Name: measuring g-protein-coupled receptor signaling via radio-labeled gtp binding
Uploaded: 2017-06-09T12:30:00
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この研究は、国立衛生研究所の助成金DA-000266および医療科学者養成プログラムT32助成金（CV、NWZ、およびPCS）によって支持されました。著者は、Science＆Medical Illustrationsの図書館のsomersault18：24（somersault1824.com）に感謝したいと思います。

培養細胞における組換えHA-MOR1の発現注：滅菌層流フード内のすべての細胞培養プロトコールに従ってください。 <ol><li> 70％エタノールで細胞培養層流フードを滅菌し、細胞培養全体に無菌技術を維持する。 </li><li> 2 mM L-グルタミン、1％ペニシリン/ストレプトマイシン、および10％ウシ胎仔血清（FBS）を補充したヒト胎児腎臓細胞293（HEK293）細胞培養培地、ダルベッコ?...

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	<li>Kobilka, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=G+protein+coupled+receptor+structure+and+activation.">G protein coupled receptor structure and activation.</a> Biochim. Biophys. Acta. 1768 (4), 794-807 (2007).</li><li>Neubig, R. R., Siderovski, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulators+of+G-protein+signalling+as+new+central+nervous+system+drug+targets.">Regulators of G-protein signalling as new central nervous system drug targets.</a> Nat. Rev. Drug Discov 1. (3), 187-197 (2002).</li><li>Overington, J. P., Al-Lazikani, B., Hopkins, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+many+drug+targets+are+there?.">How many drug targets are there?.</a> Nat. Rev. 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R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+[35S]GTPgammaS+binding+assay:+approaches+and+applications+in+pharmacology.">The [35S]GTPgammaS binding assay: approaches and applications in pharmacology.</a> Life Sci. 74 (4), 489-508 (2003).</li><li>Traynor, J. R., Nahorski, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+by+mu-opioid+agonists+of+guanosine-5'-O-(3-[35S]thio)triphosphate+binding+to+membranes+from+human+neuroblastoma+SH-SY5Y+cells.">Modulation by mu-opioid agonists of guanosine-5'-O-(3-[35S]thio)triphosphate binding to membranes from human neuroblastoma SH-SY5Y cells.</a> Mol. Pharmacol. 47 (4), 848-854 (1995).</li><li>Sittampalam, G. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GTP&#947;S+Binding+Assays.">GTP&#947;S Binding Assays.</a> Assay Guidance Manual. , (2004).</li><li>Strange, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+the+GTP&#947;S+([35S]GTP&#947;S+and+Eu-GTP&#947;S)+binding+assay+for+analysis+of+ligand+potency+and+efficacy+at+G+protein-coupled+receptors.">Use of the GTP&#947;S ([35S]GTP&#947;S and Eu-GTP&#947;S) binding assay for analysis of ligand potency and efficacy at G protein-coupled receptors.</a> Br. J. Pharmacol. 161 (6), 1238-1249 (2010).</li></ol>

本プロトコルは、2つの別々ではあるが補完的な方法を記載する：細胞および組織を幅広く異なる区画に分ける単純なアプローチ、および[ 35 S]GTPγS結合を測定することによってGPCRシグナル伝達を調べる手段。 効率的な細胞分画は、タンパク質の抽出および富化から、タンパク質の細胞内局在の評価、受容体薬理学の研究に至るまで、幅広い用途を有する。細胞お...

Gタンパク質共役受容体（GPCR）は、鎮痛、嗅覚および行動を含む著しい一連の生理学的過程に関与する細胞表面受容体の大きなファミリーである1 。 GPCRは、特定の外部シグナルを感知し、続いて細胞内シグナル伝達を刺激することによって作用する。したがって、それらは、細胞の外部環境と内部環境との間の鍵となる接合点である。 GPCRが生物学において果たす重要な役割のために、それらは基礎研究と創薬の両方の主要標的となっている2,3 。 別個のリガンドに結合する他の受容体ファミリーとは異なり、GPCRは非常に異なるタイプの分子に結合することができる。 1つのGPCRがペプチドと相互作用することができる一方、別のGPCRは光子、小分子またはイオンを感知することがある1,4 。それらのリガンドは多様であるが、GPCRは全体的な建築家に統一されている機能と機能。個々のGPCRは、細胞外アミノ末端および細胞内カルボキシル末端を有する7つのαヘリカル膜貫通タンパク質から構成される。 GPCRは、多様なシグナル伝達経路を媒介するα、β、およびγサブユニットからなる細胞内Gタンパク質 - ヘテロ三量体タンパク質複合体に結合する7 。 Gαサブユニットは、グアノシン二リン酸（GDP）に結合すると不活性であり、グアノシン三リン酸（GTP）に結合する場合に活性であるグアニンヌクレオチド結合タンパク質である（ 8,9） 。 GPCRがそれらのリガンドに結合するとき、GαがGβγから解離することを可能にする構造変化を受け、GαがGTPをGTPと交換することを可能にする。受容体自体は、種々のセリン/スレオンによってそのカルボキシル末端でリン酸化される受容体シグナル伝達を弱めるために内在化されている12,13,14。一方、活性化されたGαモノマーおよびGβγ二量体は、別個のシグナル伝達経路を活性化するように進行する7 。各Gタンパク質サブユニットにはいくつかのアイソフォームが存在し、各アイソフォームは特定の下流の経路および二次メッセンジャーシステムを標的とする。主要なGαアイソフォームには、G s 、G q 、G i / oおよびG 12-13が含まれる 。典型的には、個々のGPCRは特定のGαアイソフォームと会合し、それによって特定の細胞応答に外部刺激を結び付ける。 GPCR-リガンド相互作用を特徴付けることは、受容体の生物学を理解するために重要である。 GDP / GTP交換は最も初期の前夜の1つですリガンド結合に続くNts、GTP結合のモニタリングは、GPCR活性化または阻害を測定することができる。 GPCRシグナル伝達におけるより下流の事象をアッセイすることは、定量的または化学量論的ではないことが多く、完全なアゴニストを部分的なアゴニストと区別することができず、高価な試薬を必要とすることがある。さらに、Gαタンパク質へのGTP結合の増加は、GPCR活性化後のほぼ普遍的な事象であり、GTP結合の測定は、ほとんどのGPCRの活性をモニターするための広く適用可能なアッセイであることを意味する。 GTP結合の測定は、関心のある受容体または天然組織を過剰発現する細胞におけるGPCRシグナル伝達をモニターするための簡単で迅速なアプローチである。本プロトコールは、GPCRシグナル伝達に対するアゴニストおよびアンタゴニストの活性を定量的に決定するために、典型的なGPCR、μ-オピオイド受容体（MOR1）を用いた機能的GTP結合アッセイを詳述する。 このプロトコールはまず、粗膜をMOR1を過剰発現する細胞から単離する方法を概説する。注意してくださいこのプロトコールは、過剰発現系に限定されず、天然の組織または複数の受容体およびGタンパク質を発現する調製物を含む、多くの膜源に適用することができる。プロトコルは、様々な濃度の[D-Ala、N-MePhe、Gly-ol] - エンケファリン（DAMGO）またはナロキソン（MOR1アゴニストおよびアンタゴニスト）に応答して放射性GTP類似体のこれらの膜への結合を測定する方法を詳述し、それぞれ、 GTP類似体[ 35 S]グアノシン-5&#39;-O-（3-チオ）三リン酸（[ 35 S]GTPγS）は、加水分解しない。 Gαサブユニットは内因性GTPアーゼ活性を示し、加水分解可能なGTP放射化学物質上の標識されたγリン酸を除去するので、この性質は重要である。次いで膜をガラス繊維フィルター上に捕捉し、洗浄し、その後放射性標識したGTPを液体シンチレーション計数によって定量する。複数の薬理学的パラメーターを特徴づけることができるアンタゴニストのアゴニストについての半最大応答（EC 50 ）およびヒル係数（n H ）およびアンタゴニストについての半最大阻害濃度（IC 50 ）および平衡解離定数（K b ）を含む受容体 - リガンド相互作用16,17 、 18 。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1034">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:463px;">DMEM, high glucose, pyruvate, no glutamine</td>
			<td style="width:189px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td align="right" style="width:119px;">10313021</td>
			<td style="width:264px;">Warm in 37&#176;C water bath before use</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:463px;">L-glutamine</td>
			<td style="width:189px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td align="right" style="width:119px;">25030081</td>
			<td>Warm in 37&#176;C water bath before use</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:463px;">Penicillin-Streptomycin</td>
			<td style="width:189px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td align="right" style="width:119px;">15140122</td>
			<td>Warm in 37&#176;C water bath before use</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:463px;">Opti-MEM I Reduced Serum Medium</td>
			<td style="width:189px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td align="right" style="width:119px;">31985070</td>
			<td>Warm in 37&#176;C water bath before use</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:463px;">Fetal Bovine Serum</td>
			<td style="width:189px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td align="right" style="width:119px;">16000044</td>
			<td>Warm in 37&#176;C water bath before use</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:463px;">Cell culture 10-cm plate</td>
			<td style="width:189px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">CLS430167</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:463px;">Lipofectamine 3000 reagent</td>
			<td style="width:189px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">L3000-008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:463px;">1.6 mL microcentrifuge tubes</td>
			<td style="width:189px;">USA Scientific</td>
			<td style="width:119px;">1615-5500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:463px;">4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES)</td>
			<td style="width:189px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">H3375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:463px;">Tris(hydroxymethyl)aminomethane (Trizma base)</td>
			<td style="width:189px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">BP152-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:463px;">ethylene glycol-bis(&#946;-aminoethyl ether)-N,N,N&#39;,N&#39;-tetraacetic acid (EGTA)</td>
			<td style="width:189px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">E3889</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:463px;">Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)</td>
			<td style="width:189px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">E9884</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:463px;">Sucrose</td>
			<td style="width:189px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">S5016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:463px;">cOmplete ULTRA Tablets, Mini, EASYpack Protease Inhibitor Cocktail</td>
			<td style="width:189px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td align="right" style="width:119px;">2900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:463px;">DL-Dithiothreitol (DTT)</td>
			<td style="width:189px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">DO632</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:463px;">Sodium chloride (NaCl)</td>
			<td style="width:189px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">BP358-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:463px;">Magnesium chloride (MgCl2)</td>
			<td style="width:189px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">M1028-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:463px;">Pellet pestles motor</td>
			<td style="width:189px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">Z359971</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:463px;">Pestles</td>
			<td style="width:189px;">Bel Art</td>
			<td style="width:119px;">F19923-0001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:463px;">Bovine serum albumin (BSA)</td>
			<td style="width:189px;">Affymetrix</td>
			<td align="right" style="width:119px;">10857</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">[35S]guanosine-5&#8217;-O-(3-thio)triphosphate ([35S]GTP&#947;S)&#160;</td>
			<td style="width:189px;">Perkin Elmer</td>
			<td style="width:119px;">NEG030H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">non-radiolabeled guanosine-5&#8217;-O-(3-thio)triphosphate (GTP&#947;S)&#160;</td>
			<td style="width:189px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td align="right" style="width:119px;">89378</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">guanosine diphosphate (GDP)</td>
			<td style="width:189px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td align="right" style="width:119px;">51060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:463px;">Bradford reagent</td>
			<td style="width:189px;">Bio-Rad</td>
			<td align="right" style="width:119px;">5000006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:463px;">UV/VIS spectrophotometer</td>
			<td style="width:189px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:119px;">DU640</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:463px;">spectrophotometer cuvettes</td>
			<td style="width:189px;">USA Scientific</td>
			<td style="width:119px;">9090-0460</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:463px;">orbital shaker</td>
			<td style="width:189px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td align="right" style="width:119px;">2314</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:463px;">thermomixer</td>
			<td style="width:189px;">Eppendorf</td>
			<td align="right" style="width:119px;">535027903</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">glass fiber filters&#160;</td>
			<td style="width:189px;">GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td style="width:119px;">1821-021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">vacuum filtration apparatus</td>
			<td style="width:189px;">Millipore Corporation</td>
			<td style="width:119px;">XX2702550</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:463px;">desktop microcentrifuge</td>
			<td style="width:189px;">Eppendorf</td>
			<td align="right" style="width:119px;">65717</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:463px;">Scintillation counter</td>
			<td style="width:189px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:119px;">LS6500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">scintillation fluid&#160;</td>
			<td style="width:189px;">Ecoscint A</td>
			<td style="width:119px;">LS-273</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">scintillation counter vials</td>
			<td style="width:189px;">Beckman Coulter</td>
			<td align="right" style="width:119px;">592690</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">scintillation vial lids</td>
			<td style="width:189px;">Beckman Coulter</td>
			<td align="right" style="width:119px;">592928</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:463px;">Prism 6</td>
			<td style="width:189px;">GraphPad Software</td>
			<td style="width:119px;">PRISM 6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:463px;">ATP1A1 antibody</td>
			<td style="width:189px;">Developmental Studies Hybridoma</td>
			<td style="width:119px;">a6F</td>
			<td>1:1000 in 3% BSA</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:463px;">GAPDH antibody</td>
			<td style="width:189px;">EMD Millipore</td>
			<td style="width:119px;">CB1001</td>
			<td>1:5000 in 3% BSA</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:463px;">H2B antibody</td>
			<td style="width:189px;">Cell Signaling</td>
			<td style="width:119px;">2934S</td>
			<td>1:2500 in 3% BSA</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:463px;">PDI antibody</td>
			<td style="width:189px;">Cell Signaling</td>
			<td style="width:119px;">3501S</td>
			<td>1:1000 in 3% BSA</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:463px;">HA antibody</td>
			<td style="width:189px;">Roche</td>
			<td align="right" style="width:119px;">11867423001</td>
			<td>1:2000 in 3% BSA</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measuring g-protein-coupled receptor signaling via radio-labeled gtp binding

Gタンパク質共役受容体 （GPCR）は、正常な細胞生理学において重要な役割を果たす膜貫通受容体の大きなファミリーであり、鎮痛、血圧調節、および精神疾患の治療を含む複数の適応症の主要な薬理学的標的を構成する。リガンド結合に際して、GPCRは、グアノシン三リン酸（GTP）の取り込みを刺激することによって、細胞内Gタンパク質の活性化を触媒する。次いで、活性化されたGタンパク質は細胞応答を誘発するシグナル伝達経路を刺激する。 Gタンパク質の[ 35 S]グアノシン-5&#39;-O-（3-チオ）三リン酸（[ 35 S]GTPγS）の放射性標識および非加水分解性形態のG-タンパク質への取り込みを測定することによって、GPCRシグナル伝達をモニターすることができる。より下流のシグナル伝達プロセスを評価する他の方法とは異なり、[ 35 S]GTPγS結合は、GPCRシグナル伝達における近位事象を測定し、重要なことには、ts、アンタゴニスト、およびインバースアゴニストが含まれる。本プロトコールは、典型的なGPCR、μ-オピオイド受容体（MOR1）の粗膜調製物を用いて、GPCRシグナル伝達を研究するための高感度かつ特異的な方法を概説する。細胞および組織を分画する代替的なアプローチが存在するが、多くの場合、費用がかかり、退屈であり、および/または非標準的な実験装置を必要とする。本方法は、機能的な粗膜を濃縮する簡単な手順を提供する。 MOR1を単離した後、そのアゴニストである[D-Ala、N-MePhe、Gly-ol] - エンケファリン（DAMGO）、およびアンタゴニストであるナロキソンの様々な薬理学的特性を決定した。

細胞分画は、膜結合タンパク質を細胞質ゾルおよび核タンパク質から単離および濃縮するために使用することができる。 図1は、細胞下分画プロセスの間に収集され得る3つの主要な画分の内容を示すウェスタンブロットである。具体的には、 図1は、ヒストンH2Bおよびグリセルアルデヒド3-リン酸デヒドロゲナーゼ（GAPDH）?...

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Measuring G-protein-coupled Receptor Signaling via Radio-labeled GTP Binding

グアノシン三リン酸（GTP）結合は、Gタンパク質共役受容体（GPCR）活性化における最も初期の事象の1つである。このプロトコルは、放射性標識GTP類似体[ 35 S]グアノシン-5&#39;-O-（3-チオ）トリホスフェート（[ 35 S]GTPγS）の結合をモニターすることにより、特定のGPCR-リガンド相互作用を薬理学的に特徴付ける方法を説明する。目的のリガンドに対する応答。

ラジオ標識GTP結合を介したGタンパク質共役型受容体シグナルの測定

G-Protein-Coupled Receptors (GPCRs) are a large family of transmembrane receptors that play critical roles in normal cellular physiology and constitute a ...

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