Corporation</td>
			<td style="width:119px;">XX2702550</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:463px;">desktop microcentrifuge</td>
			<td style="width:189px;">Eppendorf</td>
			<td align="right" style="width:119px;">65717</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:463px;">Scintillation counter</td>
			<td style="width:189px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:119px;">LS6500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">scintillation fluid&#160;</td>
			<td style="width:189px;">Ecoscint A</td>
			<td style="width:119px;">LS-273</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">scintillation counter vials</td>
			<td style="width:189px;">Beckman Coulter</td>
			<td align="right" style="width:119px;">592690</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">scintillation vial lids</td>
			<td style="width:189px;">Beckman Coulter</td>
			<td align="right" style="width:119px;">592928</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:463px;">Prism 6</td>
			<td style="width:189px;">GraphPad Software</td>
			<td style="width:119px;">PRISM 6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:463px;">ATP1A1 antibody</td>
			<td style="width:189px;">Developmental Studies Hybridoma</td>
			<td style="width:119px;">a6F</td>
			<td>1:1000 in 3% BSA</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:463px;">GAPDH antibody</td>
			<td style="width:189px;">EMD Millipore</td>
			<td style="width:119px;">CB1001</td>
			<td>1:5000 in 3% BSA</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:463px;">H2B antibody</td>
			<td style="width:189px;">Cell Signaling</td>
			<td style="width:119px;">2934S</td>
			<td>1:2500 in 3% BSA</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:463px;">PDI antibody</td>
			<td style="width:189px;">Cell Signaling</td>
			<td style="width:119px;">3501S</td>
			<td>1:1000 in 3% BSA</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:463px;">HA antibody</td>
			<td style="width:189px;">Roche</td>
			<td align="right" style="width:119px;">11867423001</td>
			<td>1:2000 in 3% BSA</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measuring g-protein-coupled receptor signaling via radio-labeled gtp binding

קולטני G-Protein-Coupled (GPCRs) הם משפחה גדולה של קולטני טרנסממברנים, הממלאים תפקידים קריטיים בפיזיולוגיה הסלולרית הרגילה ומהווים יעד פרמקולוגי חשוב לאינדיקציות מרובות, כולל כאבים, ויסות לחץ דם והטיפול במחלות פסיכיאטריות. עם ליגנד מחייב, GPCRs מזרז את ההפעלה של חלבונים G תאיים על ידי גירוי שילוב של trianosphate guanosine (GTP). G- חלבונים מופעלים מכן לעורר נתיבי איתות המעורר תגובות הסלולר. ניתן לפקח על איתות GPCR על-ידי מדידת שילוב של רדיופלאד ולא-הידרוליזה של GTP, [ 35 S] ganosine-5&#39;-O- (3-thio) triphosphate ([ 35 S] GTPγS), לתוך חלבונים G. שלא כמו שיטות אחרות המעריכות תהליכי איתות נוספים במורד הזרם, [ 35 S] מחייב GTPγS מודד אירוע פרוקסימלי בסימון GPCR, וחשוב מכך, ניתן להבחין בין agonisטס, אנטגוניסטים, אגוניסטים הפוכה. הפרוטוקול הנוכחי מתאר שיטה רגישה וספציפית לחקר איתות GPCR תוך שימוש בהכנות ממברנות גולמיות של GPCR ארכיטיפי, הקולטן מסוג אופיואיד (MOR1). למרות גישות חלופיות לתאים ורקמות מופרדים קיימים, רבים הם עלות אוסרני, מייגע, ו / או דורשים ציוד מעבדה לא סטנדרטית. השיטה הנוכחית מספקת הליך פשוט המעשיר קרום גולמי תפקודי. לאחר בידוד MOR1, תכונות פרמקולוגיות שונות של אגוניסט, [D-Ala, N-MePhe, Gly-ol] -נקפאלין (DAMGO), ואנטגוניסט, naloxone, נקבעו.

פיצול תאים ניתן להשתמש כדי לבודד ולהעשיר הקשורים חלבונים הקשורים חלבונים cytosolic ו גרעיני. איור 1 הוא כתם המערבי המדגים את התוכן של שלושת השברים העיקריים שניתן לאסוף במהלך תהליך החלוקה התת-תאית. באופן ספציפי, איור 1 מרא?...

Watch this Scientific Journal Video about Measuring G-protein-coupled Receptor Signaling via Radio-labeled GTP Binding at JoVE.com

Measuring G-protein-coupled Receptor Signaling via Radio-labeled GTP Binding

Guanosine triphosphate (GTP) מחייב הוא אחד האירועים המוקדמים G-Protein-Coupled קולטן (GPCR) ההפעלה. פרוטוקול זה מתאר כיצד לאפיין באופן פרמקולוגי אינטראקציות ספציפיות GPCR-ligand על ידי ניטור מחייב של אנלוגי GTP, שכותרתו רדיו, [ 35 S] guanosine-5&#39;-O- (3-thio) triphosphate ([ 35 S] GTPγS), in תגובה ליגנד של עניין.

מדידת G- חלבון מצמידים איתות באמצעות רדיו שכותרתו GTP מחייב

G-Protein-Coupled Receptors (GPCRs) are a large family of transmembrane receptors that play critical roles in normal cellular physiology and constitute a ...

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Biochemistry

Cell Biology

Pharmacology

Unit 1

Pharmacodynamics

Signaling Networks of G Protein-coupled Receptors

SCIENTISTS IN ACTION

Quantification of Bacterial Histidine Kinase Autophosphorylation Using a Nitrocellulose Binding Assay

כימות של חיידקי היסטידין קינאז autophosphorylation באמצעות Assay כריכה Nitrocellulose

We demonstrate a useful method for quantifying autophosphorylation of purified bacterial histidine kinases. Histidine kinases are known for their ...

Measuring Protein Binding to F-actin by Co-sedimentation

מדידת חלבון מחייב F- אקטין על ידי שיתוף שקיעה

Filamentous actin (F-actin) organization within cells is regulated by a large number of actin-binding proteins that control actin nucleation, growth, ...

Measuring Biomolecular DSC Profiles with Thermolabile Ligands to Rapidly Characterize Folding and Binding Interactions

מדידת למערכות ביולוגיות DSC פרופילים עם Thermolabile ליגנדים לאפיין במהירות קיפול ואיגוד אינטראקציות

Differential scanning calorimetry (DSC) is a powerful technique for quantifying thermodynamic parameters governing biomolecular folding and binding ...

Sample Preparation for Mass Spectrometry-based Identification of RNA-binding Regions

הכנת הדוגמא לזיהוי מבוססי ספקטרומטר מסה של RNA-איגוד אזורים

Noncoding RNAs play important roles in several nuclear processes, including regulating gene expression, chromatin structure, and DNA repair. In most ...

Method for Efficient Refolding and Purification of Chemoreceptor Ligand Binding Domain

שיטת Refolding יעילה וטיהור של ליגנד Chemoreceptor מחייב תחום

Identification of natural ligands of chemoreceptors and structural studies aimed at elucidation of the molecular basis of the ligand specificity can be ...

Detection of Small GTPase Prenylation and GTP Binding Using Membrane Fractionation and  GTPase-linked Immunosorbent Assay

זיהוי של GTPase Prenylation קטן ו GTP איגוד באמצעות ממברנה Fractionation ו GTPase-מקושרים Immunosorbent Assay

The Rho GTPase family belongs to the Ras superfamily and includes approximately 20 members in humans. Rho GTPases are important in the regulation of ...

Dissipative Microgravimetry to Study the Binding Dynamics of the Phospholipid Binding Protein Annexin A2 to Solid-supported Lipid Bilayers Using a Quartz Resonator

Microgravimetry dissipative ללמוד את הדינמיקה איגוד של פוספוליפיד איגוד חלבון Annexin A2 כדי Bilayers השומנים הנתמכות על-ידי מוצק באמצעות מהוד קוורץ

The dissipative quartz crystal microbalance technique is a simple and label-free approach to measure simultaneously the mass uptake and viscoelastic ...

Extracellular Protein Microarray Technology for High Throughput Detection of Low Affinity Receptor-Ligand Interactions

חלבון חוץ-תאית הטכנולוגיה Microarray לגילוי תפוקה גבוהה של אינטראקציות קולטן-ליגנד זיקה נמוכה

Secreted factors, membrane-tethered receptors, and their interacting partners are main regulators of cellular communication and initiation of signaling ...

Production, Crystallization, and Structure Determination of the IKK-binding Domain of NEMO

הפקה, התגבשות וקביעת מבנה של התחום המחייב של ה-IKK של נמו

NEMO is a scaffolding protein which plays an essential role in the NF-&#954;B pathway by assembling the IKK-complex with the kinases IKK&#945; and ...

Measuring Nucleotide Binding to Intact, Functional Membrane Proteins in Real Time

מדידת קשירת נוקלאוטידים לחלבוני ממברנה שלמים ומתפקדים בזמן אמת

We have developed a method to measure binding of adenine nucleotides to intact, functional transmembrane receptors in a cellular or membrane environment. ...